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Purification de recombinants d’une protéine de l’oeuf:
l’ovalbumin-related protein X
Amélie Baron
To cite this version:
Amélie Baron. Purification de recombinants d’une protéine de l’oeuf: l’ovalbumin-related protein X. Sciences du Vivant [q-bio]. 2014. �hal-02799769�
Amélie BARON Institut National de Recherche Agronomique 2ème année DUT chimie Unité de Recherches Avicoles Année 2014 Equipe Fonction & Régulation des Protéines de l’œuf Maître de stage : Dr Sophie Réhault-Godbert
Sommaire
Avant-Propos
--- P4
I Introduction
--- P5
I.1.L’œuf et ses propriétés
--- P5
I.1.A. Généralités
--- P5
I.1.B. Formation de l’œuf
---P5
I.1.C. L’œuf, une ressource riche en protéines
--- P7
I. 2. L’ovalbumin-Related-Protein-X
--- P8
I.2.A. L’OVAX et l’Ovalbumine : deux molécules apparentées
--- P8
I.2.B. Propriétés de l’OVAX
--- P9
I.2.C. Variabilité génétique de l’OVAX et production de variants
recombinants
--- P10
II Matériels et Méthodes
--- P14
II.1. Purification des recombinants de l’OVAX
--- P14
II.1.A. Préparation préliminaire des solutions tampons
--- P14
II.1.B. Purification par chromatographie d’exclusion HR100
---P15
II.1.C. Purification par chromatographie d’échange d’anions
(Q-Sépharose)
--- P17
II.1.D. Purification par chromatographie d’affinité (héparine
II.2. Analyse par électrophorèse SDS-PAG
--- P21
II.3.Analyse par Western-Blot
--- P27
IIIRésultats / Discussion
--- P30
III.1. Purification de l’OVAX à partir du blanc
d’œuf
--- P30
III.2. Purification des clones par chromatographie
d’exclusion
--- P31
III.3. Purification par chromatographie ionique
--- P33
III.4. Purification par chromatographie d’affinité à
l’héparine
--- P36
Conclusion
--- P38
Remerciements
--- P39
Lexique
--- P40
Abréviations
---P43
Bibliographie & Sitographie
--- P44
Constantes physico-chimiques
--- P45
Phrase de Risque
--- P46
Phrase de Sécurité
--- P47
Avant-Propos
L’institut National de Recherche Agronomique, fondée en 1946, est un centre de recherche qui étudie trois domaines étroitement liés : l’alimentation, l’agriculture et l’environnement. En effet, les besoins en nourritures étant liés à la population mondiale en croissance constante, et à nos conditions de vie, il est primordial de comprendre et de trouver des solutions afin d’allier, de manière compatible et durable, la production et la protection de notre environnement.
L’INRA compte19centres de recherche répartis sur toute la France, chacun spécialisé dans des domaines divers. Le centre INRA de Tours Val de Loire a, lui, été créé en 1966. Il est réparti sur 2 sites, le site de Nouzilly et le site d’Orléans. Le site de Nouzilly comporte trois unités de recherches et trois unités expérimentales. Ses recherches portent sur l’animal, sa santé, sa biologie et la santé publique.
C’est au sein de l’Unité de Recherches Avicoles, composée de 4 équipes de recherches, rattachées aux départements de Physiologie Animale et Système d’Elevage (PHASE), et Génétique Animale que l’on retrouve l’équipe« Fonction et Régulation des Protéines de l’œuf », à laquelle j’ai été rattachée durant ma période de stage. Cette dernière s’intéresse aux propriétés de l’œuf ; Elle étudie sa composition, de la coquille au jaune d’œuf, et s’interroge sur son effet comme protecteur naturel de l’embryon et des œufs de consommation. En s’interrogeant sur cet effet, l’équipe a pu mettre en évidence la présence de nombreuses molécules antimicrobiennes. Récemment, elle a découvert la présence d’une protéine prometteuse : L’ovalbumin-related-protein-X, dite « OVAX ».
Les recherches se poursuivent à l’heure actuelle afin d’en apprendre davantage sur cette molécule. En quoi cette protéine présente des caractères d’un grand intérêt ? Comment peut-on l’isoler et la purifier ? C’est autant de questions auxquelles nous essayerons de répondre à travers ce rapport.
Premièrement, nous introduirons quelques généralités sur l’œuf et ses propriétés, et nous aborderons également le thème de l’OVAX, ainsi que de ces recombinants. Nous enchaînerons ensuite sur une deuxième partie, descriptive des différents protocoles appliqués, ainsi que des techniques analytiques auxquelles nous avons eu recourt. Enfin, nous exploiterons les résultats obtenus en détaillant la démarche scientifique suivie et enfin, nous conclurons en donnant quelques pistes d’amélioration et les perspectives de développement.
I. Introduction
I.1. L’œuf et ses propriétés
I.1.A. Généralités
A la coque, dur, sous forme de crêpe, de pâtisserie ou de bons plats améliorés, l’œuf est apprécié et consommé en quantité par les européens. Ils sont consommés, en moyenne, au nombre de 215 par Français chaque année. Ces derniers, riches en protéines, en vitamines et en minéraux, apportent à notre organisme les besoins nutritifs nécessaires à chaque repas. Il est en effet à la fois léger et riche, ce qui lui permet d’être apprécié de tous. [1 ; 2]
Historiquement déjà, l’œuf était une denrée précieuse, de parla multiplicité des recettes qui lui sont associées, mais également grâce à sa facilité de conservation. En effet, l’œuf, après le jour de ponte, peut se conserver environ 28 jours. A l’abri de l’humidité et à une température proche des 4oC, on optimise la durée de conservation de l’œuf. De plus, conserver ces œufs « tête en bas » dans son réfrigérateur limite les échanges gazeux avec le milieu extérieur. En effet, la chambre à air de l’œuf, étant la partie imposante de ce dernier et se trouvant du côté du « gros bout » de l’œuf, n’est pas comprimée et les échanges s’effectuent avec un débit moins important, d’où l’augmentation du temps de conservation. [1]
I.1.B. Formation de l’œuf
La poule, comme tout animal de type ovipare, à la faculté de pondre des œufs, et ce, avec une fréquence élevée. La formation de l’œuf commence par le jaune, qui se forme et s’accumule pendant une dizaine de jours dans l’ovaire de la poule. Le foie, joue un rôle important dans la synthèse des précurseurs du jaune d’œuf, qui sont secrétés dans la circulation sanguine, et incorporés dans les jaunes d’œufs en croissance au niveau de l’ovaire. Après synthèse, le jaune formé dans l’ovaire est ovulé dans l’oviducte de la poule.
Ce dernier est sectionné en plusieurs parties qui assurent chacune une fonction bien spécifique. L’infundibulum, permet la réception du jaune ovulé et le passage dans les autres
compartiments de l’oviducte. C’est également à ce moment que se forme la membrane vitelline, une fine membrane qui entoure le jaune. [1 ; 3]
Oviducte de la poule
Source : Presse dossier : L’œuf au trésor – mars 2013 - INRA
Après cette étape, le futur œuf migre vers le magnum, où est produit le blanc. Celui-ci sert de protection chimique à l’embryon et de réserve nutritive. L’ensemble va ensuite dans l’isthme où se forme la membrane coquillère. Enfin, la coquille externe est formée dans l’utérus de l’ovipare. L’œuf est ainsi créé et prêt à être expulser. [3]
Structure interne de l’œuf
I.1.C. L’œuf, une ressource riche en protéines
Comme nous l’avons évoqué précédemment, l’œuf, est créé pour garantir la protection et le bon développement de l’embryon, en lui apportant des vitamines, des nutriments et des protéines nécessaires à sa défense. L’œuf confère à l’embryon deux types de protection. Une protection physique, assurée par la coquille et les différentes membranes adhérentes, ainsi qu’une protection chimique, assurée par la physicochimie de l’œuf, associée à la présence de nombreuses protéines antimicrobiennes.
En effet, on retrouve près d’un millier de protéines différentes, réparties dans tous les compartiments de l’œuf, y compris la coquille, dont un quart environ est supposé œuvrer dans la destruction des bactéries pathogènes qui peuvent attaquer l’œuf. On appelle ce type de protéines des protéines antimicrobiennes. Une étude bioinformatique a permis de déterminer la présence de sites actifs, intervenant dans la destruction des bactéries dans 219 protéines de l’œuf, sur les 1174 identifiées à ce jour. Elles sont présentent dans les différentes partie de l’œuf, et sont principalement concentrées dans le blanc d’œuf.
Proportion des protéines antimicrobiennes dans l’œuf
Source : Défenses antimicrobiennes de l’œuf : de la caractérisation à l’application - équipe « œuf » URA – INRA val de loire
Le blanc d’œuf joue un rôle important dans la protection de l’embryon. Grâce à son pH alcalin et à sa viscosité, il offre une protection chimique contre les microbes, qui dans ces conditions, limite leur développement. Cependant, la physico-chimie de l’œuf n’intervient pas exclusivement dans la protection de l’embryon. Elle est couplée à l’action de protéines antimicrobiennes. La concentration et la diversité de ses dernières, jouent un rôle essentiel dans la qualité sanitaire de l’œuf. Elle représente de ce fait également une source d’antimicrobiens intéressante pour l’homme.
En favorisant la production de ces molécules dans l’œuf, la qualité des œufs serait améliorée et le risque d’intoxication alimentaire (Salmonelloses), ou d’autres maladies dues à une bactérie pathogène, serait atténué. De plus, en ayant une meilleure connaissance de ces protéines, on peut imaginer à l’avenir pouvoir les extraire, ou les synthétiser, en vue de les utiliser comme médicaments ou principe thérapeutique.
Cette protéine enzymatique à la capacité de dégrader la paroi cellulaire des bactéries.Le lysozyme fait donc un excellent conservateur dans le domaine de l’agroalimentaire, (œnologie, affinage des fromages) et constitue un excellent principe actif en Santé humaine [2 ; 4].
On retrouve également d’autres types de protéines dans le blanc, telles que les défensines. Ce sont des peptides impliqués dans la défense immunitaire chez les êtres vivants. Ils sont présents de manière innée, et agissent contre divers types d’infections et de pathogènes. Bien qu’indispensable, les défensines n’assurent pas à elle seules la défense immunitaire contre les bactéries et les virus. D’autres protéines comme les anticorps antimicrobiens sont spécifiques du pathogène auquel la poule a été exposée. L’équipe FRPO, de l’unité URA, du centre INRA de Tours, a récemment déposé un brevet sur une de ces molécules spécifiques présentes dans le blanc d’œuf : L’Ovalbumin-Related-Protein-X, qui présente des propriétés antimicrobiennes intéressantes. [2 ; 5]
L’œuf est donc une ressource aux nombreuses vertus. Ses propriétés, physiques et chimiques, lui confèrent sa qualité nutritive et technologique appréciable pour l’homme. Cependant, avant d’être un produit de consommation, l’œuf approvisionne l’embryon de protéines essentielles pour son développement et sa protection. De par son intérêt pour la défense du futur poussin, l’œuf est une ressource de protéines antimicrobiennes en grandes proportions. C’est pourquoi il fait l’objet de nombreuses recherches, afin de déterminer la spécificité de chaque molécule active contre divers pathogènes. Certaines molécules sont déjà bien connues. D’autres font l’objet de recherches au sein de l’équipe. C’est le cas de l’OVAX.
I.2.L’ovalbumin-Related-Protein-X
I.2.A.L’OVAX et l’Ovalbumine : deux molécules apparentées
Le blanc d’œuf, comme nous l’avons mentionné à plusieurs reprises, et une importante ressource en protéines. Celle dont la concentration est la plus élevée est l’Ovalbumine. Elle est présente à raison de 54 % [2 ; 6 ; 7]
Pourcentage des protéines présentes dans le blanc d’œuf
Protéine %
Ovalbumine 54
Ovotransferrine 12
Lysozyme 3,4
Bien qu’en concentration importante, nous ignorons encore beaucoup de choses sur l’ovalbumine et son rôle dans l’œuf. Il est admis qu’elle servirait de nutriment pour l’embryon en croissance. L’Ovalbumine possède deux protéines apparentées : L’Ovalbumin-related Protein X et l’Ovalbumin-L’Ovalbumin-related protein Y (OVAY). Les gènes correspondant aux trois protéines proviennent du même gène ancestral et ont été obtenus par duplication de ce même gène. Les trois gènes de l’ovalbumine, de l’OVAX et de l’OVAY sont présents en tandem sur le chromosome 2 du génome de la poule. Leur séquences en nucléotides sont très proches mais la duplication a généré des mutations responsables de modifications de plusieurs nucléotides, ce qui a entraîné une modification de la traduction du gène en acides aminées, et donc des séquences protéiques différentes de la protéine initiale. Ainsi, le gène précurseur de la synthèse de l’ovalbumine a généré la création de trois protéines dérivées, au fur et à mesure de l’évolution : l’ovalbumine ancestrale, l’OVAX et l’OVAY.
I.2.B. Propriétés de l’OVAX
L’OVAX a fait l’objet de recherches approfondies par l’équipe FRPO. C’est cette dernière qui a, pour la première fois, caractérisé des propriétés physicochimiques et l’activité antimicrobienne de cette protéine. L’équipe a comparé cette molécule avec sa parente, l’ovalbumine. Contrairement à l’Ovalbumine, l’OVAX est capable de se lier avec l’héparine, un sucre chargé négativement contenu dans les tissus conjonctifs, et aux propriétés anticoagulantes remarquables.
Structure de l’héparine
Source : http://www-lemm.univ-lille1.fr/biologie/biochim/co/ch4_10_11.html
Cette propriété de se fixer à des composés ou surfaces chargées négativement, suggérait que cette protéine pouvait interagir avec les parois chargées négativement de pathogènes comme les bactéries.
L’analyse bioinformatique de cette molécule, la caractérisation structurale et l’expérimentation, ont confirmé cette hypothèse. L’OVAX contient un site actif, le site de liaison à l’héparine, au sein de sa structure, ayant la faculté d’agir contre Listeria
monocytogene set Salmonella Enteritidis. Listeria est une bactérie pathogène, qui peut se
développer sur des produits alimentaires tels que les charcuteries ou les fromages au lait cru. Elle peut être notamment à l’origine d’infections alimentaires bénignes, ou au
contraire, à plus amples conséquences sur les personnes fragiles, telles que les personnes âgées ou les femmes enceintes. [7 ; 8].
Salmonella Entetiritis est la seule bactérie pathogène capable de se développer dans
l’œuf et à ce titre, elle est responsable d’intoxications alimentaires (Salmonellose) chez les consommateurs d’œufs ou de produits d’œuf à l’état cru (mayonnaise, œuf au plat, mousse au chocolat).
Bien que présente naturellement dans l’œuf, l’OVAX seul n’agit pas contre le développement de la souche bactérienne. Plusieurs projets menés par l’équipe ont permis de montrer que l’activité de l’OVAX perdure, contre les attaques microbiennes, lorsque
l’œuf est conservé à 4Oc (température de conservation recommandée pour l’œuf de table).
L’activité antimicrobienne globale, à cette température, est stable au cours du temps. De plus, à cette température, la molécule conserve ces propriétés structurales et physicochimiques. C’est pourquoi nous avons effectuée chaque manipulation à basse température afin d’optimiser la conservation de notre protéine d’intérêt, et ainsi, garantir une fiabilité des résultats.
La purification de l’OVAX à partir du blanc d’œuf s’effectue à partir d’un pool de blancs d’œufs provenant de poules différentes. Cependant, malgré les conditions optimales de température dans lesquelles l’équipe a travaillé, elle a pu s’apercevoir que l’activité antimicrobienne de l’OVAX purifiée variait d’un lot à l’autre. L’équipe a montré, après plusieurs expérimentations et discussion, qu’il existait au moins trois variants naturels de la protéine OVAX qui pourraient présenter des activités antimicrobiennes différentes, ce qui pourrait expliquer la variation d’activité antimicrobienne d’un lot à l’autre.
I.2.C. Variabilité génétique de l’OVAX et production de
variants recombinants
La diversité de cette activité antimicrobienne, pour cette protéine, découle de nouveau, de la génétique. En effet, il existe plusieurs types d’OVAX au sein d’un même pool de blancs d’œufs. Ces différentes versions sont synthétisées par un même gène. Les gènes sont divisés en exons (séquences codantes), séparés par des introns (séquences non codantes). Les protéines sont le produit des exons assemblés. Les variants résultent soit de mutations ponctuelles chez certaines poules soit de l’excision d’un ou de plusieurs exons.
Séquences protéiques des trois variants de l’OVAX (Clone21=variant1), (Clone22=variant2), (Clone34=variant 3)
Cela entraîne une variation de la structure, ou de l’action de la protéine, ce qui peut l’inhiber, mais aussi lui conférer une nouvelle activité. Ainsi, l’action antimicrobienne peut en être altérée ou renforcée. L’équipe s’intéresse donc à ces différents variants de l’OVAX. L’idée est de les étudier chacun de manière indépendante, dans le but d’en apprendre davantage sur leurs activités, leurs modes d’action, leurs différences, et la prévalence et la proportion de ces différentes formes chez les poules. L’équipe a identifié trois variants naturels de l’OVAX. Deux présentent une mutation ponctuelle, qui modifie un acide aminé, et le troisième présente un exon supplémentaire. [3]
L’équipe a mis en place un protocole permettant l’extraction de l’OVAX à partir d’un pool de blanc d’œufs. Néanmoins, cette méthode n’est pas sélective, on obtient un échantillon comprenant les différents variants, et leur purification indépendante à partir de cet échantillon est difficile. Cela est du à leurs propriétés physicochimiques extrêmement
proches. Ainsi, pour étudier les différentes caractéristiques des OVAXs, de manière précise, il faut avoir recourt à une autre technique : la technique des protéines recombinantes.
Caractéristiques biochimiques des trois variants. aa, acides aminés ; PM, poids moléculaire ; pI, point isoélectrique.
Clones Nbre d’aa PM (kDa) pI Variant 1 (Clone21) 397 44,9 5,85 Variant 2 (Clone 22) 402 45,4 6,29 Variant 3 (Clone34) 397 44,8 5,98
Un gène codant une protéine d'intérêt (ici les trois séquences nucléotidiques correspondant aux trois variants de l’OVAX) est introduit dans le génome de l'espèce productrice (dans notre modèle, une bactérie). Les protéines recombinantes peuvent être ainsi purifiées et utilisées dans d’autres cas, à des fins thérapeutiques, industrielles ou bien encore dans les activités de recherche.
Cette méthode consiste à additionner une partie de l’ARN messager, c'est-à-dire, le transcrit d’un gène, à une bactérie. Ici, pour le développement des OVAXS recombinantes, on additionne l’ARN messager, responsable de la synthèse des trois OVAX dans trois plasmides, contenant une résistance à un antibiotique, mais aussi un gène exprimant une galactosidase. Ces trois transcrits de l’OVAX ont été obtenus à partir des transcrits du magnum de la poule, et ont été insérés dans le gène plasmidique codant la galactosidase, ce qui détruit l’activité galactosidase. Chaque plasmide est mis en contact avec les bactéries dont la paroi a été perméabilisée et qui, en utilisant son mécanisme cellulaire, va exprimer et synthétiser les protéines correspondantes : dans notre cas, les trois variants de l’OVAX.
Les bactéries sont ensuite placées en présence de l’antibiotique. Ainsi, seules celles qui auront intégré le plasmide conférant une résistance à l’antibiotique pourront former des colonies. Les bactéries sont également mises en présence de X-Gal, un composé qui, lorsqu’il est clivé par la galactosidase, vire au bleu.
Plusieurs cas peuvent ainsi se présenter
- Le plasmide ne contient pas l’ARN de l’OVAX donc le gène plasmidique de la galactosidase n’est pas altéré: on obtient alors une colonie de bactéries bleues, après croissance, sans assimilation du gène de l’OVAX.
- Le plasmide intègre l’ARN cible, donc le gène plasmidique de la galactosidase est altéré: On obtient alors une colonie de bactéries blanches que l’on peut étudier - L’ARN se circularise sur lui-même: Dans ce cas, il n’y a pas de colonies. En effet, le
plasmide ne s’intègre pas àla bactérie. Ces dernières sont alors inhibées sous l’effet de l’antibiotique.
Mécanisme d’intégration de l’ARN messager sur un plasmide Source ; Inra ; Equipe FRPO, présentation PowerPoint projet de stage
Par l’intermédiaire de cette méthode, on a pu intégrer à chaque plasmide les ARN correspondant aux trois variants identifiés. Ainsi, chaque colonie sera représentative d’un variant de l’OVAX particulier. Les colonies de bactéries sont éclatées, et centrifugées. On récupère le surnageant, contenant notre protéine d’intérêt, mais contaminée par d’autres protéines issues de la bactérie. Ainsi, afin d’étudier l’activité antimicrobienne de chaque variant naturels de l’OVAX, nous appliquerons diverses étapes de purification. La purification et la caractérisation du clone 21 (variant 1), 22 (variant 2) et 34 (variant 3) correspondant respectivement aux colonies 21, 22 et 34, font l’objet de ce rapport et furent la ligne directrice de ce stage.
IIMatériels et Méthodes
La purification des différents clones nécessite de nombreuses étapes, comme de nombreuses préparations d’échantillons et de suivis analytiques. C’est pourquoi nous aborderons chaque étape de la purification, de manière indépendante. Nous développerons pour chaque technique employée son intérêt, son mode opératoire ainsi que son appareillage.
II.1. Purification des recombinants de l’OVAX
II.1.A. Préparation préliminaire des solutions tampons
Les différentes étapes de purification s’effectuent par chromatographies préparatives. Pour le bon fonctionnement des manipulations, et pour l’optimisation des résultats, il est important de travailler avec une phase mobile qui permet la meilleure rétention des analytes. De plus, certaines molécules nécessitent de travailler en milieu ionique, ou tamponné. Les phases mobiles sont donc préparées et tamponnées par nos soins.
Pour les différentes étapes de purifications, il nous faut : - Une phase mobile Tris-HCl 50 mM ; pH = 8,5
- Une phase mobile Tris HCl 50 mM / NaCl 1 M ; pH = 8,5 Mode opératoire
Préparation d’une solution mère Tris-HCl 500 mM ; pH = 8,5
Préparer au préalable 1 L de solution mère Tris-HCl 500 mM ; pH = 8,5. Le Tris est un solide de masse molaire 121,14 mol/g. L’acide chlorhydrique n’intervient que pour tamponner la solution.
On a :
nTris= CTrisX VTris
mTris/ MTris= CTrisX VTris
mTris = VTrisXCTrisX MTris mTris= 1 X 0,5 X 121,14
mTris=60,6 g
Peser et dissoudre 60,6 g de Tris avec de l’eau distillée puis compléter jusqu’au 2/3. Ajuster le pH avec HCl concentré jusqu’à stabilisation de la valeur à pH = 8,5
Compléter jusqu’au trait de jauge. Boucher puis homogénéiser à l’aide d’un barreau aimanté.
Préparation de la solution fille Tris-HCl50 mM ; pH = 8,5
Prélever 200 mL de la solution mère. Introduire dans une fiole jaugée de 2 L
Compléter à l’eau distillée jusqu’au trait de jauge. Boucher puis homogénéiser.
Préparation de la solution Tris-HCl50 mM / NaCl 1 M ; pH = 8,5
On prépare un litre de solution tamponnée soit mNaCl = MNaCl = 58,44 g
Peser 58,44 g de NaCl
Dissoudre dans 100 mL de solution la solution mère Tris-HCl 500 mM, pH 8,5 Compléter jusqu’au trait de jauge de 1 L avec de l’eau distillée. Homogénéiser.
Remarques : Le NaCl étant un sel neutre, on négligera les variations de pH dues à la dissolution du sel NaCl au contact du Tris.
II.2.B. Purification par chromatographie d’exclusion HR100
Pour chaque clone d’étude, soit le clone 21, 22, et 34, on réalise une étape de purification sur une colonne d’exclusion Sephacryl S-100 HR qui permet une séparation des protéines en fonction de leur poids moléculaires sur une gamme allant de 1000 à 100 000 Da. Les trois variants 1, 2 et 3 de l’OVAX ont des poids moléculaires de 44,9 kDa, 45,4 kDa et 44,8 kDa, respectivement.
Principe
La chromatographie d’exclusion, ou par filtration sur gel, est une technique chromatographique permettant de séparer les molécules, en fonction de leurs poids moléculaires. En biologie, l’appellation « filtration sur gel » est employée plus couramment que la notion de « perméation sur gel », car les phases mobiles sont de type aqueuse. [9]
La colonne chromatographique est remplie d’un gel, souvent de nature polymérique, constituée de plusieurs pores permettant la rétention des analystes. Plus les pores sont importants et plus on peut séparer des molécules de masse molaires importantes. Le gel se gonfle et joue son rôle de phase stationnaire lorsque celui-ci est traversé par la phase mobile. [9]
L’activité de la colonne chromatographique ne s’effectue que sur un domaine de linéarité précis. En effet, si une molécule est trop grosse, cette dernière n’est pas retenue par le gel, et sort donc en premier : C’est le volume d’exclusion totale.
Si la molécule est très petite par rapport au diamètre des pores du gel, elle a accès à tous les interstices, et sera donc très retenue. C’est le volume de perméation totale. Le domaine de travail pour une filtration sur gel est donc comprise entre ces deux valeurs clés, afin d’optimiser la séparation des composées. [9]
Appareillage
Le système chromatographique est constitué de plusieurs éléments. La colonne est une colonne de filtration Sephacryl S-100 HR (GE Healthcare), composée d’un gel polymérique. Elle est équipée en entrée d’un système de filtration sur frité, permettant de protéger la colonne. La colonne est reliée à plusieurs pompes permettant de délivrer la phase mobile. La phase mobile, pour cette chromatographie, est 100 % Tris-HCl 50 mM ; pH = 8,5. Elle est en parallèle reliée à une boucle d’injection de 2600 µL.
Le détecteur utilisé est un détecteur UV réglé à deux longueurs d’onde, 220 et 280 nm. La première longueur d’onde est destinée à mesurer l’absorbance des liaisons peptidiques des protéines. La seconde sert à déterminer l’absorbance des groupements chromophores (phénylalanine, tyrosine, tryptophane)des protéines. L’ensemble de l’appareillage est relié à un système d’acquisition, comportant un boitier de compatibilité, coordonnant les différents éléments. Le tout est piloté par le logiciel Chroméleon (Dionex).
Associer en parallèle les techniques d’exclusion sur gel, à la chromatographie préparative, a plusieurs intérêts. D’une part, la chromatographie d’exclusion permet de séparer les analytes en fonctions de leur masse, ce qui découpe l’échantillon injecté en plusieurs fractions. D’autre part, la détection UV permet de visualiser en temps réel la sortie des analytes de la colonne, ce qui permet de les collecter.
Mode opératoire
Avant toute injection, laver la colonne par circulation d’eau distillée et l’équilibrer avec le tampon Tris-HCl 50 mM ; pH = 8,5. Pour cela, faire circuler la phase mobile à un débit de 0,8 mL.min-1 (des débits plus élevés pouvant altérer la colonne qui est limitée par une pression maximale).
Filtrer le surnageant du clone d’intérêt sur une unité de filtration de 0,22 µM (Millipore) afin d’éliminer bactéries et débris de bactéries.
Faire un empotage sur une durée de 5 minutes pendant la phase de nettoyage afin de vérifier la cohérence du débit délivré par la pompe, par rapport à la commande ordonnée.
Injecter 2600 µL de la solution filtrée, et lancer l’acquisition selon la méthode HR100 (acquisition de 3 heures).
Collecter une première fraction de 40 à 60 minutes.
Collecter la fraction suivante de 60 à 90 minutes dans un autre tube. Terminer l’acquisition.
Rincer la colonne avec la phase mobile durant la nuit, avant l’injection d’un autre clone. Le débit est abaissé à 0,2 mL.min-1pour cette étape.
Concentrer les différentes fractions par centrifugation en utilisant des cellules de concentration dont le cutoff est de 3 kDa (Millipore). Cela permet de réduire le volume de chaque échantillon tout en concentrant les protéines pour une injection dans une boucle de 500 µL pour les étapes de purifications suivantes.
II.1.C. Purification par Chromatographie d’échange d’anions
(Q-Sépharose)
L’intérêt de purifier par chromatographie d’affinité ionique est d’éliminer de la matrice, les espèces n’ayant pas ou peu d’affinité avec la phase stationnaire utilisée. Cette étape de purification sera réalisée sur les fractions recueillies, lors de la chromatographie d’exclusion, des clones 21, 22 et 34 de l’OVAX. Les trois variants ont des points isoélectriques inférieurs à 6,3. L’utilisation d’un tampon à pH 8,5 imposera une charge nette négative pour les trois
cationique). L’échangeuse cationique choisie ici est la Q-Sepharose. Elle se compose de billes d’agarose couplées à des ammoniums quaternaires.
Principe
La chromatographie d’affinité ionique est basée sur la séparation des ions. Elle fonctionne selon le même principe qu’une chromatographie liquide. Cependant, la colonne chromatographique est remplie d’une résine échangeuse d’ions. Elle est anionique ou cationique selon sa pertinence, vis-à-vis des molécules étudiées. [10]
La colonne est toujours remplie d’une phase mobile, chargée en ions opposés à celle de la résine, ce qui assurent l’électroneutralité. Ces ions de charges opposées sont appelés « ion développeur ». [10 ; 11]
La séparation et la rétention des analytes sont dues aux interactions de ces derniers avec la résine. Les ions de même nature que la résine seront repoussés et sortiront au temps de rétention nulle. Les analytes de signes opposés à celui de la colonne vont rentrer en compétitions avec les ions développeurs et vont éluer plus ou moins rapidement. Plus un ionest gros et plus ce dernier sera retenu par la résine. Plus un ion est chargé et plus son affinité avec la résine sera élevée. [10]
Appareillage
Le dispositif chromatographique se compose d’une colonne à résine cationique, de type Q-Sepharose de 5 mL (Fischer Scientific). Elle est précédée à son entrée d’un système de filtration sur frité, lui assurant une protection contre les impuretés. Elle est reliée à un réseau de pompes péristaltiques délivrant la phase mobile. La phase mobile utilisée ici est du Tris-HCl 50 mM ; pH = 8.5, auquel on couplera du Tris-HCl 50 mM ; NaCl 1 M ; pH = 8,5 pour réaliser un gradient, qui permettra de décrocher les protéines fixées. En parallèle, on retrouve une boucle d’injection de 500 µL. Le système de détection et d’acquisition est le même que celui utilisé lors de la chromatographie d’exclusion.
Le gradient utilisé est le suivant :
- De 0 à 10 min : 100 % Tris-HCl 50 mM ; pH = 8,5
- De 10 à 40 min : Gradient linéaire jusqu’à 100 % Tris-HCl 50 mM ; NaCl 1 M ; pH = 8,5
- 40 à 45 min : 100 % Tris-HCl 50 mM ; NaCl 1 M ; pH = 8,5 - 45 à 60 min : 100 % Tris-HCl 50 mM ; pH = 8,5
Mode Opératoire
Effectuer une acquisition à blanc afin d’évaluer la linéarité du signal émis par le détecteur. Utiliser la méthode correspondant à un gradient linéaire de 0 à 1M NaCl comme décrite ci-suivant
Injecter la fraction concentrée à l’étape précédente. Collecter la fraction de rétention nulle.
Collecter les fractions d’intérêts.
Effectuer un « run » à blanc afin de nettoyer la colonne avant l’injection suivante.
Diluer les fractions obtenues au 1/5 dans du tampon Tris-HCl 50 mM ; pH = 8,5 pour diluer les sels
Concentrer les échantillons par centrifugation à un volume de 500 µL.
Centrifugeuse et tube Falcon de concentration – Unité URA – Inra centre de Nouzilly
II.1.D. Purification par Chromatographie d’affinité (Héparine
Sépharose)
Les purifications préliminaires ont permis d’éliminer de la matrice bon nombre de composés. Finaliser la purification sur Héparine Sepharose permet de sélectionner, dans notre fraction terminale, les molécules susceptibles de se lier à l’héparine et présentant donc un domaine spécifique de liaison à cette dernière. Cette technique particulière est
donc une méthode plus sélective dans la purification de l’OVAX, qui est une protéine présentant une affinité pour cette dernière.
Principe
La chromatographie par affinité avec l’héparine, est basée sur la séparation des protéines en fonction de leur charge. Elle fonctionne selon le même principe qu’une chromatographie de type ionique. L’héparine, chargée négativement, va agir comme une résine anionique. Elle va interagir avec toutes les molécules portant un domaine de liaison spécifique à l’héparine.
L’éléctroneutralité est assurée par un ion de charge opposé appelé « ion développeur ». Il est contenu dans la phase, circulant sans interruption dans la colonne. L’ion développeur est donc un cation contenu dans une phase mobile bien souvent tamponnée par un sel.
Cependant, l’héparine est plus sélective. Cela confère à la colonne chromatographique une spécificité non négligeable. Ainsi, les biologistes peuvent réaliser des analyses ou des purifications avec une meilleure résolution et sélectionner des molécules d’intérêt, en fonction de leurs affinités biologiques.
Appareillage
Le dispositif de travail est composé d’une colonne chromatographique Hi-Trapheparin-sepharose de 1 mL (GE Healthcare). Cette dernière est munie d’un système de filtration sur frité en amont, qui la protège des impuretés pouvant altérer son fonctionnement. Le système de détection et d’acquisition est le même que pour les précédentes chromatographies. La phase mobile utilisée dans un premier temps est le tampon Tris-HCl 50 mM ; pH = 8,5. Puis, on réalise le gradient suivant :
- De 0 à 10 min : 100 % Tris-HCl 50 mM ; pH = 8,5
- De 10 à 40 min : Gradient linéaire jusqu’à 100 % Tris-HCl 50 mM ; NaCl 1 M ; pH = 8,5
- 40 à 45 min : 100 % Tris-HCl 50 mM ; NaCl 1 M ; pH = 8,5 - 45 à 60 min : 100 % Tris-HCl 50 mM ; pH = 8,5
Mode Opératoire
Avant toute injection, il est important de nettoyer et d’équilibrer la colonne chromatographique avec le tampon Tris-HCl 50 mM ; pH = 8,5.
Effectuer un « run » à blanc afin de vérifier la linéarité du signal avec la méthode énoncé ci-après.
Collecter le pic de rétention nulle.
Collecter chaque fraction indépendamment.
Effectuer un « run » à blanc pour nettoyer la colonne avant l’injection suivante. Concentrer les échantillons.
II.2Analyse par électrophorèse SDS-PAGE
Lors de la purification des trois clones d’étude, nous avons eu recourt fréquemment à l’analyse SDS-PAGE. Cette technique nous a permis d’analyser le profil protéique de chaque fraction collectée. L’utilisation d’un étalon composé de protéines de poids moléculaire connu permet, en outre, d’estimer le poids moléculaire des protéines contenues dans chaque fraction. Le poids moléculaire de l’OVAX recombinante étant d’environ 40 kDa, nous avons pu ainsi, par cette technique, identifier les fractions susceptibles de contenir de l’OVAX. Cela a permis d’analyser les résultats délivrés par les chromatogrammes, et nos hypothèses.
Principe
L’acronyme SDS PAGE est tiré de l’appellation anglo-saxonne Sodium Dodecylsulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis. Elle est basée sur la migration des molécules sous l’action d’un champ électrique. Les protéines sont plus ou moins chargées en fonction de leur composition en acides aminés. La technique SDS-PAGE, consiste à s’affranchir des différences de charge entre les protéines, pour que la migration dans le gel de polyacrylamide se fasse principalement en fonction du poids moléculaire de celles-ci. Ainsi la migration s’effectue en fonction de la réticulation du gel. [15]
Le SDS est une micelle amplement chargé négativement à son extrémité, et lipophile en son centre. Elle entoure donc les protéines, hydrophobe, d’une couche électronique négative. Ainsi, l’électroactivité devient identique pour chaque protéine. Grâce à cet ajout, la rétention, dépend donc uniquement de la masse des molécules.[16]
Formule du SDS
Le gel se découpe en deux parties. Une partie inférieure, d’environ 5 mL, appelée gel de résolution. Ce premier compartiment a une réticulation importante. C’est cette partie du
gel qui va permettre la migration et la séparation des protéines en fonction de leurs poids moléculaire. Une molécule sera d’autant plus retenue par le gel qu’elle sera de masse moléculaire élevée.
La deuxième partie du gel est la partie supérieure. Elle est d’environ 1,5 mm et possède un taux de réticulation plus faible. Ce gel est appelé gel de concentration. Il permet aux analytes de migrer sur une même ligne de front jusqu’au gel de résolution. On y incorporedes « puits » qui permettront le dépôt des échantillons.[15]
Représentation d’un gel SDS-PAGE et de ces différentes parties Source : http://www.di.uq.edu.au/sparqSDSPAGE
Polymérisation du gel
Le gel de polyacrylamide, est réalisé en laboratoire par nos soins, à partir d’une solution d’acrylamide-bis-acrylamide. Un polymère est constitué de nombreux motifs identiques, enchaînés les uns aux autres de manière régulière. Ces unités moléculaires sont appelées monomères. L’enchaînement de ces monomères constitue une chaîne moléculaire de grande ampleur, c’est pourquoi les polymères sont nommés macromolécules. [12 ; 13 ; 14]
La polymérisation des monomères est régie par un mécanisme complexe, qui dépend de la nature des monomères. Elle s’effectue par étape, lorsque les monomères présentent des groupements fonctionnels réactifs entre eux. C’est le cas par exemple d’une fonction alcool et acide, qui peuvent former des polyesters en réagissant les uns avec les autres. La synthèse peut également s’effectuer selon une réaction en chaîne, où, dans ce cas, les monomères mis en jeu possèdent des doubles ou triples liaisons. C’est le cas de l’acrylamide. [12 ; 13]
Formule de l’acrylamide
La polymérisation en chaîne s’effectue en trois étapes : une étape d’amorçage, une étape de propagation et une étape de terminaison. Il existe plusieurs formes de polymérisation en chaîne où l’on retrouve ces trois mêmes étapes à chaque fois. L’acrylamide polymérise selon un mécanisme radicalaire.
A Etape d’amorçage
L’amorçage d’une polymérisation en chaîne par mécanisme radicalaire s’effectue par l’intermédiaire d’une espèce peu stable, ou susceptible de réagir avec un autre composé pour former une espèce radicalaire. L’espèce en question se dégrade sous l’effet de la chaleur, d’un rayonnement lumineux, ou par l’action d’une espèce oxydante pour donner une nouvelle espèce homolytique. On appelle ces composés des amorceurs. [12 ; 18 ; 19]
L’amorceur pour la polymérisation de l’acrylamide, est le persulfate d’ammonium, il se décompose en milieu électronique de la manière suivante :
S2O82-+ e-= SO4-*
Cette réaction de radicalisation est catalysée par le TEMED. Une fois le radical formé, il se fixe sur un monomère présent dans le milieu réactionnel, ici, l’acrylamide, pour former un nouveau radical, selon la réaction suivante :
B Etape de propagation
L’étape de propagation permet l’addition du radical sur un monomère du milieu réactionnel, dans notre cas, l’acrylamide. Cela a pour but de faire croitre la chaîne polymérique. Cette propagation s’effectue de la manière suivante :
L’étape se répète ainsi n fois jusqu’à obtenir une chaîne macromoléculaire. La taille de cette dernière dépend de la nature de l’espèce radicalaire créée dans le milieu, ainsi que de sa concentration. Cependant, le temps de réaction n’as pas d’impact sur la longueur de la chaîne. Cette caractéristique n’influe que sur le rendement de la synthèse. [12 ; 18]
C Etape de terminaison
L’étape de terminaison permet de rétablir la neutralité de la molécule et ainsi, de terminer la croissance de la chaîne. Elle s’effectue bien souvent par recombinaison de deux espèces radicalaires, ou par dismutation. Le polyacrylamide formé s’écrit de la forme suivante :
Il est important de noter que la nature des groupements, logés aux extrémités du polymère, n’influent pas sur la nature de ce dernier. En effet, empiriquement, on a montré que les propriétés d’un polymère dépendent seulement de sa structure à motifs répétés, qui constituent les parties principales de la molécule. [12 ; 18]
Appareillage
Le gel de polyacrylamide, est coulé entre deux fines plaques de verres. Ces dernières sont espacée d’un vide d’épaisseur 1 mm, permettant d’accueillir le gel. Les plaques sont fixée sur un support, et posées sur un joint, afin d’assurer l’étanchéité du système.
Après coulage du gel, et « solidification », les plaques sont retirées du support et placées dans une cuve électrophorétique, baignée de tampon (Tris-HCl 25 mM, Glycine 192 mM, SDS 0,1 %, pH 8,3). Cette dernière est reliée à un générateur de tension.
Appareillage et accessoires nécessaires à la réalisation d’un gel SDS-PAGE
Mode opératoire
Installation du dispositif de travail et préparation du gel de polyacrylamide
Placer la plaque inférieure et la plaque supérieure l’une contre l’autre.
Insérer l’ensemble dans le guide prévu à cet effet, et maintenir le tout en refermant les clapets.
Insérer l’ensemble sur le support de gel, préalablement recouvert d’un joint.
ATTENTION : la synthèse et le coulage du gel doit s’effectuer sous hotte
Pour réaliser le gel de polyacrylamide, on introduit les réactifs dans l’ordre suivant : - Eau - Tampon Tris HCl 1.5 M ; pH 8.8 - Acrylamide-bisacrylamide 37,5 :1 30 % - SDS 10 % - APS 10 % - TEMED
Il est important d’introduire le TEMED en dernier, car celui-ci catalyse la polymérisation. Selon la réticulation du gel de résolution, on introduit différentes quantités de réactifs. Les proportions sont indiquées dans le tableau ci-dessous selon le pourcentage de réticulation souhaité.
Proportion des réactif nécessaires lors de la synthèse du polyacrylamide – gel de résolution
Quantité par nombre de gel souhaitée en mL
Réactif introduit
1 gel
2 gels
10%
12,5%
15%
10%
12,5%
15%
Eau
1,975
1,545
1,145
3,96
3,13
2,29
Tris HCl 1,5 M, pH 8,8
1,25
1,25
1,25
2,5
2,5
2,5
Acrylamide-bis-acrylamide 30 %
1,67
2,1
2,5
3,33
4,16
5
SDS 10 %
0,05
0,05
0,05
0,1
0,1
0,1
APS 10%
0,05
0,05
0,05
0,1
0,1
0,1
Temed
0,005
0,005
0,005
0,01
0,01
0,01
Volume total
5
5
5
10
10
10
Pour le gel de concentration, la résolution est la même pour n’importe queltype d’analyse SDS-PAGE. On réalise la préparation de volume pour 2 gels, afin d’avoir des prélèvements de volumes plus précis.
Proportion des réactif nécessaire lors de la synthèse du polyacrylamide – gel de concentration
Quantité pour 2 gels en mL
% final
d’acrylamide/bis-acrylamide
4%
Eau
1,79
Tris HCl 0,5 M, pH 6.,8
0,75
Acrylamide 30 %
0,4
SDS 10 %
0,03
APS 10%
0,03
Temed
0,0025
Volume total
3
Après introduction du TEMED, couler 4 mL du gel de résolution entre les deux plaques de verres,
Laisser polymériser
Introduire le gel de concentration Poser le peigne afin de former les puits Laisser polymériser
Les échantillons sont dissous avec du tampon échantillon composé de Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8, glycérol, de SDS 10 %, et de bleu de bromophénol, avec, ou sans beta-mercaptoéthanol (agent réducteur). Le glycérol permet d’augmenter la densité des échantillons et de faciliter leur dépôt dans les puits. Le bleu de bromophénol, en formant un front de migration (ligne bleue) permet de suivre la migration des échantillons dans le gel. La migration est stoppée lorsque le front de migration arrive en bas du gel.
Déposer les échantillons et déposer l’étalon de poids moléculaire. Laisser migrer jusqu’au gel de concentration à 80 V
Augmenter la tension à 120 V une fois les analytes à l’interface des deux gels.
Laisser migrer jusqu’au bas du gel, tout en évitant que le front de migration dépasse ce dernier.
Retirer les plaques de la cuve, rincer à l’eau distillée, retirer la plaque supérieure et rincer de nouveau à l’eau distillée.
Introduire le gel dans un récipient contenant du bleu de Coomassie et laisser agiter une demi-heure.
Réitérer l’opération avec du décolorant constitué de 40 % d’éthanol, 10 % d’acide acétique afin d’enlever l’excédent de colorant.
Laisser le gel dans l’eau distillée.
II.3. Analyse par Western-Blot
Lors de nos différentes étapes de purifications des trois clones, nous avons été amenées à vérifier de manière précise si nos échantillons contenaient ou non de l’OVAX. En effet, l’analyse par SDS-PAGE nous permet d’identifier la présence de molécules de la taille de l’OVAX (environ 40 kDa) dans les fractions collectées. Cependant de nombreuses protéines endogènes d’origine bactérienne peuvent également posséder une taille de même masse molaire apparente. La technique du Western-Blot qui utilise des anticorps dirigés spécifiquement contre l’ovalbumine et ses dérivés (OVAX, OVAY), permet d’avoir une information plus précise sur la présence ou non de l’OVAX dans les échantillons collectés.
Principe
L’analyse Western-Blot est une technique permettant de mettre en évidence la présence de protéines au sein d’un échantillon, et de les quantifier. Cette technique est basée sur la reconnaissance des protéines d’intérêt par des anticorps spécifiques de celles-ci, ce qui la rend plus spécifique. Elle s’effectue en deux temps. [17]
Premièrement, les protéines de l’échantillon sont migrées sur un gel SDS-PAGE afin de les séparer. Dans un second temps, les protéines sont transférées du gel vers une membrane de nitrocellulose, sous l’action d’un courant électrique. [17]
Une fois le transfert effectué, les protéines peuvent être soumises à différentes conditions opératoires, où l’on met au contact de la membrane le ou les anticorps spécifiques des protéines que l’on souhaite analyser ou quantifier. [17]
Appareillage
La migration des protéines pour le Western-Blot requiert le même appareillage que pour un SDS-PAGE classique.
Le transfert des protéines après migration s’exécute dans les mêmes cuves, sur une membrane de nitrocellulose, tel que décrit dans le mode opératoire ci-après. On effectue les différentes étapes d’agitation et de maintien à température de la membrane de nitrocellulose à l’aide d’une plaque d’agitation et d’un incubateur. Certaines étapes sont conduites dans l’obscurité ou en présence d’une lumière rouge pour préserver le deuxième anticorps, ce dernier étant couplé à un fluorophore, photosensible.
Mode Opératoire
ATTENTION : la synthèse, le coulage du gel, et le transfert s’effectue sous hotte
Faire migrer les protéines des échantillons sur gel SDS-PAGE.
Préparer une solution de transfert contenant 100 mL de 10X (Tris-Glycine), 700 mL d’eau et 200 mL de méthanol.
Tremper les gels et les membranes de nitrocellulose dans la solution de transfert. Monter le dispositif de transfert et mettre la membrane à 4oC sous un champ électrique, 100 V pendant 1 h.
Tremper la membrane dans une solution de blocage (30mL TBS, 3g lait) pendant une heure à température ambiante.
Introduire la membrane dans un sachet, ou une boite hermétique avec une solution d’anticorps de composition 10 mL TBS, 0,5g lait, 20 µL Tween 20Rabbit anti-ovalbumine. Ce premier anticorps a été obtenu après injection de l’ovalbumine par intraveineuse chez le lapin. L’ovalbumine provenant de la poule est immunogène chez le lapin. Ce dernier fabrique des anticorps qui sont récupérés dans le sérum après prélèvement sanguin.
Laisser incuber une heure sous agitation à 37oc
Laver la membrane 3 fois pendant15 minutes avec une solution de lavage (300mL TBS, 30 mL de solution de blocage, 600 µL Tween 20) sous agitation.
Dans le noir ou sous une lumière rouge, incuber avec l’anticorps secondaire goatanti-rabbit Alexa 680, dans les mêmes conditions que pour la solution d’anticorps primaires .Ce deuxième anticorps a été développé chez la chèvre après injection d’anticorps de lapin. Les anticorps produits sont récupérés dans le sérum des chèvres puis couplé à l’Alexa 680, un fluorophore.
Laver 3 fois pendant 15 minutes puis laver une fois pendant 5 minutes dans TBS 1X Scanner la membrane avec l’Odyssey,
Principe de fonctionnement du Western-Blot Source : http://www.leinco.com/general_wb
Anticorps secondaire Alexa 680
Anticorps primaire anti-ovalbumine OVAX
Membrane de nitrocellulose Signal
III Résultats et discussion
Lors du processus destiné à purifier nos clones d’intérêt, nous avons été amenées à nous interroger et réfléchir sur les meilleurs choix à faire, pour optimiser la purification. Mais nous avons été amenées également à contrôler nos résultats, soumettre des hypothèses et à les vérifier. Dans cette partie, nous vous présenterons la démarche effectuée lors de la purification des recombinants de l’OVAX.
III.1. Purification de l’OVAX à partir du blanc
d’œuf
Comme nous l’avons mentionné en Introduction, la purification à partir du blanc d’œuf est compliquée, de par la proche physicochimie entre les trois variants. Nous avons été amenées à analyser de l’OVAX purifiée à partir d’un mélange de blancs provenant de poules différentes. Nous l’avons injectée sur une colonne héparine-sépharose, dans le but de déterminer le temps de rétention de l’OVAX sur cette dernière, pour les purifications futures des clones .Nous avons alors observé un profil intéressant, correspondant à trois pics, pouvant correspondre à trois variants potentiels de l’OVAX.
Chromatogramme issue de l’injection de l’OVAX purifié.
Suite à cette constatation, nous avons testé plusieurs gradients en NaCl, dans le but d’optimiser la séparation des trois pics. Chacun de ces gradients a donné des résultats non concluants, et nous avons obtenu à chaque nouvelle stratégie, un profil moins bon que lors du gradient initial.
Chromatogramme de l’OVAX purifié à partir du blanc d’œuf – Test de Gradient sur héparine Sépharose
Nous avons également effectué une plusieurs injection successives de l’OVAX purifiée à partir de la méthode HS-0-1M, telle qu’utilisé lors du premier gradient, afin de contrôler la respectabilité des résultats. Nous avons à chaque injection obtenue un profil identique que celui du chromatogramme ci-dessus. Nous avons, à travers cette manipulation, eu la confirmation que les trois variants de l’OVAX, sont très difficiles à séparer, de par leur propriétés très similaires.
III.2. Purification des clones par chromatographie
d’exclusion
Pour purifier nos clones 21, 22 et 34, nous avons choisi de débuter la purification avec une colonne chromatographique d’exclusion. En effet, notre surnageant, issu des colonies 21, 22 et 34, et chargé de notre OVAX, mais aussi de nombreuses protéines bactériennes de poids moléculaires variés. Cette première étape permet d’éliminer des protéines, dont la masse est éloignée de celle de l’OVAX.
Lors de la purification des clones, nous avons observé un découpage en quatre fractions, pour chacun des clones.
Chromatogramme du clone 21 par filtration sur gel ; méthode HR100 à 280 nm
0 13 25 38 50 63 75 88 100 113 125 138 150 163 175 188 200 220 -200 0 200 400 600 800 1 000 1 200 1 400 1 600protéines #1 21-160414 UV _1 mV min 1 - 0,595 2 - 55,714 3 - 78,621 4 - 94,512 5 - 159,872 6 - 198,574
Chromatogramme du clone 22 par filtration sur gel ; méthode HR100 à 280 nm
Chromatogramme du clone 34 par filtration sur gel ; méthode HR100 à 280 nm
Nous avons fait le choix de recueillir la fraction correspondant au pic d’exclusion total, correspondant au premier pic, ainsi que le second pic (les deux autres pics correspondant à des analytes dont la masse est bien inférieure à celle de l’OVAX). Nous nous sommes interrogées ensuite, sur la présence de l’OVAX dans chacune des deux fractions récoltées. C’est ce qui nous a amenées à réaliser un SDS-PAGE dont voici le scan ci-après.
SDS-PAGE des clones bruts et des fractions collectés par gel filtration – méthode HR100 Etalon de poids moléculaires(Bio-Rad)
fraction, correspondant au pic d’exclusion totale de la colonne. Cependant, nous avons constaté également la présence d’autres protéines, en quantité non négligeable. En mettant en parallèle les résultats Western-Blot, nous avons observé un signal d’intensité identique.
Western-Blot issue des fraction de la gel filtration – méthode HR100
Ceci nous a ainsi amenée à sélectionner la fraction 2, afin d’éliminer le plus d’impuretés possibles, et faciliter la purification dans les prochaines étapes. Il est à noter que le fait de sélectionner le pic 2 et pas le pic 1 s’accompagne d’une perte de matériel puisque l’OVAX contenue dans le pic 1 ne sera donc pas purifiée.
III.3. Purification par chromatographie ionique
Dans cette deuxième étape de purification, nous avons décidé de travailler sur une colonne échangeuse cationique Vydac400VHP Ion-exchange (Vydac), avec un gradient linéaire selon la méthode Q-q-1M. L’intérêt étant ici d’enlever de la matrice des composées telles que des ions cationiques, ou des composées non retenus par la résine.
Nous avons dans un premier temps, injecté la fraction 1 du clone 22, afin d’observer le profil obtenu. Nous avons visualisé, après injection, la détection d’un pic de temps de rétention nul et un massif. Nous avons recueilli la fraction de l’échantillon correspondant à ce massif que nous avons réinjecté. Nous avons alors obtenue ce chromatogramme, ou l’on voit de nouveau un pic mal résolu :
Ce résultat nous rendant perplexe, nous nous sommes interrogé sur la fiabilité de la colonne chromatographique, vieille de plus de 10 ans. Nous avons donc changé de stratégie et tenter de purifier nos clones sur une colonne de longueur plus importante et plus récente. Nous avons testé cette nouvelle colonne une Q-sepharose avec la même méthode, mais à un débit plus faible, pour éviter la surpression. De plus, nous avons opéré avec la fraction 2 du clone 34.
A l’issue de cette purification, nous obtenons un pic de rétention nul, un premier massif possédant plusieurs épaulements et deux seconds massifs assez bien résolus. Nous avons donc recueilli 5 fractions, correspondant à des temps de collecte précis, en lien avec les variations de signaux observées. L’expérience a été réitérée sur les clones 21 et 22, pour la même fraction issue de la chromatographie d’exclusion. On obtient le même profil, dont voici un exemple ci-après.
Chromatogramme du clone 24 sur Q-Sépharose – Méthode Q-q-1 M – débit 0.06 mL.min-1
Suite à cela, nous avons effectué plusieurs gels SDS-PAGE, et un Western-Blot, dans le but de déterminer dans quelles fractions se loge l’OVAX, afin de rassembler celles d’intérêt, et d’éliminer les autres.
Dans un premier temps, nous avons réalisé des gels SDS-PAGE, comparés en parallèle. Le premier gel, réalisé sur le clone 34, semble afficher une bande caractéristique de l’OVAX dans les fractions 3 et 4. Le pic 1 n’affiche aucune bande.
SDS-PAGE du clone 34 fractions issue de la Q-Sépharose – méthode Q-q-1M
Compte tenu de ce résultat, nous avons déduit que le pic 1 de rétention nulle, n’avait pas d’importante. Les deux autres clones 21 et 22 ont également été injectés selon le même protocole, et les pics ont été collectés. Les profils obtenus étaient similaires à celui du clone 34. Nous avons donc analysé chaque fraction de chaque clone par gel SDS-PAGE et par Western-Blot, sans analyser la première fraction.
Nous avons confirmé, après révélations, que l’OVAX se loge bien dans les fractions 3 et 4 des clones d’études tout en étant plus concentrée dans le pic 3.
Western-Blot de chaque fractions issue de la Q-Sépharose pour les clones 21 22 et 34 – Méthode Q-q-1M
Ainsi, nous avons concentré ces deux fractions pour chaque clone, à 250 µL. Grâce à cette purification sur Q-Sépharose, on a pu éliminer un nombre non négligeable d’impuretés. Les fractions 3 et 4 de chacun des clones d’intérêt sont conservées et purifiées indépendamment dans une prochaine étape sur une colonne Héparine Sépharose.
III.4. Purification par chromatographie d’affinité à
l’héparine
Pour cette ultime étape de purification, nous avons fait le choix de nous intéresser uniquement au pic 3, issue de la Q-Sépharose, pour les clones 21 22 et 23. En effet, cette étape en faisant ce choix, nous évitons d’introduire dans notre échantillon des impuretés en nombre important, présent dans la fraction 4.
A l’issue de la chromatographie sur Héparine Sépharose, les clones sont séparés en quatre fractions, dont voici un exemple de chromatogramme.
Chromatogramme du clone 22 issue de la fraction 3 de la Q-Sépharose
Au terme de la purification, nous avons eu de multiples interrogations. Tout d’abords, nous nous sommes interrogées sur la fixation de l’OVAX à l’héparine. Compte tenu du signal chromatographique, nous avons pensé que ce dernier, malgré son affinité pour cette dernière, ne se soit pas fixé. Nous avons donc réalisée une première analyse sur la fraction correspondant au pic de rétention nul.
En confrontant le gel SDS-PAGE et le Western-Blot, on obtient deux résultats contradictoire. Le gel révèle une bande caractéristique du poids moléculaire de l’OVAX, tandis que le Western-Blot n’affiche aucun signal spécifique de l’OVAX. Nous avons donc fait l’hypothèse que, la bande caractéristique en SDS-PAGE, d’un poids moléculaire identique à l’OVAX, était en réalité une protéine endogène, issue de la bactérie, avec un poids moléculaire identique.
Nous avons donc réalisé un second gel SDS-PAGE et Western-Blot, sur les fractions 4 de chaque clone, qui, d’après le temps de rétention à laquelle le signal chromatographique a été détecté, correspondrait à l’OVAX.
On observe une bande très pure pour le clone 21 en SDS-PAGE, couplé à un bon signal en Western-Blot. On observe en parallèle un signal faible en Western-Blot pour les fractions 4 des clones 22 et 34 mais aucun signal en SDS-PAGE.
SDS-PAGE fraction 4 issue de l’héparine Western-Blot fraction 4 issue de l’héparine
Compte tenu de ces résultats, nous pouvons en déduire que la purification a permis d’éliminer une matrice importante. Cependant, la sélection privilégiée de fractions a manifestement joué sur le rendement de cette purification. En effet, mis à part le clone 21, les autres clones ont subi une diminution considérable de leurs quantités d’OVAX. Cela est confirmé par l’absence de signal en SDS-PAGE pour ces deux clones, mis en parallèle avec le faible signal en Western-Blot. Le signal, pour cette technique, est détectable car les techniques fluorimétriques sont très sensibles. Cependant, on peut également imaginer que les multiples étapes de congélation et décongélation, entre les différentes expérimentations, ont pu dégrader les échantillons, ce qui expliquerait aussi, la perte de matériel, voire des affinités pour l’héparine différentes.
Conclusion
Au terme de ce dossier, nous pouvons affirmer que l’œuf, bien qu’il soit connu par nous tous, n’en demeure pas moins un mystère. Il renferme des milliers de protéines antimicrobiennes, prévues pour la nutrition et la défense de l’embryon. Bon nombre d’entre elles sont encore très peu connues, et c’est pourquoi leur caractérisation ouvre sur de plus amples recherches.
L’OVAX, en fait partie. Découvert par l’équipe FRPO, elle a fait l’objet d’identification et fût à l’origine d’un brevet. Cependant, les recherches continuent et notamment la caractérisation antimicrobienne des variants de l’OVAX. La purification de ces derniers à partir du blanc d’œuf n’était pas aisée, il a fallu avoir recourt à d’autres techniques sélectives d’un variant : La technique des recombinants.
Néanmoins, bien que cette technique permette la sélection d’un OVAX particulier, elle génère également des bactéries endogènes. C’est pourquoi l’élaboration d’un protocole de purification a été nécessaire.
Durant cette période de stage, nous avons développé une méthode qui permet, d’après nos résultats, de parvenir à un échantillon relativement pur. Néanmoins, la perte de matériel dans les différentes étapes de purification reste conséquente, ce qui prétend d’une amélioration potentiel de la méthode. De plus, les bandes terminales SDS-PAGE, doivent faire l’objet d’une analyse en spectrométrie de masse, afin d’affirmer la pureté du composé : en effet, l’OVAX a effectivement été identifiée par Western-blot dans une bande de poids moléculaire compatible avec celui de l’OVAX, mais il est très possible que cet échantillon contienne également des protéines d’origine bactérienne de même poids moléculaire.
La méthode peut encore être améliorée. Cependant, on peut imaginer, qu’en travaillant sur de plus grande quantité, les fractions terminales de chaque clones pourront être recueillies en quantité suffisante pour faire l’objet de tests antimicrobiens. Ainsi, l’équipe pourra en apprendre davantage sur cette protéine active dans la destruction des pathogène telle que Listeria monocytogene set Salmonella Enteritidis. L’enjeu de ces études est très important. En effet, si l’équipe arrive à montrer que certains variants de l’OVAX sont plus antimicrobiens vis-à-vis de Salmonella et qu’il existe une variabilité individuelle entre les poules ou les différentes races de poules, cela pourrait expliquer pourquoi certains œufs sont plus sensibles à la contamination par les Salmonelles. Ces résultats pourraient notamment favoriser la sélection de poules qui expriment le variant le plus antimicrobien, pour limiter la contamination des œufs par Salmonella et le risque de toxiinfection
