Evaluation de la croissance de quelques bactéries du sol dans les conditions métabolique et co-métabolique en présence de deux pesticides

ةرازو ميلعتلا يملعلا ثحبلا و يلاعلا

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique يحي نب قيدصلا دمحم ةعماج

- لجيج

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Département : Microbiologie Appliquée et

Sciences Alimentaires

Mémoire de Master Filière : Sciences Biologiques Option: Microbiologie Appliquée

Thème ^:

Présenté par:

M

^lle

. Meryem BOUZENTOUTA M

^lle

. Nadjiya MEHASSOUAL

Année universitaire 2018– 2019

Numéro d’ordre (bibliothèque) : …………...

Evaluation de la croissance de quelques bactéries du sol dans les conditions métabolique et co-métabolique en

présence de deux pesticides

Membres de Jury :

Président: Pr. Tayeb IDOUI

Examinatrice: Dr. Amel AIT MEDDOUR Encadreur: Pr. Mohamed SIFOUR

ةايحلاو ةعيبطلا مولع ةيلك ةيقيبطتلا ايجولويبوركيملا مسق

ةيذغتلا مولع و

Je dédie ce travail

A la mémoire de ma Mère A mon Père

A mes Frères, Djamel Eddin, Ali et Mouhamed Rida A ma Sœur Zina

Aux membres de ma grande famille : oncles, tantes, cousins et cousines pour leurs soutien affectif et moral, pour leur très grande gentillesse, leur sourire qui réjouit toujours mon cœur et l’aide qu’ils m’ont apporté affin de finir ce travail

A ma binôme Nadjiya pour les moments difficiles passés ensemble

A mes amis, Assma, Bouchra, Nour El Houda, Yassmine, Hadjer, Mohamed, Seif Al Isslame, Bilale et Nasr Eddin

Avec une mention spéciale à ma promotion de microbiologie appliquée de l’année 2019

Et a tous ceux que j’aime.

Meryem BOUZENTOUTA

DEDICACE

A ma mère à qui je dois tout en gage ma profonde affection. Rien au monde nevaut ton dévouement et tes efforts fournis jour et nuit pour mon éducation et

mon bien être

A mon père qui a veillé sur mon éducation, que dieu l’accueille dans son vaste paradis

A tous ceux qui me sont chers : Mes adorables sœurs (Nadia, Khalida, Meryem, Chaima) et leur nièce (Iyad, Ritadje, Maria, Rokia)

A mes amis qui ont été la lors de mes heures les plus sombres et mes moment les plus heureux (Aziza, Amina, Fatiha,Rafika ,Chahera,Hassina,

Hadjer,Asema,Bilal, Amine )

A ma binôme Meriem à qui je présente mes sincères remercîments de m’avoir supporté durant tout ce travail

A toute la promotion de microbiologie appliqueé

Nadjiya MEHASSOUAL

Remerciant tout d’abord Allah tout puissant de nous avoir donné la force de réaliser ce travail.

L’encadrement scientifique de ce travail a été assuré par Mr. SIFOUR M Professeur à l'université de Jijel. Nous tenons vivement à lui exprimer nos profondes reconnaissances et

gratitudes pour le privilège et la confiance qu’il nous a accordé durant la réalisation de ce travail, pour son aide, le temps qu’il nous a consacré et pour ses précieux conseils.

Nous remercions sincèrement Pr. IDOUI T de l'université de Jijel de nous avoir honoré ce travail en acceptant de présider le jury.

Nous adressons nos remerciements également au Dr. AIT MEDDOUR A maitre de conférence à l'université de Jijel d’avoir accepté d’examiner ce travail

Nous remercions également les ingénieures du laboratoire du Microbiologie qui nous ont accompagné durant la réalisation de la partie pratique, pour leurs aide, leurs encouragements et aussi d’avoir mis à notre disposition tous les moyens techniques afin de pouvoir réaliser nos

expérimentations.

Nos remerciements vont également à l’ensemble des personnels qui ont contribué à la réalisation de ce mémoire, d’une manière directe ou indirecte. Avec une mention spéciale à

tous les binômes pour la gentillesse et les bons moments passés ensemble.

Merci à vous

Constante de la loi de Henry

H

: K

Koc : Coefficient d’adsorption normalisé par rapport à la teneur en carbone organique du sol Kd : Coefficient de partage ou de distribution sol / eau

Kow : Coefficient de partage octanol/eau VP: Pression de vapeur

DDT : Dichlorodiphenyltrichloro DDD : Dichlorodiphényldichloroéthane HCH : Hexachlorocyclohexane

OP : Organophosphoré

OPH : Organophosphore hydrolase

OPAA: Acide organophosphoré anhydrolase MmHg : Millimètre de mercure

Mpa : Milli-pascal T1/2 :Temps de demi-vie

EPA: Environnemental Protection Agency

DBO5 : Demande biochimique en oxygène après 5 jours Rpm : Rotation par minute

DO : Densité optique

HPLC: Chromatographie liquide à haute performance

Figure : 1 Structure chimique de quelque pesticides organochlorés 07 Figure : 2 Structure chimique de quelque pesticides pyréthrinoïdes 07 Figure : 3 Structure chimique de quelque pesticides organophosphorés 08 Figure : 4 Structure chimique de quelque pesticides carbamates 08 Figure : 5 Processus de dissipation des pesticides dans l’environnement 09 Figure : 6 Evaluation de la croissance des isolats bactériens en présence de

coragèn

27

Figure : 7 Evaluation de la croissance des isolats bactériens en présence de glyphosate

28

Figure: 8 Croissance des isolats bactériens sur milieu minimum sans pesticide 29 Figure : 9 Evaluation de la croissance de la souche SB7 en présence de

glyphosate

30

Figure : 10 Evaluation de la croissance de la souche SB8 en présence de glyphosate

31

Figure : 11 Evaluation de la croissance de la souche SB5 en présence de coragèn 32 Figure : 12 Evaluation de la croissance de la souche SB8 en présence de coragèn 33 Figure : 13 Evolution de la croissance de P. flueorescensen fonction du temps à

différents pH sur le bouillon nutritif

34

Figure : 14 Evolution de la croissance de P. flueorescens en fonction du temps à différents température sur le bouillon nutritif

35

Figure : 15 Evolution de la croissance de P. flueorescensdans le bouillon nutritif en fonction du temps à différents concentration de NaCl

37

Figure : 16 Effet de déférents facteurs sur la croissance de la souche SB8 en présence de glyphosate

37

Figure : 17 Diagramme de Pareto rationalisant l’effet de chaque variable sur la croissance

38

Figure : 18 Cinétique de la croissance de la souche SB8 avec et sans glucose en présence de glyphosate

41

Tableau : 1 Rémanence de quelques pesticides dans le sol 05 Tableau : 2 Mode d'action des herbicides, fongicides et insecticides 06

Tableau : 3 Composition du milieu minimum 16

Tableau : 4 Composants du milieu et les niveaux tests de l’expérience Plackett- Burman

21

Tableau : 5 Matrice de Plakett-Burman pour la dégradation du glyphosate par Pseudomonas fluorescens

21

Tableau : 6 Caractéristiques morphologiques et biochimiques des souches bactériennes

24

Tableau : 7 Croissance de diverses souches sur MMM gélosé en présence de glyphosate et coragèn (50 mg/l)

25

Tableau : 8 Modèle de Plackett–Burman pour la croissance de Pseudomonas fluorescens

36

Tableau : 9 Analyse de régression de l’effet de chaque variable avec le coefficient, la valeur T et P

37

Tableau : 10 Demande biochimique en oxygène pour cinq jours 42 Tableau : 11 Concentration de l’oxygène dissous dans le MMM additionné de

pesticides.

42

Liste des abréviations………..i

Liste des figures………..ii

Liste des tableaux………..iii

Introduction………..01

I. Synthèse bibliographique I. 1. PESTICIDES I.1.1. Définition et données...………03

I.1.2.Propriétés physico-chimiques des pesticides………..…...03

I.1.2.1. Pression de vapeur………...03

I.1.2.2. Solubilitéet coefficient de partage (octanol / eau) - Kow (Log Kow)………..03

I.1. 2.3. Coefficient d'adsorption du sol………...04

I.1.2.4. Constante de la loi de Henry-H ………..04

I.1.2.5. Temps de demi-vie………...04

I.1.3. Classification des pesticides………...05

I.1.3.1. En fonction de l'espèce nuisible ciblée………...05

I.1.3.2. En fonction de mode d'action……….06

I.1.3.3.En fonction de la composition chimique………...06

I.1.3.3.1. Pesticides organochlorés………...06

I.1.3.3.2. Pesticides pyréthrinoïdes………...07

I.1.3.3.3. Pesticides Organophosphoré………07

I.1.3.3.4. Pesticides au carbamate………...08

I.1.4. Devenir de pesticides dans l’environnement………...08

I.1.5. Processus de transfert de pesticides dans l'environnement………09

I.1.5.1. Transfert de pesticides vers les eaux……….09

I.1.5.1.1. Transfert en surface : le ruissellement………...09

I.1.5.1.2. Transfert en profondeur : la lixiviation………...9

I.1.5.2. Transfert de pesticides vers l’atmosphère………...9

I.1.5.2.1. Volatilisation………...9

I.1.5.2.2. Erosion éolienne………...9

I.1.5.3. Transfert de pesticides dans le sol………..10

I.1.5.3.1. Absorption par la plante………...10

I.1.5.3.2. Adsorption……….10

I.1.5.3.3. Rétention biologique……….10

I.1.6. Pollution causée par les pesticides……….10

I.1.6.1. Impact toxicologique………...10

I.1.6.2. Impact éco-toxicologique……….11

I.1.6.2.1. Dans le sol………...11

I.1.6.2.2. Dans les eaux……….11

I. 2. DEGRADATION DES PESTICIDES I.2.1. Dégradation abiotique………...12

I.2.1.1. Hydrolyse...12

I.2.1.2. Oxydoréduction………12

I.2.1.3. Photo-décomposition………13

I.2.2. Dégradation biotique...13

I.2.2.1. Métabolisme direct………..13

I.2.2.2. Co-métabolisme...13

I.2.2.2. Conjugaison...14

I.2.3. Biodégradation des pesticides par les microorganismes………...14

I.2.3.1. Dégradation microbienne des pesticides organochlorés……….14

I.2.3.2. Dégradation microbienne des pesticides organophosphorés………...14

I.2.3.3. Dégradation microbienne des pesticides à base de carbamate………....15

I.2.3.4. Dégradation microbienne des pesticides pyréthrinoïdes………...15

II. Matériel et Méthodes

II.1. Matériel……….16

II.1.1. Souches bactériennes……….16

II.1.2. Milieux de cultures………...16

II.1.3. Produits chimique et réactifs utilisées……….17

II.1.4. Appareillage………..17

II. 2. Méthodes………..17

II.2.1. Purification des souches………17

II.2.2. Identification des souches……….18

II.2.3. Préparation de l'inoculum bactérien………...18

II.2.4. Criblage des souches résistantes aux pesticides………..18

II.2.5. Effet de différente concentration de pesticides sur la croissance bactérienne…………19

II.2.6. Etude de la dégradation de pesticides par la méthode de la DBO5………..19

II.2.7.Optimisation de la croissance de la souche SB8……….………20

II.2.8. Facteurs influençant la biodégradation de pesticides………20

II.2.9. Effet du glucose sur la biodégradation des pesticides………22

II. 2.10. Calcul du taux de croissance……….22

III. Résultats et Discussion III.1. Identification des souches bactériennes………...23

III.2. Sélection des souches bactériennes résistantes aux pesticides………...25

III.2.1. Sélection sur milieu MMM solide………..25

III.2.2. Sélection sur milieu MMM liquide………...26

III.3. Tolérance des souches à différentes concentrations de pesticides………..29

III.3.1. Glyphosate………...29

III.3.2. Coragèn………32

III.4. Optimisation de la croissance de la souche SB8……….34

III.5. Facteurs influençant la biodégradation de pesticides………...35

III.6. Effet du glucose sur la biodégradation du glyphosate………40 III.7. Biodégradation de pesticides en utilisant la DBO5……….41 Conclusion et perspective………42 Références bibliographique

Annexes

Résumé

Introduction

La pollution causée par les activités agricoles et l’usage des produits phytosanitaires représentent un cas typique de pollution multiple et généralisée de tous les compartiments de l’environnement. Elle constitue un sujet de préoccupation majeure et un problème d’actualité (Aouadi et al., 2018).

Les pesticides sont des produits chimiques destinés à lutter contre les attaques de divers parasites vecteurs sur les cultures et les animaux domestiques. Le terme pesticide inclut les insecticides, les herbicides, les fongicides et diverses autres substances (Zhang et al., 2011). Les pesticides se caractérisent par leur composition et leur structure très variée, leurs propriétés physiques, chimique et biologique différentes expliquent leur multiples usages, leurs dangers ainsi que les difficultés rencontrées pour décrire et prévoir leur devenir dans le sol (Calvet et al., 2005).

L’utilisation des pesticides par l’agriculture présente deux aspects aux conséquences totalement opposées. Le premier concerne la nécessaire réduction des dégâts causés aux cultures par des organismes phytopathogènes et du développement des adventices pour maintenir la productivité alors que le deuxième tient à la nature même des pesticides qui en fait, dans certaines conditions, de possibles polluants de l’air, des eaux, des aliments et des sols. Lorsqu’il se trouve dans le sol, le pesticide peut être dégradé par des processus abiotiques qui impliquent des réactions chimiques et photochimiques ou biotiques réalisés par les microorganismes du sol, limitant ainsi les contaminations (Ortiz-Hernández et al., 2011; Margni et al., 2012 ).

Le développement des systèmes de traitement des déchets phytosanitaires, représente un intérêt croissant. Parmi les moyens de dépollution, celles qui utilisent les techniques physico-chimiques sont considérées très couteuses et nécessitent des moyens généralement lourds. On assiste ces dernières années à l’émergence des techniques biologiques qui sont beaucoup moins onéreuses et très efficaces (Loqman, 2009). Ces procédés font appel aux microorganismes capables de biodégrader ces polluants très variés.

Les procédés de biodégradation sont connus pour être l'un des principaux

moteurs de l'atténuation naturelle des résidus de pesticides dans l'environnement qui est assurée

par les microorganismes du sol via de nombreuses réactions enzymatiques (Vandermaesen et

al., 2018). La dégradation des pesticides par les microorganismes peut aussi être influencée par

la structure chimique ou la concentration des pesticides. Les interactions microbiennes et aussi

les conditions environnementales, peuvent modifier le comportement des populations

microbiennes ainsi que le développement des mécanismes de résistance contre ces polluants (Chaplain et al., 2011; Huang et al., 2018).

L’objectif principal de ce travail est :



Evaluer la croissance de neuf isolats bactériens isolées à partir d’un sol agricole sur milieu minéral minimum additionné de chaque pesticide glyphosate et coragèn comme seule source de carbone ;



Evaluer l’influence de certains paramètres sur la cinétique de croissance des isolats et leurs capacités à dégrader ces pesticides ;



Etudier l’effet de l’addition d’une autre source alternative de carbone sur la

biodégradation des pesticides.

Partie I.

Synthèse bibliographique

I.1. PESTICIDES

I.1.1. Définition et données

Le terme « produits phytosanitaires » appelés couramment «pesticides», désigne toute substance ou mélange de substances chimiques (naturelles ou synthétiques)destinée à prévenir, détruire, repousser, atténuer ou lutter contre les éléments vivants microbes, animaux ou végétaux considérés comme nuisibles aux cultures, aux récoltes,à la santé humaine mais aussi pour des usages non agricoles (Barriuso et al., 1996 ; Zacharia, 2011 ;Zhang et al., 2011 ; Flayou, 2016 ; Hocinat, 2018).

Les pesticides sont communément associés à des adjuvants au sein des formulations commerciales.

Ces adjuvants permettent de solubiliser et de stabiliser sur de longues périodes la substance active mais aussi d’augmenter son efficacité, notamment en favorisant sa pénétration et sa diffusion dans la plante. Ils peuvent influer sur les effets environnementaux en modifiant le mode de dispersion du

produit ou sa persistance. Les adjuvants les plus répandus sont les surfactants, les huiles végétales et

minérales, les sels organiques, les solutions tampons et les solvants (Calvet et al., 2005 ; Carles, 2016).

I.1.2. Propriétés physico-chimiques des pesticides

L’activité biologique d’un pesticide vis-à-vis de l’espèce nuisible cible est fortement influencée par ses propriétés physiques et chimiques, qui permet de déterminer, a priori, le comportement d’une molécule dans l’environnement et de ce fait, le risque de pollution (Diop, 2013 ; Khatem, 2017).

I.1.2.1.Pression de vapeur (VP)

La pression de vapeur d’une substance est la mesure de la facilité avec laquelle elle peut se volatiliser et se transformer en vapeur (état gazeux). Les pesticides ayant une pression de vapeur très élevée se volatilisent plus facilement. Un pesticide à faible pression de vapeur s'accumulé dans l'eau s’il est soluble. S'il n'est pas soluble, le pesticide peut s'accumule dans le sol ou le biote (Diop, 2013 ; Marouane, 2014).

I.1.2.2. Solubilité et Coefficient de partage (octanol / eau) - Kow (Log Kow)

La solubilité est une mesure de la facilité avec laquelle une substance donnée peut se dissoudre dans

l’eau ou dans un solvant donné. L'unité de solubilité dans l'eau est indiquée en ppm (parties par

million) (Marouane, 2014 ; Agoussar, 2018).

Le coefficient de partage d’un composé organique entre les deux phases octanol et l’eau est défini par le rapport de ses concentrations dans les deux phases à l’équilibre. Les valeurs de Kow pour les produits chimiques organiques peuvent être assez grandes et souvent exprimé par Log Kow qui est donné par la relation suivante : Log Kow = Log (Coct / Ceau)

La valeur de Kow est considérée comme un bon indicateur de la bioaccumulation des pesticides dans les membranes des organismes et les chaînes alimentaires (Boithias et al., 2014 ; Marouane, 2014 ).

I.1.2.3.Coefficient d'adsorption du sol Koc / Kd

L’adsorption de pesticides sur les sols et les sédiments est un facteur majeur qui détermine la destination des pesticides dans l’environnement et leurs processus de dégradation éventuels.



Koc est le rapport (à l'équilibre) de la masse d'une substance adsorbée sur une unité de masse de sol par rapport à la masse de la substance restant dans la solution aqueuse.



Kd appelé le coefficient de sorption qui mesure la quantité de pesticides adsorbés sur le sol par quantité d’eau sans tenir compte de la teneur en matière organique du sol.

Le paramètre préféré pour déterminer la capacité du sol à adsorber les organismes nuisibles est Koc, car il considère la matière organique contenu du sol (Diop, 2013; Boithias et al., 2014; Marouane, 2014 ; Khatem, 2017).

I.1.2.4.Constante de la loi de Henry (K

H

)

Est la mesure de la concentration d’un produit chimique dans l’air au-dessus de sa concentration dans l'eau en (Pa.m

³

.mol) (Diop, 2013). L’importance environnementale de la loi de Henry est qu’un pesticide avec une valeur élevée se volatilise dans l’air et se répartit sur une grande surface.

Inversement, les pesticides ayant une faible valeur de K

H

ont tendance à persister dans l’eau et peuvent être adsorbés dans le sol et sédiment (Marouane, 2014 ; Khatem, 2017).

I.1.2.5.Temps de demi-vie (T

1/2

)

C’est la période de temps nécessaire pour dégrader ou transformer la moitié de la quantité de

pesticide présente dans le sol (Navaro et al., 2007). Le temps de demi-vie est un facteur

particulièrement conditionné par les paramètres biotiques, tels que la population microbienne, la

température, l’humidité du sol. En effet, plus le pesticide est persistant ( Tableau1) dans le sol, plus

il a de chances de subir des transferts vers les eaux souterraines ou superficielles (Chaplain, 2011;

Marouane, 2014).

Tableau 1 : Rémanence de quelques pesticides dans le sol (Boseret, 2000).

Pesticide Rémanence

Dichlorodiphenyltrichloro

(DDT) Lindane (organochloré)

Endosulfan (organochloré) Carbofuran (carbamate) Parathion (organophosphoré)

4-30 ans 3-10ans 2 mois à 2ans 6 mois 3-6 mois

I.1.3. Classification des pesticides

Ces substances peuvent être classées selon les phytopathogènes responsables, leurs modes d’action ainsi que leurs structures chimiques (Agoussar, 2018).

I.1.3.1. En fonction de l'espèce nuisible ciblée

Dans ce type de classification, les pesticides sont regroupés en fonction de l’organisme nuisible et nommés d'après le nom de cet organisme correspondant. Il existe 3 grandes familles (Agoussar, 2018) :



Les insecticides: destinés à détruire les insectes nuisibles. Ils interviennent sur des fonctions vitales de l’insecte telles que la transmission de l’influx nerveux et la respiration.



Les herbicides:

destinés à éliminer les mauvaises herbes adventices des cultures en inhibant la photosynthèse, la division cellulaire ou les réactions enzymatiques impliquées dans la synthèse des lipides et des acides aminés chez la plante.



Les fongicides: servant à combattre la prolifération des champignons phytopathogènes. Les plus représentés sont les carbamates

Outre ces trois grandes familles mentionnées précédemment, d’autres peuvent être citées en exemple (Flayou, 2016):



Les acaricides: contre les acariens;



Les nématicides: toxiques pour les vers du groupe des nématodes;



Les rodenticides: contre les rongeurs;



Les taupicides: contre les taupes;



Les molluscicides: contre les mollusques, les limaces et les escargots;



Les corvicides et les corvifuges: contre les corbeaux et les oiseaux ravageurs des cultures;

I.1.3.2.En fonction de mode d'action

Les pesticides sont classés en fonction de mode d’action dans lesquels ils agissent pour produire l'effet désiré (Tableau 2), de cette façon, les pesticides sont classés comme non systémiques et pesticides systémiques. Les pesticides non systémiques sont ceux qui ne pénètrent pas sensiblement dans les tissus végétaux et ne sont pas transportés dans le système vasculaire de la plante ainsi ils ne produiront l’effet souhaité que lorsque ils entrent en contact avec l'organisme nuisible ciblé, d'où les pesticides de contact. D'autre part, les pesticides systémique sont ceux qui pénètrent efficacement dans les tissus végétaux et se déplacent à travers le système vasculaire de la plante afin de produire l'effet désiré (Batsch, 2011 ; Agoussar, 2018).

Tableau 2: Mode d'action des herbicides, fongicides et insecticides (Batsch, 2011).

Mode d’action Herbicide

Agit sur les parties de la plante avec lesquelles il entre en contact De contacte

Absorbé par les stomates de la plante et se déplace à l'intérieur de celle-ci Systémique

Ne contrôle que certaines plantes parmi celles qui sont traitées Sélectif

Action sur la graine pour empêcher sa germination De pré-levée

Action sur la plante émergée De post-levée

Contrôle toutes les plantes traitées Non- sélectif

Se dégrade lentement et contrôle les plantes pour une longue période Résiduaire

Est rapidement inactif après son application et ne contrôle les plantes que sur une courte période

Non résiduaire Fongicide

Protège la plante en empêchant que la maladie se développe Préventif

Réprime une maladie qui est déjà développée Curatif

Insecticide

Agit lorsque l'insecte entre en contact avec le produit De contacte

Agit lorsque l'insecte respire le produit D'inhalation

Agit lorsque l'insecte se nourrit du produit D'ingestion

I.1.3.3.En fonction de la structure chimique I.1.3.3.1. Pesticides organochlorés

Les pesticides organochlorés sont des composés organiques aromatiques contenant au moins cinq

atomes de chlore. La plupart d’entre eux ont été largement utilisés comme insecticides et ils ont un

effet résiduel à long terme sur l'environnement car ils sont résistants à la plupart des dégradations

chimiques et microbiennes (Porto et al., 2011).Les organochlorés les plus représentatif (Figure 1)

sont le DDT, le lindane, l’endosulfan, l’aldrine et la dieldrine (Barragan-Huerta et al., 2007 ;

Porto et al., 2011).

Figure 1: Structure chimique de deux pesticides organochlorés (Flayou, 2016).

I.1.3.3.2. Pesticides pyréthrinoїdes

Les pyréthrinoїdes sont des insecticides de synthèse dérivés du pyrèthre (plante herbacée), reconnus pour leur effet de blocage rapide contre les insectes nuisibles. Ces derniers ont été mis au point par modification de la structure de pyréthrine (ensemble de substances drivées du pyrèthre) afin de conférer une stabilité tout en conservant les propriétés fondamentales des pyréthrines. Les pyréthrinoїdes synthétiques les plus largement utilisés (Figure 2) comprennent la perméthrine, la cyperméthrine et la deltaméthrine (Porto et al., 2011).

Figure 2:Structure chimique de deux pesticides pyréthrinoïdes (Boithias et al., 2014).

I.1.3.3.3. Pesticides organophosphorés (OP)

Egalement appelés les organophosphates, constituent le groupe principal et le plus largement utilisé

qui représente plus de 36% du marché mondial total. Le plus utilisé (Figure 3) est le parathion

méthylique, qui comprennent les dérivés aliphatiques, phényliques et hétérocycliques. La plupart

des composés OP sont dégradés par les microorganismes présents dans l’environnement en tant que

source de phosphore et / ou de carbone. Ainsi, les pesticides OP peuvent être hydrolysés et

détoxifiés par des enzymes carboxylestérases et phosphotriestérases. Les organophosphorés

possèdent une activité insecticide efficace (Porto et al., 2011; Deng et al., 2015).

Figure 3: Structure chimique de deux pesticides organophosphorés (Boithias et al., 2014).

I.1.3.3.4. Pesticides au carbamate

Les carbamates ont été introduits en tant que pesticides au début des années 1950 et sont encore largement utilisés dans la lutte contre les ravageurs en raison de leur efficacité et de leur large spectre d'activité biologique, ainsi qu'une toxicité aiguë élevée. Chimiquement, les pesticides carbamates sont des esters de N-méthyle carbamates et de composés organiques dérivés de l'acide carbamique (Figure 4). Ces composés sont probablement les insecticides ayant le plus large éventail d'activités biocides (Porto et al., 2011; Boithias et al., 2014).

Figure 4: Structure chimique de deux pesticides carbamates (Boithias et al., 2014 ).

I.1.4. Le devenir de pesticides dans l’environnement

Le comportement des pesticides dans le sol est complexe car il dépend d'une multitude de processus interconnectés et de la diversité des molécules actives (Paszko, 2012; Diop, 2013). En effet, une fois dès qu'ils sont atteint le sol, les pesticides commencent à disparaître, ils vont être soumis à de nombreux processus qui vont conditionner leurs devenirs dans les sols et les eaux (Figure 5) (Calvet et al., 2005

;

Guimont, 2005

;

Monard et al., 2013 ; Hmimou et al., 2014) :



Mise en solution dans le sol. Cette phase est particulièrement importante puisqu'elle correspond à l'apparition d'une forme mobile de la molécule, biodisponible pour les végétaux et les microorganismes;



Absorption par la microflore du sol et les végétaux;



Adsorption sur la phase solide organo-minérale du sol;



Biodégradation par la flore microbienne du sol, qui peut utiliser ces produits organiques

comme source de carbone.

I.1.5. Processus de transfert de pesticides dans l'environnement I.1.5.1. Transfert de pesticides vers les eaux

I.1.5.1.1.Transfert en surface : le ruissellement

Le ruissellement correspond à l’écoulement des eaux à la surface des sols lorsque l’intensité de l’apport d’eau est supérieure à la capacité d’infiltration du sol (Marouane, 2014).Les pesticides présents dans la couche supérieure du sol peuvent être transférés par l’eau sous forme dissoute ou particulaire (associés aux particules de sol) (Louchart et Voltz, 2007). La topographie, la nature du sol, les caractéristiques des matières actives, la couverture végétale, la durée et l’intensité des précipitations sont des facteurs agissant fortement sur ce mode de transport (Grébil et al., 2001;

Queyrel, 2014 ; Marouane, 2014 ; Lehmann et al., 2018).

I.1.5.1.2. Transfert en profondeur : la lixiviation

Lorsque l’eau s’infiltre, elle entraîne avec elle les matières actives dissoutes dans la solution du sol ou sous forme colloïdale (Calvet et al., 2005). Dans le sol pauvres en matière organique et en microorganismes où l’adsorption et la dégradation sont réduites, les produits phytosanitaires peuvent atteindre rapidement les couches profondes (Lehmann et al., 2018). Les risques de contamination des eaux de profondeur (nappe phréatique) sont alors élevés lorsque le sol n’assure plus son rôle de filtre (Grébil et al., 2001).

I.1.5.2. Transfert de pesticides vers l’atmosphère I.1.5.2.1. La volatilisation

La volatilisation correspond au processus physico-chimique par lequel un composé passe en phase gazeuse. La volatilisation peut être le résultat de l’évaporation de la phase liquide, la sublimation d’un solide et la désorption à partir de la matrice du sol (Bedos et al., 2002 ; Yates, 2009 ; Millet et Bedos, 2017).

I.1.5.2.2. L’érosion éolienne

Phénomène complexe qui conduit à un transfert des particules de sol contaminées par des pesticides

vers l’atmosphère par le vent (Mill et Bedos, 2017). Elle est favorisée dans les régions où les

vitesses et les fréquences de vent sont élevées (proximité de la mer, grandes plaines), et concerne

les cultures à faible couverture végétale. (Bedos et al. 2002; Lichiheb et al., 2015).

I.1.5.3. Transfert de pesticides dans le sol I.1.5.3.1.Absorption par la plante

Après l’application de pesticide, une fraction peut être absorbée par la plante, par le feuillage ou les racines (Juraske et al., 2009). Les quantités de matières actives ou métabolites prélevées par le système racinaire sont variables. Elle dépendent à la fois de la molécule et de l’espèce végétale considérée (Lin et al., 2003, Lin et al., 2008, Grundmann et al., 2011).

I.1.5.3.2. Adsorption

L’adsorption est définie comme le passage d’un soluté de la phase liquide (solution du sol) à la surface d'un adsorbant solide (les différents constituants du sol). Ce phénomène est complexe car il dépend à la fois des propriétés physico-chimiques des molécules, des caractéristiques des sols et des conditions du milieu (Weber et al., 2004 ; Ghosh et al., 2009 ; Paszko, 2012 ; Waldner et al., 2012).

I.1.5.3.3. La rétention biologique

Certaines auteurs attribuent la rétention biologique à la biosorption due à des interactions physiques avec les parois des microorganismes du sol et des racines (Février et al., 2007; Ghosh et al., 2009).

I.1.6. Pollution causée par les pesticides

Lors des traitements ou des transferts ultérieurs, les pesticides pénètrent dans le milieu environnemental entrainant différents types de pollution qui pouvant avoir des effets non souhaitables comprennent essentiellement des effets sur les espèces non ciblées (Van Der Werf, 1997). D’une façon générale, une partie des produits épandue n’atteint pas leurs cibles, et en conséquence, elle se retrouve dans les différents compartiments de l’environnement et conduire à leur contamination à travers différents mécanismes comprenant la volatilisation, le ruissellement qui peuvent altérer l'équilibre des écosystèmes en affectant potentiellement d'autres espèces (Calvet et al., 2005; Navarro et al., 2007).

I.1.6.1. Impact toxicologique

Les pesticides possèdent tous, à différents degrés, un potentiel de toxicité, qui peut toucher même

des organismes non ciblés, dont l'homme. Le délai d’apparition des symptômes varie en fonction de

la toxicité du pesticide, qui peut aller de quelques minutes à quelques heures après une exposition

directe aux produits (Rastogi et al., 1990; Margni et al., 2002 ; Gatignol et Etienne, 2010). Leurs

risques sont difficiles à élucider en raison de la participation de divers facteurs. (Kim

et al., 2017 ; Mamy et al., 2017).

Les produits phytosanitaires ont donc des propriétés toxiques avérées sur l’homme. Ils peuvent être à l’origine d’intoxications aiguës provoquant des maux de tête, des irritations cutanées, des troubles visuels, des nausées (Gatignol et Etienne, 2010). Par ailleurs les pesticides pourraient causer de pathologies chroniques telles que la diminution de la fertilité ou même l'infertilité, effets tératogène et/ou mutagène et pourraient aussi causer des anomalies du développement embryonnaire donnant des malformations ou bien des retards de croissance et de développement (Bell et al., 2001 ; Greenlee et al., 2003 ). Certaines expositions répétés aux pesticides peuvent ainsi causer des problèmes plus sérieux, potentiellement on note des répercussions sur le système nerveux telle que la maladie de Parkinson, le système endocrinien, ou même le système immunitaire, ainsi que l’apparition de certains type de cancer (système urogénital, thyroïde, cerveau, leucémie, pancréas) et parfois des effets génétiques (Engel et al., 2001 ; Gatignol et Etienne, 2010 ; Kim et al.,2017).

I.1.6.2. Impact éco-toxicologique I.1.6.2.1. Dans le sol

L'usage systématique des pesticides en agriculture engendre des effets toxique pour la microflore de sol qui se traduit par une diminution de l'activité microbienne et un développement de capacités de tolérance au polluant au sein des communautés sensibles, cela permet une apparition des microorganismes résistants aux pesticides ou pouvant l'utiliser comme source de carbone (Chaplain et al., 2011). Cette sélection se traduite généralement par une fragilisation de la population touché qui sera traduite par une réajustements microbiens qui pouvant être à l'origine des modifications de caractéristiques physiologiques de la microflore de sols et peut être aussi affecter la diversité des microorganismes (Barriuso et al.,1996 ; Savadogo et al.,2007 ;Grundmann et al., 2011).

I.1.6.2.2. Dans les eaux

Bonan et Prime, (2001) ont montré qu’après un demi-siècle d’agriculture de plus en plus intensive,

la pollution des eaux de surface et souterraines est généralisée et que l’on retrouve les pesticides

partout dans l’eau de robinet, l’eau de rivière, l’eau embouteillée, l’eau de pluie et aussi contamine

les personnes habitant dans les zones polluant. Hodgkinson et al., (2000) ont montré la destruction

massive des poissons à cause des pesticides organochlorés. En effet, ces derniers peuvent avoir des

effets néfastes a savoir irréversible qui peuvent agir soit de façon directe par la mortalité des

populations concernées, la féminisation des poissons mâles des, atrophie des oocytes chez les

poissons femelles ainsi que perturbent le développement embryonnaire et la croissance des alevins (Rastogi et al., 1990 ; Giroux, 2003 ; Singh et Singh, 2008 ; Aouadi et al., 2018).

I.2. DEGRADATION DES PESTICIDES

La dégradation est un processus clé dans le devenir des pesticides car elle assure la transformation (physique, chimique et/ou biologique) de la molécule initiale d'une manière plus ou moins prononcée, pouvant aller jusqu'à sa minéralisation. La dégradation peut être de nature abiotique ou biotique (Calvet et al., 2005 ; Arbeli et Fuentes, 2010 ; Ortiz-Hernández et al., 2011).

I.2. 1. Dégradation abiotique

Les transformations abiotiques sont dues à des réactions chimiques ou physiques sans intervention des microbes. C’est une voie importante d’élimination ou de transformation des pesticides dans l’environnement. La dégradation abiotique comprend la transformation chimique (oxydation, hydrolyse) et la transformation photochimique (la photo décomposition) (Flayou, 2016; Hocinat, 2018).

I.2.1.1. Hydrolyse

L’hydrolyse concerne la transformation du pesticide sous l’influence de l’eau. Elle conduit à la cassure de la molécule organique et au remplacement d’un atome ou d’un groupe d’atomes par un groupe hydroxyl OH; d’où la cinétique de l’hydrolyse est fortement influencée par le pH (H

⁺

et OH

^-

) (Cardeal et al., 2011). En effet la dégradation hydrolytique des pesticides dans l'environnement peut être catalysée par des ions métalliques : le Pb

²⁺

, le Zn

²⁺

, le Co

²⁺

, le Ni

²⁺

et le Cu

²⁺

(Calvet et al., 2005 ; Chaplain et al., 2011).

I.2.1.2.Oxydoréduction

Ce processus englobe les réactions d’oxydation et de réduction. Dans le cas de réduction, l’oxydant

est le pesticide et le réducteur est soit un composé inorganique (sulfure), un métal réduit (fer

ferreux), ou un composé organique. Ce genre de réactions se produit dans les sols hydromorphes,

les aquifères, et les sédiments, en général dans tous les milieux anaérobies ou peu aérobies

(Chaplain et al., 2011). Pour l’oxydation, elle est souvent catalysée par des systèmes enzymatiques,

ce qui traduit une origine biologique (Calvet et al., 2005 ; Zeng et al., 2012).

I.2.1.3. Photo-décomposition

La photo-décomposition induit une photo-dégradation ou photolyse, affectant les produits situés dans l’atmosphère et à la surface du sol, de l’eau et des végétaux. Ce mécanisme est induit par l’exposition à des rayonnements ultraviolets ou visibles (Tajedine et al., 2010). Elle est essentiellement due à des réactions d’hydrolyse et d’oxydation, activée par l’absorption de l’énergie lumineuse aboutissant à une décomposition irréversible (El Yadini et al., 2013 ; Lichiheb et al., 2015).

I.2. 2. Dégradation biotique

La dégradation biotique ou biodégradation d’une substance se définit comme le processus de destruction partielle ou totale des pesticides par des microorganismes contenus dans le sol tels que des bactéries, des champignons ou d’autres agents biologiques via de nombreuses réactions enzymatiques. Les principaux mécanismes de dégradation des pesticides par les populations microbiennes telluriques sont essentiellement le métabolisme direct et le Co-métabolisme (Savadogo, 2001; Diop, 2013).

I.2. 2. 1. Métabolisme direct

Beaucoup de pesticides sont utilisés par les microorganismes comme source d’éléments et d’énergie à des fins de croissance. Le stade ultime correspond à une minéralisation du composé organique se traduisant par l’apparition de CO

2

et de H

2

O et/ou de sels inorganiques (phosphate, ammoniac). La vitesse de minéralisation dépend de différents autres paramètres tels que les facteurs climatiques, la taille initiale de la microflore dégradante et la dose de pesticide appliquée (Barriuso et al., 1996 ; Diop, 2013 ; Marouane, 2014).

I.2.2.2.Co-métabolisme

C’est un processus au cours du quel les microorganismes ne récupèrent pas directement

l’énergie et les éléments nécessaires pour leur croissance. Ce type de mécanisme nécessite

l’intervention de plusieurs espèces microbiennes spécialisées chacune dans une étape

métabolique bien précise, on parle de consortium microbien. Cependant, ce mécanisme reste partiel

et entraîne par la suite une accumulation de métabolites qui peuvent être plus toxiques et plus

mobiles que le pesticide dont ils sont issus (Chaplain et al., 2011).

I.2. 2.3. Conjugaison

Est un processus au cours duquel des pesticides interagissent entre eux ou avec d'autres molécules présentes dans la solution du sol, les réactions chimiques étant catalysées par des enzymes exocellulaires. Elle conduit à l'union de deux molécules par méthylation ou par acétylation.

Lorsque la conjugaison réunit plus de deux molécules on parle de condensation (Savadogo, 2001;

Porto, 2011).

I.2.3. Biodégradation des pesticides par les microorganismes

La biodégradation est considérée comme un processus majeur d’élimination des pesticides dans l’environnement qui se produit principalement dans la dissipation des pesticides, ce qui est dû à l’adaptation des microorganismes après avoir été en contact avec des sols à forte exposition aux pesticides. Différentes souches et consortiums de bactéries dégradant les pesticides ont été isolés, en particulier du sol agricole (Lin et al., 2003 ; Pal et al., 2006 ; Vandermaesen et al., 2016 ).

I.2.3.1. Dégradation microbienne des pesticides organochlorés

Les pesticides organochlorés sont de moins en moins utilisés tous les jours et de nombreux pays ont interdit leur application, car ce groupe de pesticides est le plus persistant. Il y a deux voies principales par lesquels les microorganismes dégradent les composés organochlorés: la déchloration réductrice (un processus qui se déroule en anaérobies) et la déshydrochloration (se produisant en aérobiose). Parmi les microorganismes, les bactéries constituent le groupe principal impliqué dans la dégradation des organochlorées, en particulier ce appartenant à des genres Bacillus, Pseudomonas, Arthrobacter Micrococcus, Klebsiella et Staphylococcus (Barragan-Huerta et al., 2007 ; Parte et al., 2017). D’autre espèces bactériennes dégradent le dichloro-diphényl-dichloro- éthane (DDD) telles que Stenotrophomonas maltophilia, Flavimonas oryzihabitans, Sphingobacterium sp, Chryseobacterium sp et Morganella morganii implique largement le co- métabolisme (Fang et al., 2010 ; Ortiz-Hernández et al., 2011 ; Deng et al., 2015 ; Qu et al., 2015).

I.2.3.2. Dégradation microbienne des pesticides organophosphorés

Ce groupe de pesticides a été largement utilisé en raison de leur toxicité élevée vis-à-vis des

insectes, des mammifères et d’autres animaux. Les réactions enzymatiques conduisant à la

dégradation des pesticides organophosphorés sont divisées en deux phases (Bondarenko et al.,

2004 ; Chanika et al., 2011).

Les enzymes impliquées dans la première phase sont responsables de l'oxydation, de la réduction et de l'hydrolyse des composés chimiques avec catalyse de la majorité des biotransformations des pesticides (Huang et al., 2018). Les enzymes impliquées dans la deuxième phase conduisent à des réactions de conjugaison et qui sont des glucuronosyl-transférases, des sulfotransférases, des N-acyl transférases et des glutathione S-transférases. Les enzymes de deux phases sont considérées comme des enzymes de détoxification (Savadogo, 2001; Deng et al., 2015;Ishag et al., 2016).

Diverses souches bactériennes ont été isolées et rapportées pour la biodégradation des pesticides organophosphorés comprenant Burkholderia, Hyphomicrobium et Serratia sp qui peuvent dégrader le méthidathion et P. aeruginosa peut dégrader l'acéphate, le méthamidophos, le méthyleparathion, le diméthoate, et le malathion (Bondarenko et al., 2004; Chanika et al., 2011 ; Singh et al., 2014 ; Ishag et al., 2016; Parte et al., 2017).

I.2.3.3.Dégradation microbienne des pesticides à base de carbamate

Les carbamates sont utilisés pour lutter contre les insectes et les nématodes dans les sols. Leur toxicité pour les mammifères est très élevée bien qu'ils ne soient pas aussi persistants que les organochlorés. Plusieurs bactéries ont été identifiés en tant que dégradeurs de carbamates (Porto et al., 2011). La dégradation est principalement produite par l’hydrolyse de la liaison méthylcarbamate par une enzyme appelée carbofuranne hydrolase, codée par le gène mcd, situé sur un plasmide décrit pour la première fois chez Achromobacter sp (Jayabarath et al., 2010 ; Hmimou et al., 2014). Parmi les autres genres dégradants les carbamate à l'aide du carbofuran hydrolase on trouve P. putida, Mesorhizobium, Ralstonia, Rhodococcus, Ochrobactrum, Flavobacterium, Achromobacterium, Sphingomonas, Arthrobacter et Bacillus (Bondarenko et al., 2004;

Jayabarath et al., 2010; Chanika et al., 2011; Ortiz-Hernández et al., 2011 ; Parte et al., 2017).

I.2. 3.4. Dégradation microbienne des pesticides pyréthrinoïdes

Les principales voie de dégradation des pyréthrinoïdes par les microbes se déroule par l'hydrolyse

de la principale liaison ester. Cette réaction peut être réalisée par des carboxylesterases ou

phosphotriestérases (Guo et al., 2009). La dégradation bactérienne des ces derniers a été

documentée par Grant et Bettsen,(2004) qui ont décrit la capacité à dégrader ces pesticides

synthétiques par les isolats de Serratia et de Bacillus, d’Achromobacter et de P. fluorescens. Un

autre rapport intéressant montre la dégradation de l'alléthrine définit comme un pyréthrinoïde

récalcitrant par Acidomonas sp.

Partie II.

Matériel et Méthodes

Ce travail a été réalisé au Laboratoire de Microbiologie de l’Université de Jijel, durant la période Avril- Juin de l’année 2019.

II.1. Matériel

II.1.1. Souches bactériennes

Les neuf souches bactériennes utilisées dans cette étude ont été fournies par le laboratoire de recherche en Toxicologie Moléculaire-Université de Jijel. Ces dernières ont été isolées à partir des terres agricoles exposées en continu à l'application de pesticides.

II.1.2. Milieux de cultures

La réalisation de la partie pratique est basée sur l'utilisation de trois milieux de culture:



Milieu Minéral Minimum (MMM): ce milieu est utilisé pour effectuer les tests de biodégradation des pesticides (Tableau 3).

Tableau 3 : Composition du milieu minéral minimum.

Composition en gramme par litre

FeSO

4

0.013g

CaCl

2

0.013g

MgSO4 0.25g

KH

2

PO

4

7.5g

Na

2

HPO

4

5g

NH

4

NO

3

5g

Extrait de levure 0.25g Agar-agar (dans le cas de la gélose) 15g

Eau distillée 1000ml

pH 7± 0.2

Stérilisation par autoclavage 20 minutes à 120°C



Gélose nutritive (GN) et Bouillon nutritif (BN) ont été utilisés pour la revivification

des isolats bactériens.

II.1.3. Produits chimiques et réactifs utilisés



Les pesticides



Glyphosate (C

3H8NO5P):

nom commercial : Roundup commercialisé par Monsanto (Belgique).C'est un acide organique faible, analogue d'un acide aminé naturel, la glycine, doté d'un groupement phosphonate et qui présente un effet herbicide.



Coragèn (200 g/l de RynaXypyr): préparation liquide pour le contrôle durable des seuls insectes nuisibles dans les cultures d’arbres fruitiers à pépins et à noyau, de vigne, de maïs et de pomme de terre.



Les réactifs

-Violet de Gentiane, lugol, alcool et la fuschine utilisés pour la coloration de Gram -Eau oxygénée (H

2

O

2

) pour la réalisation du teste de la catalase

-La galerie biochimique (Api E 20) -Réactif de Voges- Proskauer (VP) -Réactif Kovac's

-Réactif TDA (Tryptophane désaminase) -Huile de paraffine

II.1.4. Appareillage

La réalisation de la partie pratique a nécessité ce qui suit:

Bec Bunsen, Etuve(Memmert), pH mètre(Hanna), Balance (Kern EMB 600-2), Plaque chauffante agitatrice (Heidolph MR 3001K), Bain marie (Gerhardt), Autoclave (Pbi Brand), Spectrophotomètre(JASCO), Agitateur incubateur (Infors HT Ecotron), Centrifugeuse (Hettich EBA 20°), Vortex (VWR VV3), Microscope, Balance analytique, Appareil à DBO

5

(Oxytop IS6), Oxymètre (Cyberscan WATERPROOF).

II.2. Méthodes

II.2.1. Purification des isolats bactériens

Les souches bactériennes ont été revivifiées par ensemencement sur gélose nutritive en utilisant

la méthode des stries, suivie d'une incubation à 37°C pendant 24h. La purification de colonies

obtenues se poursuit par repiquage sur le même milieu de culture jusqu'à l’obtention des colonies

pures. La pureté des colonies a été vérifiée par observation macroscopique à l’œil nu (la taille, la

forme, la couleur et l’aspect) et microscopique (coloration de Gram). A partir des cultures jeunes

de 18h, les colonies des bactéries isolées et purifiées sont ensemencées sur la gélose inclinée et sont incubées à 37°C pendant 24h puis conservées à 4°C.

II.2.2. Identification des souches



Cette étape a été effectuée en se basant sur les tests suivants :



La coloration de Gram a été réalisée en prélevant une colonie à partir des cultures pures pour chaque isolat et la disposé sur une lame contenant une goutte d'eau physiologique (préparation de frottis) et on procède à une coloration de Gram. Une observation microscopique a été effectuée (grossissement X100).



Recherche de la catalase : cette méthode consiste à prélever une colonie pour chaque isolat à l'aide d'une pipette Pasteur que l'on plonge ensuite dans un millilitre d'eau oxygénée (H

2

O

2

). Le dégagement de bulles gazeuses est un signe de la présence du catalase.



Galerie Api 20E: l’ensemencement se fait dans un tube contenant 5ml de bouillon nutritif additionné d'une colonie prélevée à l'aide d’une anse de platine à partir des pré- cultures de 18h incubées à 37°C préparées précédemment. L’inoculation des microtubes a été effectuée à l’aide d’une seringue stérile. La galerie Api 20E a été incubée à 37°C pendant 24h à 72h.

II.2.3. Préparation de l'inoculum bactérien

A partir de chaque culture bactérienne ensemencée sur gélose nutritive, des cultures jeunes de 18h ont été préparées dans des tubes contenant 10ml de bouillon nutritif. Après la période d'incubation à 37°C, une centrifugation a été effectuée à 45000 rpm durant 15min. Le surnageant est éliminé et le culot additionné de 2ml d'eau physiologique subit une deuxième centrifugation à 45000 rpm/5min. Ensuite, le culot est remis dans une suspension de 1ml de l'eau physiologique, les bactéries dans cet état vont servir d’inoculum pour les prochains tests de biodégradation (Cycoń et al., 2009).

II.2.4. Criblage des souches résistantes aux pesticides

Cette étape vise à sélectionner des souches bactériennes qui sont capables de croitre en présence

des pesticides, glyphosate et coragèn en tant que seule source de carbone et d’énergie. Les

solutions de pesticides utilisées sont préparées puis stérilisées par filtration sur membrane millipore (de 0,22 μm de porosité).



Sur MMM solide

La solution stérile de chaque pesticide à une concentration de 50mg/l est ajoutée au milieu MMM refroidi à 45°C. Les boites ainsi préparées sont ensemencées par des stries, puis incubées à 37ºC et elles sont observées quotidiennement pendant une durée de 96h. La croissance des souches bactériens est estimée nulle (-), faible (+), modérée (++) ou abondante (+++).



Sur MMM liquid

Pour chaque pesticide, le test a été effectué dans des tubes contenant 10ml de milieu MMM, ensemencé à 10% de l'inoculum en présence de 50mg/l du glyphosate et du coragèn. Des cultures exemptes de pesticides ont été utilisées comme témoins. Les tubes ont été incubés à 37°C pendant 96h dans un agitateur-incubateur à 150 rpm. Les cinétiques de croissance des différentes souches mis en culture ont été suivies durant la période d'incubation par mesure de la densité optique (DO) à une longueur d'onde de 660 nm à 0h, 72h et à 96h.

II.2.5. Effet de différentes concentrations de pesticides sur la croissance bactérienne

L’étude de la dégradation des pesticides a été réalisée en testant trois souches bactériennes (SB5, SB7 et SB8) sélectionnés montrant une meilleure croissance sur milieu MMM additionné de50 mg/l de pesticides testés. Ces souches sont également testées sur différentes concentrations de chaque pesticide (50mg/l, 100mg/l, 200mg/l, 400mg/let 800mg/l) dans des tubes contenant 10 ml de milieu MMM ensemencé par 10% de l'inoculum déjà préparé. Le tout est ensuite incubé à 37°C pendant 96h sous agitation (150 rpm/min). La densité optique est mesurée à 660 nm chaque 24h. Des témoins pour chaque souche ont été préparés pour chaque concentration (Moneke et al., 2010; Yu et al., 2015).

II.2.6. Etude de la dégradation des pesticides par la méthode de la DBO

5

La biodégradation de pesticides par la méthode de la DBO

5

a été réalisée par l’ensemencement

des flacons ambrés en verre hermétiquement fermés de 500ml contenant 100ml du milieu MMM

additionné d'une concentration de 50mg/ pour le glyphosate et de 800mg/l pour le coragèn

inoculés par une culture jeune de la souche bactérienne SB8 (10%)qui présente une meilleure

activité de biodégradation dans l'étude de l'évaluation de l'effet de la variation de la concentration

des pesticides. Les flacons ont été maintenus dans une enceinte thermostatée et ont été ensuite

incubés à température ambiante, pendant 5 jours sous agitation constante. La concentration de l'oxygène dissous est mesurée par un oxymètre au début et à la fin de la période d'incubation. La différence entre les deux valeurs mesurées constitue la DBO

5

(demande biochimique en oxygène à cinq jours). Les résultats sont exprimés en mg/l.

II.2.7. Optimisation de la croissance de la souche SB8

La souche bactérienne SB8 présentant une meilleure capacité de biodégradation des deux pesticides, glyphosate et coragèn dans les tests réalisés précédemment a été sélectionnée pour étudier ses caractéristiques optimales de croissance dont la température, le pH ainsi que la tolérance aux différentes concentrations de NaCl. Les tests ont été effectués en double et les conditions de cette expérimentation sont été résumées comme suit:



La température optimale de la croissance de la souche SB8a été déterminée par inoculation de 1ml d’une culture jeune préparée précédemment dans des tubes contenant 10ml de bouillon nutritif. Les températures testées étaient 28°C, 37°C et 44°C avec une période d’incubation de 24h.



Pour déterminer le pH optimal de la croissance de la souche SB8, une gamme de pH a été réalisée (de pH 4 à 9). Les tubes ont été incubés à 37°C pendant 24h.



Pour déterminer l’effet de la concentration du NaCl sur la croissance de la souche SB8, on a procédé à une inoculation de 1ml d’une culture jeune dans des tubes contenant 10ml de bouillon nutritif à différentes concentrations de NaCl (0,5%, 1%, 2%, 3% et 4%). Les tubes ont été incubés à 37°C pendant 24h.

Pour les trois paramètres étudiés, la croissance de la souche SB8 a été déterminée en mesurant la densité optique au début(T= 0h) et après la période d’incubation(T= 24h).

II.2.8. Facteurs influençant la biodégradation du glyphosate

Plusieurs facteurs peuvent influencer la croissance bactérienne en présence du glyphosate ont été

testés dans ce travail et qui sont résumés dans le Tableau 4. Pour un criblage, divers

composants du milieu ainsi que des facteurs environnementaux ont été évalués. Les différents

facteurs ont été préparés en deux niveaux, un pour le niveau bas et un pour le niveau haut, sur la

base d'un plan statistique de Plackett-Burman (Tableau 5). Cette conception est pratique, en

particulier lorsque l'enquêteur est confronté à un grand nombre d'acteurs et ne sait pas quels sont les paramètres qui sont susceptibles de produire des réponses optimales ou quasi optimales ( Sifour et al., 2010).

Tableau 4 : Composants du milieu et les niveaux testés de l’expérience Plakett- Burman.

Variable Code de variable Niveau bas (-1) Niveau élevé (+1)

Ph X1 5 7

Agitation X2 sans avec

[Pesticide] mg/l X3 50 100

Taux d’inoculum X4 8 12

Extrait de levure (g/l) X5 0.5 1

Na2 HPO4( g/l) X6 5 7

Période d’incubation (h) X7 48 72

Tableau 5 : Matrice de Plakett-Burman pour la biodégradation du glyphosate par Pseudomonas fluorescens SB8.

Facteurs X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7

Experiences

1 5(-1) avec(+1) 100(+1) 8(-1) 1(+1) 7 (+1) 48(-1)

2 5(-1) sans(-1) 100(+1) 12(+1) 0.5(-1) 7 (+1) 72(+1)

3 7(+1) sans(-1) 50(-1) 12(+1) 1(+1) 5(-1) 72(+1)

4 7(+) avec(+1) 50(-1) 8(-1) 1(+1) 7 (+1) 48(-1)

5 5(-1) avec(+1) 100(+1) 8(-1) 0.5(-1) 7 (+1) 72(+1)

6 7(+1) sans(-1) 100(+1) 12(+1) 0.5(-1) 5(-1) 72(+1)

7 7(+1) avec(+1) 50(-1) 12(+1) 1(+1) 5(-1) 48(-1)

8 5(-1) sans(-1) 50(-1) 8(-1) 0.5(-1) 5(-1) 48(-1)

II.2.9. Effet du glucose sur la biodégradation du pesticide

La souche bactérienne SB8 (10%) a été ensemencée dans des flacons de 200ml contenant 42ml de MMM additionné de 50mg/l de glyphosate et de 0.5g de glucose utilisé comme une source alternative de carbone.Parallèlement et dans les mêmes conditions, des flacons contenant le milieu MMM et le pesticide sans glucose ont été préparés, des flacons contenant le MMM et le glucose, et d’autres contenant seulement le MMM comme témoin. Les flacons ont été incubés à 37°C pendant 96h. Chaque 24h la densité optique a été mesurée à 660nm (Anwar et al., 2009).

II. 2.10. Calcul du taux de croissance

Pour calculer le taux de croissance nous avons utilisé l’équation suivante (Wei et al., 2009) :

Taux de croissance(𝛍) =

^𝟏

𝑫𝑶𝒐×^{(𝐃𝐎𝐭−𝐃𝐎𝐨)}

𝑻𝒕−𝑻𝒐

μ : Le taux de croissance

DO

t

: Densité optique dans une valeur du temps.

DO

0

: Densité optique du temps initial.

T

t

: Temps après l’incubation.

T

0

: Temps initial.

Partie III.

Résultats et Discussion

III. 1. Identification des souches bactériennes

Cette étape a permis une identification préliminaire des souches testées en se basant sur des tests morphologiques et biochimiques après 24h à 72h d’incubation à 37°C. Les résultats des tests obtenus sont résumés dans le Tableau 6 :

Selon le logiciel APIDENT utilisé pour l’identification numérique des BACILLES GRAM

NEGATIFS sur microgalerie API 20E nous pouvons probablement attribuer les souches SB6

et SB8 aux espèces Pseudomonas aeruginosa et Pseudomonas fluorescens avec un pourcentage

d’identification de 72% et 96% respectivement, alors que les souches SB3, SB4 et SB5 ont été

identifiés comme des Bacillus sp.