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Cartographie élémentaire du P et du K par fluorescence X : premiers résultats sur les échanges de P dans les racines ectomycorhizées

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Academic year: 2021

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Cartographie élémentaire du P et du K par fluorescence X : premiers résultats sur les échanges de P dans les

racines ectomycorhizées

Claude Plassard, Camille Rivard, Laurie Amenc, Carlos Trives Segura, B Lassalle

To cite this version:

Claude Plassard, Camille Rivard, Laurie Amenc, Carlos Trives Segura, B Lassalle. Cartographie élémentaire du P et du K par fluorescence X : premiers résultats sur les échanges de P dans les racines ectomycorhizées. 8. Journées Scientifiques et Techniques du Réseau des Microscopistes de l’INRA, Nov 2018, Theix, France. 2018. �hal-02735064�

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0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 20 40 60 80 100 120 140 P number of counts (x10 000) Cytosol (HN) Vacuole Vacuole Cytosol (FS) Cc Cx Cx Bkg Bkg P number of counts (x10 000) 0 100 200 300 400 500 600 0 30 60 90 120 150 Pixels noyau Cytosol Vacuole Vacuole Cytosol Cc Cx Cx Bkg Bkg fit

Les échantillons sont déplacés par rapport au faisceau focalisé pour balayer la zone d'intérêt et un spectre XRF est enregistré en chaque pixel de la carte.

Carte de co-localisation des éléments

Cartographie élémentaire

max

min

Cartographie élémentaire du P et du K par fluorescence X :

premiers résultats sur les échanges de P dans les racines ectomycorhizées

C. Plassard

1

, C. Rivard

2,3

, L. Amenc

1

, C. Trives

1

, B. Lassalle

3

claude.plassard@inra.fr camille.rivard@synchrotron-soleil.fr laurie.amenc@inra.fr 1. Eco&Sols, INRA-IRD-CIRAD-SupAgro, 34060 Montpellier

2. CEPIA, INRA, 44300 Nantes

3. Synchrotron SOLEIL, 91190 Gif-sur-Yvette

On sait que les champignons ectomycorhiziens (ECM) améliorent la nutrition de leur plante hôte en leur apportant des éléments limitants et

particulièrement le phosphore inorganique (Pi). Toutefois, les mécanismes moléculaires pilotant le transfert de Pi du champignon à la plante

hôte sont très peu connus. L’objectif de cette étude est de chercher à établir le rôle d’un transporteur de Pi fongique nommé HcPT2 car il est

un très bon candidat pour fonctionner comme un transporteur d’efflux de Pi dans l’association ectomycorhizienne entre Pinus pinaster et le

basidiomycète Hebeloma cylindrosporum. Pour remplir cet objectif, nous avons comparé la distribution du P dans les racines des plantes non

mycorhizées (NM) avec celles trouvées dans les ectomycorhizes associées à une souche fongique précédemment transformée avec un

vecteur de surexpression, soit ne contenant aucun gène (Ctrl) ou notre gène candidat (OE-PT2).

Contexte et objectif de l’étude

Rayon X Eexc Energi e continuum continuum M L 2. Transition électronique K 1. Ionisation Ka Kb Energie spécifique de la ré-émission X M L K Photo-électron

Principe de la spectrométrie de fluorescence X

 Détermination de la composition élémentaire

Rayons X Eexc

Détecteur dispersif en énergie

Intensité de fluorescence Fe Ca Cl P Informations qualitatives et quantitatives Échantillon hétérogène Spectre XRF

Cartographie élémentaire par micro-fluorescence X (µXRF) sur la ligne LUCIA

Culture des plantes et préparation des échantillons

Distribution de P et co-localisation avec K, Cl et Mg dans les racines de pin

Les cartes XRF sont enregistrées en utilisant un pixel de 3 x 3 µm² à 3,7 keV pour collecter le signal des éléments K, Cl, S, P, Si, Al et Mg.

Sur chaque carte élémentaire (Fig. 1) on peut distinguer plusieurs compartiments en fonction de la valeur du pixel : le fond (BKG), le cortex (CX), cylindre central (CC). Pour aller plus loin, nous avons tracé six profils avec ImageJ et extrait les valeurs de fluorescence X correspondant à P et K dans chaque pixel (Fig. 2). Dans les racines non mycorhizées (NM), on distingue les valeurs du cytosol et des vacuoles dans le cortex.

De façon intéressante, dans ectomycorhizes (ECM), on peut aussi distinguer le cytosol du manteau fongique

P

PyMCA (Solé et al. 2007)

P

S Cl

Fig. 1: Cartes de fluorescence du P et de co-localisation avec K, Cl et Mg

Conclusion

La cartographie des éléments sur les coupes racinaires nous permet de mieux comprendre les mécanismes biologiques à la base du fonctionnement de la symbiose. Ces

premières caractérisations des ectomycorhizes en utilisant la fluorescence X sur synchrotron sont en faveur du rôle central de HcPT2 dans l’efflux de P fongique dans le réseau de Hartig, contribuant à l’augmentation du P dans le xylème et le cylindre central à destination des parties aériennes de la plante.

S Cl

K Spectre XRF Fit des spectres XRF

Fig . 2 : Profil du P des cartes XRF

La présence du champignon augmente toujours la quantité de K et P des cellules de la racine par rapport aux racines NM. De façon remarquable, la surexpression de HcPT2 (OE-PT2) augmente spécifiquement le contenu en P dans le cylindre central et dans le cytosol des cellules corticales des ectomycorhizes. Ces résultats sont en faveur du rôle de HcPT2 dans le mécanisme d’efflux de P à partir des cellules fongiques dans le réseau de Hartig. In fine, cet efflux de P augmente la teneur en P dans le xylème vers les parties aériennes.

0 1 2 3 NM Ctrl OE-PT2 Cortex Cc K (%) 0 1 NM Ctrl OE-PT2 Cortex Cc P (%) 0 0,2 0,4 0,6 NM Ctrl OE-PT2 cytosol vacuolar K (%) 0 0,1 0,2 0,3 NM Ctrl OE-PT2 Cytosol Vacuolar P (%) ECM NM

Fig. 3 : Concentration des éléments calculées grâce aux profils K et P des cartes XRF

externe (FS) et des cellules fongiques appartenant au réseau de Hartig (HN).

En utilisant une référence (foie bovin NIST), les pourcentages de K et P ont été calculés dans les différentes cellules ou compartiments (Fig. 3).

Les plantes sont cultivées en tube pendant 2 mois, inoculées ou non avec des souches fongiques Ctrl ou OE-PT2. Une solution

nutritive contenant du nitrate (1 mM) et du Pi (0,1 mM) est régulièrement ajoutée pendant toute la culture. Les plantes sont

extraites des tubes et le système racinaire rincé dans l'eau. Les racines courtes sont coupées sous un stéréomicroscope, incorporées

dans un cryo protecteur et immédiatement plongées dans l’isopentane refroidi par de l’azote liquide pour fixer les cellules et leur

contenu. Des coupes cryo de 20 µm sont préparées à l'aide d'un cryotome et analysées au synchrotron SOLEIL sur la ligne de lumière

micro-focalisée LUCIA, équipée d'un cryostat à l’azote liquide.

Le synchrotron SOLEIL est remercié pour l’allocation du temps de faisceau , projet 20160232.

200 µm

K

Journées Scientifiques et Techniques du RµI 2018, INRA - ARA / Site de Theix

Références

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