UNIVERSITE HASSAN II – CASABLANCA Année Universitaire 2019-2020 FACULTE DES SCIENCES BEN M’SIK
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE CASABLANCA
TD D’ENZYMOLOGIE (S4)
Exercice 1
L’étude de la cinétique d’une réaction enzymatique montre que pour une concentration de substrat égale à 50µg/mL, la vitesse de la réaction est la moitié de la vitesse maximum. Est-il possible à partir de ces données de déterminer la constante de Michaelis ? On donne le PMsubstrat = 200
Exercice 2
Vous trouverez ci-dessous les résultats de l’analyse de l'activité d'une enzyme :
[S] (mol/L) v (mM/min)
5 x 10-2 0,25
5 x 10-3 0,25
5 x 10-4 0,25
5 x 10-5 0,2
5 x 10-6 0,07
5 x 10-7 0,01
Sans faire de graphe, déterminez : a) la constante Vmax;
b) la constante Km;
c) la vitesse initiale à [S] de 1 x 10-1M;
d) la quantité de produit formé au cours des 5 premières minutes à une [S] de 2 x 10-3M.
À une [S] de 2 x 10-6M?
e) Km et Vmax quand on augmente la [E] d'un facteur 4?
Exercice 3
Soit une enzyme à cinétique michaélienne. Les vitesses initiales (exprimées en µmoles de produit formées par minute et par millilitre de milieu réactionnel) en fonction de
concentrations variables en substrat sont données dans le tableau suivant :
2
[S] (10-2M) Vi (µmoles/min.mL)
1,25 1,80 2,50 4 8
33,5 41,5 50 62,5
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- Déterminer avec une méthode graphique précise les constantes cinétiques de cette enzyme. Exprimer-les en molarité.
- A concentration saturante en substrat :
- Quelles seraient les valeurs de ces constantes cinétiques si on doublait la quantité de l’enzyme ? Expliquer.
- Quelle serait la concentration de l’enzyme libre ? Expliquer.
- Donner la concentration du produit après 3min de réaction ?
- Les réactions enzymatiques sont effectuées dans un tube dont la concentration en protéines est de 0,2mg/mL. Calculer l’activité spécifique.
- Sachant que le taux de pureté de l’enzyme est de 40%, déterminer la constante catalytique de l’enzyme.
- On donne PME = 40 000
Exercice 4
L’invertase catalyse la réaction d’hydrolyse du saccharose en glucose et fructose. On veut déterminer l’influence de la concentration en enzyme sur la vitesse de réaction : on ajoute à un mélange comprenant 1 mL de tampon pH 7,0 et 1 mL de substrat à concentration saturante 1 mL de solution d’invertase pure de concentration variable. On mesure la quantité de produit apparu en fonction du temps :
[E]
10-6M
Glucose apparu (µmole/ml) Temps (min)
2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5 20
1 0,8 1,5 2,5 3,3 4,1 5,0 5,8 6,6
3 2,9 5,8 8,7 11,5 14,4 16,8 18,4 19,5
5,6 5,0 10,0 15,0 17,8 19,5 21,0 21,7 22,0
1. Tracer les courbes P = f (temps) et commenter
3
2. Calculer la vitesse initiale vi exprimée en µmoles/ml de glucose apparues par min pour chaque concentration d’enzyme. Tracer la courbe vi = f([E]) et donner vos interprétations des résultats.
3. Calculer la constante Kcat (k+2) de l’invertase ainsi que son activité spécifique sachant que sa masse molaire est de 250 000.
Exercice 5
La lactate déshydrogénase (E.C.1.1.1.27) catalyse la déshydrogénation du lactate. Son activité peut être appréciée par spectrophotométrie à 340 nm.
1. Ecrire l’équation de la réaction catalysée par la LDH. Donner le nom de la substance dosée à 340 nm et préciser l’évolution de l’absorbance à cette longueur d’onde lorsque le substrat de la réaction est le lactate. Justifier.
2. L’activité de la LDH peut être modifiée par action de l’oxalate. Des expériences effectuées en présence d’une même quantité de LDH, mais avec des concentrations croissantes de lactate, donnent les résultats suivants :
Concentration en lactate dans le milieu réactionnel
(mol/L)
vi en absence d’oxalate (unité arbitraire)
vi en présence d’oxalate (unité arbitraire)
2,5 x 10-3 0,0166 0,0100
5,0 x 10-3 0,0250 0,0166
7,5 x 10-3 0,0298 0,0215
10,0 x 10-3 0,0333 0,0250
Tracer, sur papier millimétré, les courbes 1/ v0i = f(1/[S])
En déduire le mode d’action de l’oxalate sur la LDH. Justifier la réponse
Exercice 6
Le foie du rat contient deux enzymes, l’hexokinase (HK) et la glucokinase (GK), capables de phosphoryler le glucose en présence de Mg2+ suivant la réaction :
Glucose + ATP Glucose-6-phosphate + ADP
On mesure la vitesse initiale (V1 pour HK, V2 pour la GK et V représente l’activité
Phosphorylante totale en fonction de la concentration en glucose. Les résultats, exprimés en UI par g de foie, sont reportés dans le tableau ci-dessous.
Glucose mM
0,05 0,1 0,5 1 5 10 15 150 500 1500 V1 (HK) 0,10 0,15 0,23 0,29 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 V2 (GK) 0,01 0,01 0,03 0,06 0,25 0,50 0,60 1,00 1,00 1,00 V = V1 + V2 0,11 0,16 0,26 0,35 0,55 0,80 0,90 1,30 1,30 1,30
- Déduire de ce tableau les constantes cinétiques Km et Vmax des deux enzymes.
4
- Sachant que la concentration intracellulaire hépatique de glucose est de 5 mM, calculer en pourcentage de Vmax, les vitesses initiales des réactions catalysées par les deux enzymes.
- On mesure l’activité phosphorylante totale V en présence de glucose-6-phosphate (G-6-P) à la concentration de 5 mM. On obtient les résultats suivants :
- pour [glucose] = 0,5 mM, V = 0,03 UI/g - pour [glucose] = 150 mM, V = 1,00 UI/g Qu’en déduisez-vous ?
- La cinétique de l’HK en absence ou en présence de G-6-P donne les résultats suivants en représentation de Lineweaver-Burk :
Qu’en déduisez-vous ?
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Vous trouverez ci-dessous la correction de la fin du TD d’enzymologie. J’ai repris en correction également l’exercice 4 pour bien préciser certaines notions importantes. J’ai
également joint à la correction certains rappels de cours à chaque fois que c’est nécessaire.
Bon travail et faites attention à vous.
Mme Souhaili
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CORRECTION
Exercice 4
1- Les courbes [P] = f(temps) représentent les cinétiques d’apparition du produit.
Rappel cours
Dans la courbe de cinétique [P] = f(temps) on observe trois parties :
• Une première partie qui peut être assimilée à une droite. La quantité de produit formé est proportionnelle au temps donc la vitesse de la réaction est constante parce que la concentration en substrat est très grande par rapport à la concentration en enzyme. Cette partie correspond à la phase stationnaire.
• Une deuxième partie qui correspond à un ralentissement de la formation du produit dans le temps
• Un plateau correspondant à l’arrêt de la production de produit car la réaction a atteint l’équilibre
Ce type de graphique permet de calculer la vitesse initiale de la réaction, exprimée en µmol/min.litre. Elle est calculée en prenant la tangente à l’origine qui est une droite et dont la pente donne la vitesse initiale. (Pour rappel : pente = (YB – YA)/(XB – XA).
Remarque : La courbe de cinétique [P] =f(temps) présente en générale la même allure que la courbe de saturation vi = f([S]). Donc il faut faire attention à ne pas les confondre
Les 3 courbes suivantes représentent la cinétique d’apparition du glucose en fonction du temps sous l’effet de l’invertase :
• Pour la courbe 1, à la [E] = 10-6 l’apparition du glucose est proportionnelle au temps pendant toute la durée de la mesure de l’activité enzymatique. A cette concentration en enzyme la phase stationnaire dure au moins 20 min.
• Pour la courbe 2 à la [E] = 3 10-6, on observe 2 parties :
o Une partie qui correspond à une droite où l’apparition du glucose est proportionnelle au temps : c’est la phase stationnaire qui dure 12,5 min
o A partir de 12,5 min, on note un infléchissement de la courbe qui correspond à un ralentissement de la formation du glucose dans le temps
• Pour la courbe 3, à la [E] = 5,6 10-6, on observe également 2 parties :
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o Une partie qui correspond à une droite où l’apparition du glucose est proportionnelle au temps : c’est la phase stationnaire qui dure 7,5 min
o A partir de 7,5 min, on note un infléchissement de la courbe qui correspond à un ralentissement de la formation du glucose dans le temps. A la fin de la réaction (entre 17,5 min et 20 min) on observe un grand ralentissement de la formation du glucose qui montre que la réaction a presque atteint l’équilibre.
• On note que plus la [E] augmente, plus la durée de la phase stationnaire est courte ; quand on augmente la [E], le substrat est transformé plus rapidement et on arrive plus rapidement à une phase où la concentration en glucose n’est plus très grande par rapport à la [E].
8 2- Calcul des vitesses initiales
[E] = 10-6
vi= YXB1−YA1
B1−XA1 YB1= 5,8 µmoles/ml YA1 = 5 µmoles/ml XB1= 17,5 min XA1= 15 min 𝑣𝑣𝑖𝑖= 5,8−5
17,5−15
vi = 0,32 µmoles/min.ml - [E] = 3.10-6
vi= YXB2−YA2
B2−XA2 YB2= 14,4 µmoles/ml YA2 = 11,5 µmoles/ml XB2= 12,5 min XA2= 10 min 𝑣𝑣𝑖𝑖= 14,4−11,5
12,5−10 vi = 1,16 µmoles/min.ml
- [E] = 5,6.10-6 vi= YXB3−YA3
B3−XA3 YB3= 10 µmoles/ml YA3 = 8 µmoles/ml XB3= 5 min XA3= 4 min 𝑣𝑣𝑖𝑖= 10−8
5−4 vi = 2 µmoles/min.ml
Remarque : Il est indiqué dans l’énoncé que les mesures des activités enzymatiques sont effectuées dans des conditions de concentration saturante en substrat ; donc les vitesses initiales mesurées correspondent à des vitesses maximales.
Tracé de la courbe vi = f([E]
[E] (10-6M) 1 3 5,6
Activités enzymatiques (µmoles/min.ml)
0,32 1,16 2
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La courbe obtenue est une droite donc l’activité enzymatique (Vmax) est proportionnelle à la [E]. Il existe une relation entre la Vmax et la [E] :
Vmax = k+2 [E]
qui montre bien la proportionnalité entre la Vmax et la [E]. Mais cette relation n’est vraie que si les mesures des activités enzymatiques sont faites à concentration saturante en substrat (ce qui est bien précisé dans l’énoncé)
- Calcul de la constante catalytique Vmax = k+2 [E] donc k+2= V[E]max
Si on prend Vmax = 2 µmoles/min.ml et [E] =5,6.10-6M Il faut effectuer une conversion pour utiliser les mêmes unités :
10
Vmax = 2000 µmoles/min. litre
= 2000 µM/min
= 2.10-3M/min
Donc k+2= 2.105,6.10−3 M/min−6 M = 357 min-1
k+2 = kcat= 357 min-1
Remarque : k+2 ou kcat correspond à l’activité moléculaire spécifique c'est-à-dire le nombre de molécules de substrat transformé ou de produit formé par une molécule enzymatique. k+2 constitue une caractéristique d’une enzyme dans des conditions expérimentales déterminées (température, pH, tampon…). Elle peut être calculée à partir de la Vmax et de [E]totale comme l’exemple de cet exercice ou bien à partir de l’activité spécifique, du poids moléculaire de l’enzyme et de degré de pureté de l’enzyme (Exemple de l’exercice 3).
En utilisant k+2 et la constante d’affinité KM (constante de Michaelis) on peut déterminer l’efficacité d’une enzyme par le rapport k+2 / KM.
Exercice 5
1- La réaction catalysée par la lactate déshydrogénase (LDH) est la suivante :
Lactate Pyruvate
La substance dosée à 340nm correspond au NADH. L’enzyme transforme le lactate en pyruvate en utilisant le NAD+ qui se transforme en NADH qui absorbe la lumière à 340nm.
Remarque : Dans cette réaction une molécule de lactate est transformée en une molécule de pyruvate et en même temps une molécule de NADH est formée. Donc en mesurant la concentration de NADH, nous pourrons mesurer en même temps la concentration du substrat transformé ou du produit formé. Il suffit d’utiliser la loi de Beer-Lambert
2- Pour trouver le mode d’action de l’oxalate sur la LDH, on doit tracer sur le même graphe les courbes 1/vi = f(1/S) en absence et en présence d’oxalate pour déterminer les valeurs de KM et Vmax et pouvoir en déduire l’effet de l’oxalate sur l’enzyme.
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Rappel cours : Détermination graphique des paramètres cinétiques KM et Vmax
Une première méthode consiste à tracer le graphique représentant les vi en fonction des concentrations en
substrat [S] utilisé. D’après l’équation de Michaelis, on peut en effet déduire que vi se rapproche asymptotiquement de Vmax lorsque [S] augmente.
Vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat La détermination graphique de l’asymptote, et donc de KM et Vmax est peu précise.
Par ailleurs, lorsque [S] = KM, vi est égale à Vmax/2. On peut donc déterminer graphiquement Vmax, puis KM (voir graphique).
La difficulté vient du fait que la détermination graphique d’une asymptote est une nécessairement imprécise, entrainant des erreurs dans la détermination de KM et Vmax.
Pour améliorer la précision de la détermination graphique de ces deux constantes, il existe des représentations graphiques qui linéarisent les résultats, permettant des extrapolations plus précises.
La méthode la plus connue est celle de Lineweaver et Burk dans laquelle on représente 1/vi=f(1/[S]).
𝑣𝑣𝑖𝑖
= 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 [𝑆𝑆]
𝐾𝐾𝑀𝑀+[𝑆𝑆]
↔ 1
𝑣𝑣𝑖𝑖 = 𝐾𝐾𝑀𝑀 + [𝑆𝑆]
𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 [𝑆𝑆]
↔ 1
𝑣𝑣𝑖𝑖 = 𝐾𝐾𝑀𝑀
𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 [𝑆𝑆] +
[𝑆𝑆]
𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 [𝑆𝑆]
↔ 1
𝑣𝑣𝑖𝑖= 𝐾𝐾𝑀𝑀
𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 1[𝑆𝑆] + 1 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚
On reconnaît une équation de droite de type 𝑣𝑣1
𝑖𝑖=𝑚𝑚[𝑆𝑆]1 + b avec 𝑚𝑚= 𝑉𝑉𝐾𝐾𝑀𝑀
𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 ce qui correspond à la pente de la droite et 𝑏𝑏= 𝑉𝑉1
𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 ce qui correspond à l’ordonnée à l’origine :
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Représentation de Lineweaver et Burk
e point correspond à une mesure de vi pour une concentration en substrat [S] donnée. Les intersections avec les axes permettent de déterminer graphiquement KM et V.
Cette représentation permet donc, à partir des mêmes données que précédemment, de déterminer graphiquement les valeurs de Vmax et de KM plus précisément qu’avec la représentation précédente.
- Tableau des valeurs de vi en fonction des concentrations de substrat [S]
(10-3M)
1/[S]
(10+3M-1)
vi en absence d’oxalate (unités arbitraires)
1/vi en absence d’oxalate (unités arbitraires)
vi en présence d’oxalate (unités arbitraires)
1/vi en présence d’oxalate (unités arbitraires)
2,5 0,40 0,0166 60,24 0,0100 100
5,0 0,20 0,0250 40 0,0166 60,24
7,5 0,133 0,029 34,48 0,0215 46,51
10 0,100 0,0333 30,03 0,0250 40
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Les courbes 1/vi = f(1/[S] se rencontrent en un point qui correspond à 1/Vmax. L’enzyme garde la même vitesse maximale en présence d’oxalate
1/Vmax = 20(unités arbitraires)-1 Vmax = 0,5 unité arbitraire En absence d’oxalate :
-1/KM = -0,2.10+3M-1 1/ KM = 0,2.10+3M-1
KM = 5.10-3 En présence d’oxalate :
-1/KM = -0,1.10+3M-1 1/ KM = 0,1.10+3M-1
KM = 10-2
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La valeur du KM est multipliée par 2, donc l’affinité est diminuée de moitié. On peut conclure que l’oxalate exerce un effet inhibiteur sur l’activité de la LDH ; c’est un inhibiteur compétitif (Vmax constante, KM augmente).
Rappel cours :
Les inhibiteurs enzymatiques soit sur le KM seul (inhibiteur compétitif), soit sur la Vmax (inhibiteur non compétitif) ou bien sur le KM et la Vmax en même temps (inhibiteur incompétitif). Les effets des inhibiteurs augmentent en fonction de leur concentration
- Dans le cas d’un inhibiteur compétitif, plus la [I] augmente, plus la valeur du KM augmente.
- Dans le cas d’un inhibiteur non compétitif, plus la [I] augmente, plus la valeur de Vmax diminue
- Dans le cas d’un inhibiteur incompétitif, plus la [I] augmente, plus les valeurs de Vmax et de KM diminuent (affinité augmente et l’activité diminue)
Pour un inhibiteur compétitif, le KI correspond à la [I] qui entraine une augmentation du KM d’un facteur de 2. Dans l’exercice ci-dessus la [oxalate] utilisée correspond au KI car cette concentration a provoqué la diminution de l’affinité (K’M = 2 KM)
Pour un inhibiteur non compétitif, le KI correspond à la [I] qui diminue de moitié la valeur de Vmax (V’max= Vmax /2).
Pour un inhibiteur incompétitif, le KI est égal à la [I] qui diminue la valeur de KM et de moitié la valeur de Vmax. Par ailleurs les valeurs de KI peuvent être calculées à partir des équations suivantes :
- Inhibition compétitive 𝐾𝐾′𝑀𝑀= 𝐾𝐾𝑀𝑀(1 + 𝐾𝐾𝐼𝐼
𝐼𝐼) K’M étant la constante de Michaelis en présence de l’inhibiteur.
- Inhibition non compétitive 𝑉𝑉′max = 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚
1+ 𝐼𝐼 𝐾𝐾𝐼𝐼
V’max étant la vitesse maximale en présence de I
- Inhibition incompétitive
𝐾𝐾𝑀𝑀′ = 1+ 𝐾𝐾𝑀𝑀𝐼𝐼 𝐾𝐾𝐼𝐼
et 𝑉𝑉′𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚= 1+ 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝐼𝐼 𝐾𝐾𝐼𝐼
Exercice 6
1) D’après le tableau, les vitesses initiales augmentent avec l’augmentation de la [Glucose] pour se stabiliser à une valeur fixe qui correspond la Vmax :
- Pour l’hexokinase Vmax = 0,3UI/g
La valeur de KM correspond à la concentration en substrat qui donne une vi = Vmax/2 Vmax/2 = 0,15 UI/g de foie
On obtient vi = 0,15UI/g à la [Glucose] = 0,1mM donc KM = 0,1mM
15 - Pour la glucokinase Vmax = 1UI/g de foie
Vmax/2 = 0,5UI/g de foie donc KM = 10mM 2) La concentration intracellulaire du glucose est de 5mM :
- Pour l’hexokinase : à 5mM l’enzyme possède, d’après le tableau, une vi = 0,3UI/g de foie ; cela représente 100%
de son activité maximale
- Pour la glucokinase : à 5mM l’enzyme possède, d’après le tableau, une vi = 0,25UI/g de foie ; cela représente 25% de son activité maximale.
o On mesure l’activité phosphorylante totale mais en présence de glucose-6-phosphate qui est le produit de la réaction. A la de glucose de 0,5mM, on obtient une vitesse de 0,03UI/g. D’après le tableau cette valeur correspond uniquement à l’activité de la glucokinase. A concentration saturante en substrat c’est- à dire [glucose]= 150mM la vi = 1UI/g. Là aussi on ne mesure que l’activité de la glucokinase. Tout se passe comme si en présence de G-6-P (le produit de la réaction) seule l’activité de la glucokinase est détectée et que le G-6-P agirait comme un inhibiteur de l’activité de l’hexokinase.
o La représentation de lineweaver-Burk de la cinétique de l’hexokinase en présence du G-6-P montre bien que ce dernier exerce un effet inhibiteur sur cette enzyme en diminuant la Vmax mais n’a pas d’effet sur le KM. Donc le G-6-P est bien un inhibiteur de type compétitif.
