Int CI ": C 07 K 3/08 A 61 K Inventeur: Tayot,J.L. 11 rue des G rémérés F La Tour de Salvagny(FR)

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Europâisches Patentamt European Patent Office Office européen des brevets

(121 DEMANDE DE BREVET E U R O P E E N

©Int CI ": C 07 K 3/08 A 61 K 37/14

@ Priorité: 07.07.83 FR 8311324

20.03.85 Bulletin 85/12

® Etats contractants désignés:

AT BE CH DE GB IT U LU NL SE

17, rue Bourgelat F-69002LYON(FR)

@ Inventeur: Tayot,J.L.

11 rue des G rémérés

F-69890 La Tour de Salvagny(FR)

@ Inventeur: Veron, Jean-Luc Bernard 3 Boulevard de Jomardière

F-38120 Saint EgrevelFR)

Cabinet Michel Lemoine 13 Boulevard des Batignolles F-75008Paris(FR)

On adsorbe sur du charbon actif une solution alcoolique è 80 % d'hémoglobine à pH proche de 3, à moins de 20°C sous agitation continue puis on sépare la solution de globine obtenue par centrifugation ou fiitration. La globine obtenue est totalement dépigmentée.

Croydon Printiog Company Ltd.

Procédé de préparation de globine à partir d'hémoglo- bine et globine obtenue par ce procédé.

On adsorbe sur du charbon actif une solution alcoolique à 80 % d'hémoglobine à pH proche de 3, à moins de 20°C sous agitation continue puis on sépare la solution de globine obtenue par centrifugation ou filtration. La globine obtenue est totalement dépigmentée.

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La p r é s e n t e i n v e n t i o n a t r a i t à un n o u v e a u p r o - c é d é de p r é p a r a t i o n de g l o b i n e à p a r t i r d ' h é m o g l o b i n e a i n s i q u ' à la g l o b i n e o b t e n u e p a r ce p r o c é d é .

Les t r a v a u x de A n s o n e t M i r s k y ( J . G e n .

P h y s i o l . 1 3 , 4 6 9 - 4 7 6 ) p u b l i é s en 1930 ont m o n t r é q u ' i l e s t p o s s i b l e de s é p a r e r le p i g m e n t de l ' h é m o g l o b i n e ( h è m e ) p a r la t e c h n i q u e d i t e à l ' a c é t o n e a c i d e . On a a i n s i d é j à

t r a n s f o r m é en g l o b i n e d i f f é r e n t e s h é m o g l o b i n e s h u m a i n e s ou a n i m a l e s . Deux v a r i a n t e s de ce p r o c é d é s o n t g é n é r a -

l e m e n t u t i l i s é e s à l ' é c h e l l e du l a b o r a t o i r e , t o u t e s d e u x b a s é e s sur la f a i b l e a f f i n i t é de l ' è h m e pour la g l o b i n e à pH a c i d e .

L ' u n des p r o c é d é s e s t la m é t h o d e à l ' a c é t o n e a c i d e ( v o i r par e x e m p l e ROSSI-FANELLI et c o l l . ( 1 9 5 8 ) B i o p h y s . B i o c h . A c t a 30, 6 0 8 - 6 1 5 . Ce p r o c é d é c o n s i s t e a j o u t e r un volume d ' h é m o g l o b i n e à 30 g / l à 2 0 à 30 v o - lumes d ' a c é t o n e à - 2 0 ° C c o n t e n a n t 3 ml d ' H C l 2N p a r

l i t r e , à a g i t e r à - 2 0 ° C p u i s c e n t r i f u g e r , le p r é c i p i t é d e

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g l o b i n e é t a n t r e d i s s o u s en eau et d i a l y s é c o n t r e de l ' e a u d i s t i l l é e .

C e t t e s o l u t i o n de g l o b i n e n ' e s t s t a b l e q u e l o r s q u e son pH r e s t e a c i d e de s o r t e q u ' i l a é t é p r o p o s é

(STRUMIA et c o l l . J. of Lab. and C l i n . M e d i c i n e ,

3 7 , 6 9 5 9 - 9 6 8 en 1951) une h y d r o l y s e d o u c e de la g l o b i n e à un pH a l c a l i n p e r m e t t a n t de r e n d r e la m o l é c u l e s o l u b l e à pH n e u t r e .

Le d e u x i è m e p r o c é d é e s t le p r o c é d é à la b u t a - n o n e - a c i d e s e l o n TEALE 1959 B i o c h . B i o p h y s . Acta 3 5 , 5 4 3 . La s u b s t i t u t i o n de l ' a c é t o n e par la b u t a n o n e , peu s o l u b l e dans l ' e a u , p e r m e t une s é p a r a t i o n r a p i d e en deux p h a s e s de l ' h è m e ( p h a s e c é t o n i q u e ) et de la g l o b i n e ( p h a s e a q u e u s e ) .

Ces d e u x p r o c é d é s ne se p r ê t e n t c e p e n d a n t pas à une a p p l i c a t i o n i n d u s t r i e l l e en r a i s o n des v o l u m e s c o n - s i d é r a b l e s de s o l v a n t s o r g a n i q u e s q u ' i l f a u d r a i t e m p l o y e r e t des r i s q u e s d ' a c c i d e n t s que c e l a e n t r a î n e . En o u t r e l a g l o b i n e f i n a l e o b t e n u e c o n t i e n t des q u a n t i t é s non n é g l i - g e a b l e s de r é s i d u s c h i m i q u e s d a n g e r e u x pour son u t i l i s a - t i o n a l i m e n t a i r e , d a n s le cas de la g l o b i n e a n i m a l e , o u t h é r a p e u t i q u e , d a n s le cas de la g l o b i n e h u m a i n e .

En c o n s é q u e n c e , on a d é j à p r o p o s é un c e r t a i n nombre d ' a u t r e s p r o c é d é s dans le b u t d ' o b t e n i r des g l o - b i n e s d ' o r i g i n e a n i m a l e pour des a p p l i c a t i o n s a l i m e n - t a i r e s .

La d e m a n d e de b r e v e t j a p o n a i s 5 5 . 0 0 8 2 6 1 d é p o s é e le 29 j a n v i e r 1980 p a r Y. SATO et S. HAYAKAWA p r o p o s e u n e a d s o r p t i o n s é l e c t i v e du p i g m e n t de l ' h é m o g l o b i n e à pH a c i d e avec de la CM c e l l u l o s e . Ce p r o c é d é é v i t e l ' u t i l i - s a t i o n d ' a l c o o l et de s o l v a n t s m a i s p r é s e n t e l ' i n c o n v é - n i e n t de ne pas d é c o l o r e r s u f f i s a m m e n t l ' h é m o g l o b i n e p o u r des a p p l i c a t i o n s t h é r a p e u t i q u e s , en r a i s o n de la t o x i c i t é de l ' h è m e .

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Le b r e v e t s o v i é t i q u e N ° 25 4 4 3 6 5 / 2 8 - 1 3 d u 8 a o û t 1977 d é p o s é par K.A. LOBUNETS d é c r i t une p r é p a - r a t i o n de g l o b i n e à u s a g e t h é r a p e u t i q u e à p a r t i r d ' u n h é m o l y s a t de g l o b u l e s r o u g e s h u m a i n s . Il s ' a g i t d ' u n t r a i t e m e n t u t i l i s a n t l ' e a u o x y g é n é e à c h a u d , ce q u i p r é - s e n t e l ' i n c o n v é n i e n t de g r a v e m e n t d é n a t u r e r la p r o t é i n e .

Dans 3 d e m a n d e s de b r e v e t s d é p o s é e s en S u è d e N° 67 4 0 7 8 8 2 - 5 du 14 j u i n 1 9 7 4 ,

N° 75 1 3 9 8 7 - 3 du 11 D é c e m b r e 1975 e t N° 80 0 2 5 9 1 - 9 du 3 a v r i l 1 9 8 0

P.G. LINDROOS propose d i f f é r e n t s t r a i t e m e n t s en s o l u t i o n alcoolique à pH acide à froid (voir brevet f r a n ç a i s n° 2 351 604). En fonction de l a

e t

n a t u r e / d e la c o n c e n t r a t i o n des sels a j o u t é s , la globine p r é c i p i t e ou r e s t e en s o l u t i o n de m a n i è r e s é l e c t i v e et e s t s é p a r é e d e s pigments qui s ' a g g l o m è r e n t . L ' a d d i t i o n d ' i m i d a z o l e ou de molécules a p p a - r e n t é e s f a c i l i t e c e t t e s é p a r a t i o n . C e p e n d a n t dans t o u s

l e s c a s , la g l o b i n e o b t e n u e e s t t r o p r i c h e en p i g m e n t s p o u r ê t r e u t i l i s a b l e en t h é r a p e u t i q u e .

Les p r o c é d é s v o i s i n s p r o p o s é s par P. ESPENAN dans le b r e v e t f r a n ç a i s N° 81 0 9 8 9 0 d u 14 mai 1981 ou p a r J . H . LUIJERINK dans le b r e v e t b r i t a n n i q u e N ° 1 . 9 7 7 . 2 7 8 d u

22 d é c e m b r e 1978 p r é s e n t e n t l e s mêmes i n c o n v é n i e n t s . Or, i l s e r a i t t r è s i n t é r e s s a n t de p o u v o i r d i s - p o s e r de q u a n t i t é s i m p o r t a n t e s de g l o b i n e p a r f a i t e m e n t d é p i g m e n t é e et non d é n a t u r é e , en p a r t i c u l i e r p o u r

l ' u t i l i s a t i o n t h é r a p e u t i q u e en t a n t que s u b s t i t u t d u p l a s m a , comme c e l a a d é j à é t é d i t d a n s :

SAMPLE et c o l l . The J. of Lab. and C l i n . M e d i c i n e ( 1 9 5 2 ) , 40,2 2 0 6 - 2 1 0

STRUMIA e t c o l l . The J. of Lab and C l i n . M e d i c i n e ( 1 9 5 2 ) , 40,2 2 1 1 - 2 2 2 .

La p r é s e n t e i n v e n t i o n se p r o p o s e donc de r e m é - d i e r à ces i n c o n v é n i e n t s et de f o u r n i r un n o u v e a u p r o c é d é de p r é p a r a t i o n de g l o b i n e à p a r t i r d ' h é m o g l o b i n e qui p e r - m e t t e dans des c o n d i t i o n s i n d u s t r i e l l e s , d ' o b t e n i r , d e

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f a ç o n é c o n o m i q u e , une g l o b i n e e x t r ê m e m e n t p u r i f i é e et p e u ou pas d é n a t u r é e .

C ' e s t en p a r t i c u l i e r un o b j e t de l ' i n v e n t i o n que de f o u r n i r un t e l p r o c é d é p e r m e t t a n t la f a b r i c a t i o n i n d u s t r i e l l e de g l o b i n e s u t i l i s a b l e s en t h é r a p e u t i q u e .

Un a u t r e o b j e c t i f e s t de f o u r n i r un p r o c é d é q u i s o i t u t i l i s a b l e pour l ' o b t e n t i o n de g l o b i n e à p a r t i r

d ' h é m o g l o b i n e p r o v e n a n t de s o u r c e s t r è s d i f f é r e n t e s p o u - v a n t ê t r e n o t a m m e n t :

- sang h é m o l y s é p l a c e n t a i r e h u m a i n ; - a u t r e sang h é m o l y s é h u m a i n ;

- b a n q u e s du s a n g ;

- sang a n i m a l en p r o v e n a n c e d ' a b a t t o i r s .

Un a u t r e o b j e c t i f e s t de p e r m e t t r e de r é a l i s e r des g l o b i n e s a l i m e n t a i r e s à p a r t i r d ' h é m o g l o b i n e s a n i - m a l e s .

L ' h é m o g l o b i n e à t r a i t e r p e u t se p r é s e n t e r s o u s f o r m e n a t i v e (par e x e m p l e c u l o t s g l o b u l a i r e s h é m o l y s é s ) , s o u s f o r m e p u r i f i é e non d é n a t u r é e ( p a r e x e m p l e p a r

c h r o m a t o g r a p h i e par é c h a n g e d ' a n i o n s d ' u n s a n g

p l a c e n t a i r e c l a r i f i é ) , ou e n c o r e s o u s f o r m e de p r é c i p i t é d é n a t u r é (par e x e m p l e par p r é c i p i t a t i o n s é l e c t i v e a u c h l o r o f o r m e ou au c a p r y l a t e de s o d i u m - v o i r LIAUTAUD e t c o l l . D e v e l o p m e n t s in B i o l o g i c a l S t a n d a r d i z a t i o n Vol. 27 1974 p a g e s 1 0 7 - 1 1 4 ; ou b i e n STEINBUCH et c o l l . R e v u e

F r a n ç . é t u d e s chim. e t B i o l . 1969, XIV, 10, p a g e s 1054-1058).

L ' i n v e n t i o n a pour objet un procédé de préparation de globine à p a r t i r d'hémoglobine dans lequel on p r é p a r e une s o l u t i o n a l c o o - lique d'hémoglobine à pH acide, c a r a c t é r i s é en ce que l'on adsorbe s u r le charbon a c t i f une s o l u t i o n alcoolique d'hémoglobine à pH acide à pH acide, de préférence à température a m b i a n t e .

De façon s u r p r e n a n t e le charbon a c t i f , alors q u ' i l e s t connu pour adsorber fortement les p r o t é i n e s , fixe l'hèms et n ' a d s o r - be pas la globine. Le rendement en globine est proche de 100 %.

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De p r é f é r e n c e , la c o n c e n t r a t i o n d ' a l c o o l , t e l que p a r e x e m p l e de l ' é t h a n o l ou du m é t h a n o l , e s t d ' a u m o i n s 40 % et de p r é f é r e n c e de 75 à 80 %.

Dans le cas où l ' h é m o g l o b i n e e s t d i s p o n i b l e s o u s f o r m e d ' u n p r é c i p i t é , i l e s t a v a n t a g e u x de l a

r e p r e n d r e en s o l u t i o n à e n v i r o n 10 % ( p o i d s / v o l u m e ) . L a r e p r i s e p e u t par e x e m p l e s ' e f f e c t u e r p a r a d d i t i o n d ' e a u

(20 % du v o l u m e t o t a l ) , a c i d i f i c a t i o n par HCl 3N p u i s a d d i t i o n des 80 % d ' é t h a n o l .

De p r é f é r e n c e , le pH a c i d e e s t i n f é r i e u r à 4 e n é t a n t de p r é f é r e n c e s u p é r i e u r à 2, par e x e m p l e v o i s i n de 3. L o r s q u e le pH a u g m e n t e , n o t a m m e n t au d e l à de 4, l e c h a r b o n a c t i f commence à a d s o r b e r des q u a n t i t é s non n é - g l i g e a b l e s de p r o t é i n e s . De même p o u r des pH t r o p a c i d e s , le t a u x de p r o t é i n e s r é c u p é r é e s b a i s s e , une d é n a t u r a t i o n de la g l o b i n e é t a n t é g a l e m e n t à c r a i n d r e .

Le c h o i x du c h a r b o n a c t i f s ' e f f e c t u e e n

m e s u r a n t le p o u v o i r de d é c o l o r a t i o n de l ' h é m o g l o b i n e . Ce ' p o u v o i r e s t e s t i m é d a n s le r a p p o r t R = D.O. 280 n m / D . O .

403 nm. Ce r a p p o r t e s t de 0,26 pour l ' h é m o g l o b i n e n o n d é p i g m e n t é e . Les c h a r b o n s a c t i f s en p o u d r e s o n t p a r t i c u - l i è r e m e n t p r é f é r é s et le t a b l e a u a p p a r a i s s a n t d a n s l a d e s c r i p t i o n f o u r n i r a l e s e x e m p l e s des c h a r b o n s c o m m e r - c i a u x a c t u e l l e m e n t d i s p o n i b l e s qui d o n n e n t de t r è s b o n s r é s u l t a t s .

De p r é f é r e n c e , on u t i l i s e une q u a n t i t é de c h a r - bon a c t i f o p t i m a l e a u s s i f a i b l e que p o s s i b l e p o u r m i n i - m i s e r l e s m a n i p u l a t i o n s . Le r a p p o r t du p o i d s de c h a r b o n p a r r a p p o r t au p o i d s d ' h é m o g l o b i n e v a r i e s e l o n q u e

l ' h é m o g l o b i n e e s t à l ' é t a t n a t i f en s o l u t i o n ou d é n a t u r é sous forme de p r é c i p i t é . I l a u g m e n t e dans ce d e r n i e r c a s et p e u t ê t r e par e x e m p l e de l ' o r d r e de 3 g de c h a r b o n pour 10 g de p r é c i p i t é d ' h é m o g l o b i n e .

Le temps de c o n t a c t e s t de p r é f é r e n c e d e

l ' o r d r e de 15 h e u r e s . Ce temps p e u t g r a n d e m e n t v a r i e r e t

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e s t d é t e r m i n é n o t a m m e n t p a r des c o n s i d é r a t i o n s i n d u s t r i e l - l e s de p r o d u c t i o n a i n s i que de t a i l l e et de nombre d e c u v e s .

La f o r c e i o n i q u e e s t a j u s t é e à une v a l e u r a s s e z f a i b l e , par e x e m p l e i n f é r i e u r e à NaCl 0,03 M.

La t e m p é r a t u r e n ' e s t de p r é f é r e n c e pas s u p é - r i e u r e à 20°C a f i n d ' é v i t e r l e s v a p e u r s d ' a l c o o l pour d e s r a i s o n s de s é c u r i t é .

De f a ç o n p a r t i c u l i è r e m e n t a v a n t a g e u s e , on p e u t p r o c é d e r à une a g i t a t i o n p e n d a n t t o u t e la p é r i o d e de c o n - t a c t , l ' a g i t a t i o n a u g m e n t a n t s e n s i b l e m e n t le r e n d e m e n t .

L ' i n v e n t i o n a é g a l e m e n t t r a i t aux g l o b i n e s i n - d u s t r i e l l e s p u r i f i é e s o b t e n u e s . L ' i n d i c e de d é c o l o r a t i o n D.O. 280 nm/D.O. 403 nm p e u t ê t r e s u p é r i e u r à 10 et l a g l o b i n e h u m a i n e e s t a p t e aux a p p l i c a t i o n s t h é r a p e u t i q u e s .

D ' a u t r e s a v a n t a g e s et c a r a c t é r i s t i q u e s de l ' i n - v e n t i o n a p p a r a î t r o n t à la l e c t u r e de la d e s c r i p t i o n s u i - v a n t e f a i t e à t i t r e d ' e x e m p l e non l i m i t a t i f .

E x e m p l e 1

Un p r é c i p i t é d ' h é m o g l o b i n e d é n a t u r é e e s t o b t e n u à p a r t i r de sang h é m o l y s é p l a c e n t a i r e par p r é c i p i t a t i o n au c h l o r o f o r m e . L e p r é c i p i t é e s t r e p r i s par a d d i t i o n d ' e a u (20 % du v o l u m e t o t a l ) , p u i s a c i d i f i c a t i o n par HCl 3N, a p r è s q u o i on a j o u t e l ' é t h a n o l n é c e s s a i r e p o u r o b t e - n i r une c o n c e n t r a t i o n à 80 %. Le volume le p l u s f a i b l e p o u r o b t e n i r l a r e d i s s o l u t i o n c o r r e s p o n d à une r e p r i s e à 10 % ( p o i d s / v o l u m e ) ; c ' e s t ce v o l u m e qui e s t p r é f é r é p u i s q u ' i l e n t r a î n e la p l u s f a i b l e c o n s o m m a t i o n d ' a l c o o l . La f r a c t i o n i n s o l u b l e e s t d ' e n v i r o n 33 % du p r é c i p i t é i n i t i a l (dans le cas d ' u n p r é c i p i t é au c a p r y l a t e de s o - dium, le t a u x de r e p r i s e e s t de 6 % et la f r a c t i o n i n s o - l u b l e r e s t a n t e de 25 % du p r é c i p i t é i n i t i a l ) .

Le pH de la s o l u t i o n d ' h é m o g l o b i n e e s t a j u s t é à 3 , 3 .

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Le c h a r b o n a c t i f c h o i s i e s t le c h a r b o n t y p e L 4S p r é p a r é par la s o c i é t é de n a t i o n a l i t é f r a n ç a i s e CECA.

On a j o u t e à la s o l u t i o n d ' h é m o g l o b i n e à 20°C l e c h a r b o n a c t i f à r a i s o n de 3 g pour 10 g de p r é c i p i t é

d ' h é m o g l o b i n e i n i t i a l (3,4 g pour 10 g dans le cas d u p r é c i p i t é au c a p r y l a t e ) .

Le m é l a n g e e f f e c t u é dans une c u v e , e s t a g i t é e n c o n t i n u p e n d a n t 15 h e u r e s , le pH a p p a r e n t é t a n t de 3 , 3 .

On é v a c u e e n s u i t e le c h a r b o n par c e n t r i f u g a - t i o n . La s o l u t i o n a l c o o l i q u e de g l o b i n e qui forme le s u r - n a g e a n t e s t e n s u i t e d i l u é e dans un v o l u m e é g a l d ' e a u e t n e u t r a l i s é e par a d d i t i o n de soude N. Après p r é c i p i t a t i o n e t r é c u p é r a t i o n du p r é c i p i t é de g l o b i n e par c e n t r i f u g a - t i o n ou f i l t r a t i o n , on n o t e q u e le l i q u i d e o b t e n u e s t p a r f a i t e m e n t l i m p i d e et i n c o l o r e e t se p r ê t e p a r f a i t e m e n t aux o p é r a t i o n s de r e c y c l a g e de l ' a l c o o l par d i s t i l l a t i o n .

Le p r é c i p i t é de g l o b i n e p e u t ê t r e e n s u i t e t r a n s f o r m é en s o l u t i o n de g l o b i n e p a r f a i t e m e n t d é c o l o r é e

d e s

p a r / p r o c é d é s d é j à c o n n u s . E x e m p l e 2

A p a r t i r d ' u n e s o u r c e p u r i f i é e d ' h é m o g l o b i n e , p a r e x e m p l e de l ' h é m o g l o b i n e de s a n g h é m o l y s é p l a c e n t a i r e d o n t on a e x t r a i t l e s i m m u n o g l o b u l i n e s , l ' a l b u m i n e e t é v e n t u e l l e m e n t d ' a u t r e s c o m p o s a n t s p l a s m a t i q u e s , ou e n - c o r e à p a r t i r d ' u n e s o l u t i o n d ' h é m o g l o b i n e o b t e n u e p a r l y s e d ' u n c u l o t , on e f f e c t u e une r e p r i s e de l ' h é m o g l o b i n e d a n s un m é l a n g e é t h a n o l - a c i d e de f a ç o n q u ' e n f i n d ' a d d i - t i o n le t a u x d ' é t h a n o l s o i t de 80 % et le pH a p p a r e n t d e 3 , 1 . Aucun p r é c i p i t é n ' a p p a r a î t et la s o l u t i o n d ' h é m o g l o - b i n e e s t p a r f a i t e m e n t l i m p i d e .

On a j o u t e à la s o l u t i o n 0 , 2 % en p o i d s / v o l u m e de c h a r b o n a c t i f L4S. On a g i t e le m é l a n g e p e n d a n t 15 h e u - r e s à une t e m p é r a t u r e de 20°C. On é l i m i n e e n s u i t e l e

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c h a r b o n a c t i f par f i l t r a t i o n , par e x e m p l e à l ' a i d e d e t e r r e f i l t r a n t e ou e n c o r e par c e n t r i f u g a t i o n .

La s o l u t i o n a l c o o l i q u e de g l o b i n e a c i d e q u i a p p a r a î t e s t c o m p l è t e m e n t d é c o l o r é e . E l l e e s t e n s u i t e d i l u é e avec un volume é g a l d ' e a u et n e u t r a l i s é e par a d d i - t i o n de s o u d e n o r m a l e . A p r è s p r é c i p i t a t i o n et r é c u p é r a - t i o n du p r é c i p i t é de g l o b i n e par c e n t r i f u g a t i o n ou f i l - t r a t i o n , on c o n s t a t e que le l i q u i d e o b t e n u e s t p a r f a i t e - ment l i m p i d e et i n c o l o r e et se p r ê t e p a r f a i t e m e n t a u x o p é r a t i o n s de r e c y c l a g e de l ' a l c o o l p a r d i s t i l l a t i o n .

La g l o b i n e o b t e n u e e s t t o t a l e m e n t d é p i g m e n t é e e t p e u t ê t r e t r a n s f o r m é e en d é r i v é s t h é r a p e u t i q u e s p a r d e s p r o c é d é s d é j à d é c r i t s .

C o m p a r a i s o n des c h a r b o n s a c t i f s

Les c h a r b o n s a c t i f s en p o u d r e s u i v a n t s ont é t é e s s a y é s .

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L ' e f f i c a c i t é c o m p a r é e de ces c h a r b o n s a c t i f s a p p a r a î t dans le t a b l e a u s u i v a n t , en é t a n t d é t e r m i n é e p a r l ' i n d i c e R.

Le c h a r b o n L 4S a p p a r a î t comme le p l u s i n d i q u é . La q u a n t i t é de c h a r b o n e s t a v a n t a g e u s e m e n t de l ' o r d r e d e 3 g pour 10 g de p r é c i p i t é d ' h é m o g l o b i n e et de p r é f é r e n c e i n f é r i e u r e à 6 g .

A t i t r e d ' e x e m p l e , u n e q u a n t i t é de 10 t o n n e s d e p l a c e n t a s p e u t f o u r n i r :

- s o i t e n v i r o n 2,5 t o n n e s de p r é c i p i t é

d ' h é m o g l o b i n e d é n a t u r é e p a r le c h l o r o f o r m e o u le c a p r y l a t e de s o d i u m ,

- s o i t e n v i r o n 250 kg d ' h é m o g l o b i n e en s o l u t i o n a q u e u s e .

Ces d o n n é e s c h i f f r é e s du p r o c é d é p r é f é r e n t i e l s o n t r é s u m é e s d a n s le t a b l e a u f i n a l :

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1) P r o c é d é de p r é p a r a t i o n de g l o b i n e à p a r t i r d ' h é m o g l o b i n e dans l e q u e l on p r é p a r e une s o l u t i o n a l c o o l i - que d ' h é m o g l o b i n e à pH a c i d e , c a r a c t é r i s é en ce que l ' o n a d s o r b e c e t t e s o l u t i o n sur le c h a r b o n a c t i f .

2) P r o c é d é s e l o n la r e v e n d i c a t i o n 1, c a r a c t é r i s é en ce que la c o n c e n t r a t i o n en a l c o o l e s t d ' a u moins 40 %.

3) P r o c é d é s e l o n la r e v e n d i c a t i o n 2, c a r a c t é r i s é en ce que la c o n c e n t r a t i o n en a l c o o l e s t de 75 à 80 %.

4) P r o c é d é s e l o n l ' u n e q u e l c o n q u e des r e v e n d i - c a t i o n s 1 à 3, c a r a c t é r i s é en ce que l ' o n u t i l i s e d e l ' é t h a n o l .

5) P r o c é d é s e l o n l ' u n e q u e l c o n q u e des r e v e n d i - c a t i o n s 1 à 4, c a r a c t é r i s é en ce que le pH e s t c o m p r i s e n t r e 2 et 4 .

6) P r o c é d é s e l o n l a r e v e n d i c a t i o n 5, c a r a c t é r i s é en ce que le pH e s t de l ' o r d r e de 3 .

7) P r o c é d é s e l o n l ' u n e q u e l c o n q u e des r e v e n d i - c a t i o n s 1 à 6, c a r a c t é r i s é en ce que le p o i d s de c h a r b o n a c t i f e s t i n f é r i e u r à 6 g / 1 0 g de p r é c i p i t é d ' h é m o -

g l o b i n e .

8) P r o c é d é s e l o n la r e v e n d i c a t i o n 7, c a r a c t é r i s é en ce que le p o i d s de c h a r b o n e s t de l ' o r d r e de 3 g/10 g de p r é c i p i t é d ' h é m o g l o b i n e .

9) P r o c é d é s e l o n l ' u n e q u e l c o n q u e des r e v e n d i - c a t i o n s 1 à 6, c a r a c t é r i s é en ce que le p o i d s de c h a r b o n e s t de l ' o r d r e de 0,2 % ( p o i d s / v o l u m e ) p o u r une s o l u t i o n d ' h é m o g l o b i n e n a t i v e .

10) P r o c é d é s e l o n l ' u n e q u e l c o n q u e des r e v e n d i - c a t i o n s 1 à 9, c a r a c t é r i s é en ce que le c h a r b o n a c t i f e s t un c h a r b o n en p o u d r e .

11) P r o c é d é s e l o n la r e v e n d i c a t i o n 10, c a r a c t é r i s é en ce que l ' o n u t i l i s e le c h a r b o n a c t i f CECA du t y p e

L 4 S .

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12) P r o c é d é s e l o n l ' u n e q u e l c o n q u e des r e v e n d i - c a t i o n s 1 à 11, c a r a c t é r i s é en ce que l ' o n a g i t e le m é l a n g e p e n d a n t l ' a d s o r p t i o n .

13) P r o c é d é s e l o n l ' u n e q u e l c o n q u e des r e v e n d i - c a t i o n s 1 à 12, c a r a c t é r i s é en ce que l ' o n s é p a r e e n s u i t e le c h a r b o n de la g l o b i n e par c e n t r i f u g a t i o n ou

f i l t r a t i o n .

14) P r o c é d é s e l o n l ' u n e q u e l c o n q u e des r e v e n d i - c a t i o n s 1 à 13, c a r a c t é r i s é en ce que l ' a d s o r p t i o n d u r e une q u i n z a i n e d ' h e u r e s .

15) P r o c é d é s e l o n l ' u n e q u e l c o n q u e des r e v e n d i c a - t i o n s 1 à 14, c a r a c t é r i s é en ce q u ' i l e s t mis en o e u v r e à une t e m p é r a t u r e de l ' o r d r e de 20° C.

16) P r o c é d é s e l o n l ' u n e q u e l c o n q u e des r e v e n d i c a - t i o n s 1 à 15, c a r a c t é r i s é en ce que la f o r c e i o n i q u e e s t a j u s t é e à une v a l e u r a s s e z f a i b l e , n o t a m m e n t i n f é r i e u r e à NaCl 0,03 M.

17) G l o b i n e o b t e n u e par le p r o c é d é s e l o n l ' u n e q u e l c o n q u e des r e v e n d i c a t i o n s 1 à 16, c a r a c t é r i s é e e n ce q u ' e l l e e s t d é p i g m e n t é e , avec un r a p p o r t

R = D.O. 280 nm/D.O. 403 nm s u p é r i e u r à 1 0 .

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