Résumé :La leucemie myéloïde chronique (Lnc) une anomalie de la cellule souche multipotente caractérisée par une prolifération clonale granuleuse à maturation morphologique. L’anomalie cytogénétique acquise de a leucémie myéloïde chronique, nommée chromosome philadelphie (Ph), témoigne d’une translocation réciproque entre les chromosomes 9 et 22 : t(9 ;21) (q34.1;q11.2).
Le développement de l’hématologie moléculaire est une des principales avancées pour la prise en charge diagnostique et thérapeutique des hémopathies malignes. Les applications de ces techniques sont principalement le diagnostic, le suivi thérapeutique de la maladie résiduelle et la détection précoce des rechutes. Dans ce travail, nous proposons une mise au point sur les anomalies moléculaires en insistant sur la majoration de l’activité tyrosine kinase. L’industrie pharmaceutique a développé un inhibiteur de la tyrosine kinase appelé, Imatinib (STI571,GLIVEC) capable d’entraîner un arrêt de prolifération des cellules leucémiques.
Mots-clés :gène et protéine chimériques, inhibiteur de la tyrosine kinase, leucémogénèse.
Mécanismes moléculaires de la leucèmie myéloïde chronique
Molecular mechanisms of chronic myelogenous leukaemia
A. Masrar, N. Benkirane Agoumi.
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Tiré à part : A. Masrar, Laboratoire d'Hématologie, Hôpital Ibn Sina , CHU de Rabat Maroc.
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Abstract : Chronic myelogenous leukaemia is a clonal disorder of the pluripotent hematopoietic stem cell characterised by reciprocal chromosomal translocation, Ph chromosome.
Molecular haematology development is one stage of the progress in diagnostic and therapeutic care of malignant hemopathic. In this review, we report the molecular mechanisms of chronic myelogenous leukaemia that include chimerics gene and protein. The deregulated tyrosine kinase activity gives excessive proliferation. Inhibition of the expression of the tyrosine kinase by Imatinib (STI571, GLIVEC) is therapeutic manoeuvre.
Key-word :chimerics gene and protein, genesis of leukaemia, tyrosine kinase inhibitor.
Introduction
L’anomalie cytogénétique acquise de la leucémie myéloïde chronique, nommée chromosome Ph, témoigne d’une translocation réciproque entre les chromosomes 9 et 22 qui est révelée dans plus de 90% de cas de leucémies myéloïdes chroniques[1]. Cette translocation entraîne la production du gène chimérique bcr-abl qui est retrouvé dans presque 100% des cas [1]. L’objectif de ce travail est de mettre le point sur les anomalies moléculaires de la leucémie myéloïde chronique et sur la stratégie thérapeutique actuelle de la maladie.
Anomalies moléculaires de la LMC
L’anomalie cytogénétique acquise de la leucémie myéloïde chronique [1] correspond à une translocation réciproque entre les chromosomes 9 et 22. Il se produit une fusion du matériel entre le proto-oncogène abl en 9q34 et le gène bcr (breakpoint cluster region) en 22q11. Ces deux gènes ont été clonés et séquencés [2,3].
Le gène chimérique bcr-abl : (Figure 1)
Le gène bcr impliqué dans la translocation se localise au niveau de la bande centrométrique du bras long du chromosome 22 (22q11) et s’étend sur 135kb. La partie codante se répartie en 23 exons. Les exons e12 à e16 du Mbcr (Major breakpoint cluster region) correspondent dans l’ancienne nomenclature aux exons b1 à b5 du gène bcr [4].
Ce gène est transcrit en deux types principaux d’ARNm de 4,5 et 6,7 kb. Le deuxième gène de la translocation est l’abl
qui est l’homologue humain de l’oncogène viral (v-abl) à l’origine de la leucémie mûrine d’Abelson, il se localise au niveau de la région télomérique du bras long du chromosome 9 (9q34) et comporte 11 exons qui sont transcrits en deux ARNm de 6 et 7kb obtenus par utilisation alternative des exons Ib ou Ia. Ces ARN sont transcrits après activation de deux promoteurs différents [5,6].
Les points de coupure dans le gène abl peuvent se faire en amont du premier exon alternatif Ib, en aval du second exon alternatif Ia ou le plus fréquemment, entre les deux (figure1). L’une des données, la plus surprenante, est l’excision de l’exon 1 après maturation du RNA chimérique primaire.
Le mécanisme de ce splicing est inconnu à l’heure actuelle [6]. Par conséquent, le gène abl sera engagé par son exon a2 dans le gène chimérique. Cependant, les points de coupure du gène bcr peuvent avoir lieu dans trois régions différentes. Dans la majorité des cas de LMC, la recombinaison intéresse une région des exons 12 à 16, elle définie le Mbcr représenté par les transcrits b2a2 ou b3a2.
Dans des cas rares de LMC caractérisés par une monocytose, le point de coupure intéresse une région des exons e’2 à e2, le résultat de la recombinaison est le transcrit e1a2 appelé mbcr (minor bcr). Récemment, un troisième point de coupure associé à la leucémie neutrophile chronique Ph positive (forme rare de LMC) entraîne la formation du transcrit e19a2 appelé mbcr [6,7]. Enfin, d’autres recombinaisons sporadiques ont été rapportées: b2a3, b3a3, e1a3 [8], e6a2 [9]
ou e2a2 [10].
La protéine chimérique bcr-abl
Les deux transcrits du gène abl donnent naissance à deux protéines de 145 KD qui ne différent que par leur partie N- terminale (Ib et Ia). Ces deux protéines sont synthétisées dans la plupart des tissus. Plusieurs domaines successifs peuvent–être individualisés de la région N-terminale à la région C-terminale de la protéine abl. La zone variable de myristoylation (myr) est codée par les exons 1 alternatifs.
Les trois domaines homologues de Src représentés par le domaine SH3 (environ 60 aa) qui reconnaît des motifs riches en proline, le domaine SH2 (environ 100 aa) reconnaissant des motifs tyrosine phosphorylée et le domaine SH1 (tyrosine kinase) qui est le siège de l’activité de l’abl. Le domaine NTS responsable du signal de translation nucléaire, fait que la protéine abl présente une localisation cytoplasmique et nucléaire. Dans la région précarboxy-terminale, un large site de fixation à l’ADN est présent. Enfin, les 162 derniers aa de l’abl permettent sa fixation sur des molécules d’actine polymérisées. Il convient, de noter que le domaine C-terminal est très riche en proline, il est essentiel à la localisation de la protéine abl au niveau Fig. 1
Structures des gènes abl, bcr et des ARNm chimériques Les flèches indiquent les divers points de coupure
code pour une protéine de PM 160 KD qui est exprimée dans de nombreux tissus [2]. La partie N-terminale de la protéine bcr est entièrement codée par l’exon e1 du gène bcr. Les aa 1à 63 définissent le domaine de dimérisation (DD) indispensable à l’activation d’abl dans la protéine hybride. Les aa 192 à 242 et 298 à 413 constituent deux domaines de fixation aux SH2, ils sont riches en résidus phosphosérine/thréonine[5].
Lors des recombinaisons, les protéines chimériques bcr-abl issues de Mbcr, mbcr ou mbcr présentent respectivement un PM de 210, 190 ou 230 KD. Ces protéines ne différent entre- elles que par leur contenu en domaines de la protéine bcr [6,7].
Exagération de l’activité tyrosine kinase d’abl
L’abl peut être activé soit par fusion avec le bcr , soit par délétion de son domaine SH3 ou de sa partie C-terminale.
Ces anomalies moléculaires interrompent un mécanisme inhibiteur de l’activité tyrosine kinase. Le réarrangement conformationnel intrinsèque de la protéine abl (liaison des résidus prolines présents dans la partie C-terminale au domaine SH3) bloque le site enzymatique des substrats inhibiteurs de l’activité tyrosine kinase. De même, le domaine SH2 en se liant au domaine de dimérisation (DD), participe à l’acquisition de la fonction transformante qui nécessite la phosphorylation du bcr sur des résidus sérines/thréonines et non tyrosines [5,6].
Dans le tableau I, sont rapportées des protéines substrats qui peuvent–être phosphorylées sur leurs résidus tyrosines par le bcr–abl. Cette phosphorylation entraîne une augmentation importante de phosphotyrosine inhibant ainsi les substrats qui
peuvent–être groupés selon leur rôle physiologique en molécules adaptatrices (ex : Crkl et P62DOK), en protéines de structures du cytosquelette membranaire (ex : Paxillin et Talin) et en protéines catalytiques (ex : Fes et Syp). Il importe de noter que le choix de substrats dépend du contexte cellulaire, la Crkl est la protéine phosphorylée en majorité dans la LMC à neutrophiles [6].
Trois mécanismes principaux sont impliqués dans la pathogénie de la LMC. Récemment, la dégradation de deux protéines inhibitrices de la prolifération (Abi1 et Abi2) a été décrite comme étant un autre mécanisme de la leucémogénèse [11].
- Inhibition des voies de l’adhésion : au niveau de la moelle osseuse, les cellules hématopoïétiques ont besoin de facteurs de croissance solubles sécrétés par les cellules stromales qui exercent des régulations négatives vis à vis des progéniteurs hématopoïétiques. Cette régulation négative de la prolifération se fait par interaction directe entre les deux types de cellules, les signaux positifs ne nécessitent aucun contact direct entre le progéniteur et son environnement [5]. Une donnée récente suggère que les b-intégrines jouent un rôle important dans l’interaction entre les cellules stromales et les progéniteurs aboutissant à l’inhibition de la prolifération [6,11]. Les cellules leucémiques expriment un variant de la b1-intégrine qui n’est pas exprimé dans les progéniteurs normaux, sa fonction est l’inhibition de l’adhésion. Les intégrines vont inhiber la prolifération cellulaire qui se trouve diminuée dans les cellules leucémiques. Par ailleurs, la protéine Crkl qui est phosphorylée dans les cellules leucémiques est impliquée, parmi d’autres, dans la régulation de la mobilité cellulaire et dans l’adhésion médiée par les intégrines. Elle réalise cette fonction en association avec d’autres protéines d’adhésion focale ( Paxillin, FaK, P130 Cas et Hef1).
-Activation du signal mitogénique : plusieurs voies d’activation mitogénique ont été décrites [6,11]. Le système MAP kinase/Ras apparaît jouer un rôle primordial, l’autophosphorylation de la tyrosine 177 du bcr-abl forme un site de fixation pour une molécule adaptatrice (Grb–2), qui après sa liaison avec la protéine Sos, stabilise le système Ras dans sa forme activée fixant le GTP. Deux autres molécules adaptatrices (Shc et Crkl) peuvent aussi activer la voie Ras.
Ces deux protéines sont des substrats pour le bcr-abl, elles se fixent sur les domaines SH2 (Shc) ou SH3 (Crkl).
L’activation de Ras par Crkl apparaît être restreinte aux fibroblastes et qu’une liaison directe de Crkl au bcr-abl n’est pas requise pour la transformation des cellules myéloïdes.
- Inhibition de l’apoptose : la protéine bcr-abl inhibe l’apoptose en prolongeant la survie cellulaire qui peut avoir pour conséquence l’accumulation d’aberrations génétiques aboutissant à la phase d’accélération de la LMC [5,11].
Protéine Fonction
P62DOC Adaptatrice
Crkl Adaptatrice
Crk Adaptatrice
Shc Adaptatrice
Talin Cytosquelette membranaire
Paxillin Cytosquelette membranaire
Fak Cytosquelette membranaire
Fes Différenciation myéloïde
Ras-GAP Ras-GTPase
GAP associated proteins Activation de Ras ?
PLCy Phospholipase
PI3 kinase (s/u P85) Sérine kinase
Syp Phosphatase cytoplasmique
Bap-1 14-3-3 protéine
Cbl Inconnue
Vav Différenciation hématopoïétique
Tableau I
Protéines substrats de la protéine bcr-abl (6)
Attitude thérapeutique actuelle de la LMC
Actuellement, un pourcentage restreint de patients présentant une LMC guérissent grâce à l’allogreffe de moelle osseuse. Des stratégies thérapeutiques nouvelles sont donc nécessaires pour améliorer ces résultats [12].
Il est bien établi que l’anomalie moléculaire bcr-abl est l’élément causal de la LMC et que l’activité tyrosine kinase est essentielle au pouvoir transformant de la protéine chimérique bcr-abl. Récemment, l’industrie pharmaceutique a développé de nouvelles molécules appelées, inhibiteurs de tyrosine kinase, capables de bloquer l’activité enzymatique anormale des cellules leucémiques et d’entraîner un arrêt de leur prolifération en les induisant vers l’apoptose [13]. En 1996, les laboratoires Ciba et Geigy ont produit de nombreux dérivés de phénylaminopyrimidine appelés CGP (Ciba Geigy products). L’un d’entre eux, le CGP57148B, s’est montré particulièrement efficace pour inhiber l’activité tyrosine kinase d’abl. Drucker et son équipe [14] ont été les premiers à démontrer l’effet inhibiteur sélectif du CGP57148B sur les cellules bcr-abl positives. Le laboratoire Novartis (issu de la fusion CibaGeigy et Sandoz), qui a hérité de cette molécule, en a développé une forme orale appelée, STI571 ou Imatinib (Gleevec*, Glivec*). C’est un dérivé 2-phénylaminopyrimidine de PM 590D, sa demi–vie est estimée à 13-19 heures ce qui valide son utilisation en dose unique journalière [15]. En juin 1998, un essai clinique de phases I et II chez les patients atteints de LMC résistant à l’interféron a débuté et ses résultats préliminaires ont été rapportés laissant entrevoir de nouvelles possibilités thérapeutiques de la LMC [15,16]. Le groupe de Gambacorti Passerini, qui avait déjà démontré dans un travail préliminaire l’efficacité du STI 571 chez la souris, a obtenu une lignée résistante au STI 571 qui conserve en réalité une sensibilité au STI, mais celle ci nécessite des doses plus élevées. Les deux mécanismes de résistance sont l’amplification du gène bcr- abl et les mutations du domaine catalytique de la protéine chimérique, la cible du imatinib est donc dans ces conditions en quantité plus importante que dans les cellules sensibles [17]. Les associations STI/interféron alpha et STI/Ara-c ont été rapportées synergiques permettant d’éviter l’émergence de clones leucémiques résistants alors que son association avec l’hydroxyurée s’est révélée antagoniste [18].
La réponse thérapeutique dans la LMC est évaluée par la diminution du nombre de cellules Ph+ dans la moelle osseuse qui conditionne la décision de poursuivre ou de
changer de thérapeutique. Actuellement, la cytogénétique conventionnelle reste la méthode de référence [19]. Le caryotype est effectué par la technique de bandes sans stimulation sur les cellules médullaires, il peut être effectué sur culture de cellules sanguines à condition qu’il y ait une myélémie. Il montre chez 90 à 95% des patients l’existence du chromosome Ph [1] et apporte des éléments d’intérêt pronostique en démontrant l’existence de certaines anomalies additionnelles. Cependant, la cytogénétique présente plusieurs inconvénients : nécessité d’un nombre suffisant de métaphases (20 à 50), prélèvement médullaire parfois difficile sur une moelle hypoplasique, et c’est une technique longue. En comparaison, la FISH permet une étude sur cellules en interphase et donc une interprétation d’un plus grand nombre de cellules en un temps limité. L’avantage de la FISH est donc sa rapidité (résultats en moins de 24 heures), la lecture d’un nombre important de noyaux sans difficulté et donc la détection d’un seuil plus bas de maladie résiduelle et enfin possibilité de pratique sur sang périphérique [20].
Récemment, le caractère peu prédictif des résultats de la PCR qualitative, dans le suivi des greffes ou chez les patients sous interféron, a conduit à développer les méthodes de quantification du transcrit bcr-abl. La mise au point de la PCR quantitative compétitive, technique lourde et difficile à réaliser en routine, a eu l’avantage de démontrer la validité clinique de la quantification alors que la RT-PCR quantitative en temps réel est facile à mettre en œuvre et son utilisation en pratique courante s’étend très rapidement.
Elle permet de poursuivre l’évolution du transcrit bcr-abl sur un prélèvement sanguin démontrant ainsi l’intérêt clinique d’une détection positive du bcr-abl (même faible) chez des patients déjà en rémission cytogénétique complète [21,22].
Conclusion
Le but de notre travail est de rapporter les aspects récents des mécanismes moléculaires de la leucémie myéloïde chronique. Certes, la mise au point des techniques de biologie moléculaire au service d’hématologie biologique de l’hôpital Ibn Sina va permettre d’une part, de conforter le diagnostic de la LMC et d’autre part, de réaliser le suivi thérapeutique de la maladie résiduelle par l’évolution du transcrit chimérique bcr-abl. Notre espoir est de poursuivre les efforts pour faire profiter nos patients de ces progrès récents dans un proche avenir.
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