Ematopoiesi primitiva e definitiva

Biochimica e Fisiologia dell’Eritropoiesi

Gian Cesare Guidi

Dipartimento di Scienze Morfologico- Biomediche

Università di Verona

Ematopoiesi primitiva e definitiva

Nature Immunology 2002;3:323

Ematopoiesi primitiva: sx

produzione di G.R. nucleati che esprimono i geni globinici embrionari (embrione di 15-18 gg)

Ematopoiesi definitiva: dx

produzione di G.R. anucleati che esprimono il gene globinico

AGM: aorta-gonad-mesonephros BM: bone marrow

FL: fetal liver;

ery^p: primitive erythroid

GCG

Cellule staminali ematopoietiche (stem cells)

•

Generano altre stem cells

•

Si differenziano in varie cellule progenitrici

EMATOPOIESI

Stem cells nel midollo osseo:

Escluse (B cell) e (T cell), tutte le cellule al di sopra della linea rossa sono stem cells.

Stem cells possono rinnovarsi (in alto) o differenziarsi (in basso)

Stem cell

eritroide

proeritroblasto

eritrocita

progenitore mieloide pluripotente

mieloide

promieloblasto

granulociti

monocita macrofago

piastrinico

megacarioblasto

piastrine progenitore linfoide

(B-cell)

(T-cell)

Differenziazione delle stem cells

(compartimenti)

Regolazione molecolare dell’ematopoiesi

•

Processo ad elevata complessità

•

Regolato da fattori di trascrizione finemente accordati,

– specifici per stadio di maturazione – dipendenti dal contesto

GCG

Regolazione molecolare dell’ematopoiesi

•

Un singolo fattore di trascrizione ha differenti effetti quando espresso a differenti stadi

•

L’espressione di uno specifico fattore a differenti stadi può:

– modulare l’ingresso nella linea cellulare definitiva

– facilitare l’interazione con differenti proteine partner

Regolazione molecolare dell’ematopoiesi

•

Intra-cellulare (nucleare):

– Fattori ubiquitari e fattori di trascrizione ristretti a linea cellulare

– regolano un programma altamente organizzato di espressione genica

•

Extra-cellulare:

– Citochine, fattori di crescita, molecole di adesione

– supportano la proliferazione delle cellule progenitrici e ne determinano la direzione di differenziazione

GCG

Regolazione molecolare

dell’emato/eritropoiesi embrionaria

Eur J Biochem 2002;269;3607

Fattori ubiquitari

• Stem cell leukemia (SCL) gene, conferisce vantaggio proliferativo alla linea eritroide sulla mieloide

• LMO2, agisce da ponte fra i fattori di trascrizione come GATA-1

• Proto-oncogene c-Myb espresso nelle linee

ematopoietiche indifferenziate, diminuisce con la differenziazione; richiesto per l’espansione cellulare definitiva

GCG

Fattori di trascrizione

famiglia dei fattori GATA

•

Noti 6 componenti della famiglia, ma solo GATA-1,-2,-3 sono “ematopoietici”

•

Agiscono legando un motivo di 6 nucleotidi T/AGATAG/A ad azione cis nella

regolazione della trascrizione genica eritroide

•

Identificato per primo il cDNA di GATA-1, poi distintamente gli altri due

Caratteristiche dei fattori GATA

• Proteine “Zn finger”, la più usata classe di fattori di trascrizione

• Il motivo classico è Cys₂His₂ in cui Zn stabilizza 2 strutture molto conservate che funzionano da sequenze di riconoscimento

• Il C-finger si lega al DNA, il N-finger

interagisce con altri fattori di trascrizione (es.:

FOG)

• I siti di binding possono attivare o reprimere l’espressione genica

GCG

Zinc finger proteins

Fattore GATA-2

•

Fattore espresso nei precursori eritroidi ove promuove proliferazione ma blocca differenziazione

•

Precede l’espressione di GATA-1 e deve diminuire con l’aumento di GATA-1 per favorire la differenziazione

GCG

Fattore GATA-1

•

Gene locato sul cromosoma X (Xp11,23)

•

Fattore essenziale per tutti gli aspetti della trascrizione genica e lo sviluppo delle linee

– eritroide

– megacariociticica

– promieolocitica eosinofila

• Espresso anche nella

– eosinofilia periferica della s. ipereosinofila

GCG

Finger N-terminale di GATA-1

• GATA-1 interagisce con fattori di trascrizione della famiglia FOG usando questo zinc finger N-terminale.

• Tale interazione è cruciale per la capacità di GATA-1 di regolare la corretta espressione genica nelle cellule ematopoietiche

Zn Cisteina

U-shaped finger 1 di FOG-1

• U-shaped è un membro della famiglia FOG (Friend Of GATA)

• Tramite il Finger 1 o 6 interagisce con GATA-1 per controllare

l’espressione genica Zn 1His 3Cys

-hairpin

GCG

Complesso di trascrizione-attivazione eritroide

SCL ed E47 legano un E box (CAGGTA), circa 10 bp a monte rispetto ad un motivo GATA; LMO2 e Lbd1 fanno da ponte fra SCL1 e GATA-1.

Ma di solito GATA-1 lega DNA insieme con FOG

Eur J Biochem 2002;269;3607

Interplay dei fattori GATA-2 vs. GATA -1

• GATA-2, espresso nelle stem cells controlla le fasi precoci dell’ematopoiesi

• GATA-2 attiva la trascrizione di GATA-1, prima dell’autoregolazione di GATA-1

• l’espressione prolungata di GATA-2 nelle stem cells compromette la differenziazione e va regolata in modo stretto

• GATA-1 regola la differenziazione terminale e la funzione delle linee eritroide e

megacariocitaria

GCG

Interplay dei fattori GATA-2 vs. GATA -1

•GATA-2 attiva l’espressione di GATA-1, mentre GATA- 1 reprime l’espressione di GATA-2.

•Infine GATA-1 autoregola la propria espressione genica

Acta Hematol 2002;108:237

Altri fattori di trascrizione

• EKLF - Erythroid Kruppel- like factor

• BKLF - Basic KLF

• Neptune

• FKLF - Fetal KLF

• Fli-1 oncogene (famiglia ETS)

 Essenziale per esprimere - globina

 Regola espressione di proteina SHP-1, ridotta nel 60% delle policitemie vere

 Essenziale per esprimere - globina

 Nell’espressione di e - globina

 Inibisce differenziazione eritroide - espressione repressa da EPO

GCG

Differenziazione dei precursori eritroidi

Eur J Biochem 2002;269;3607

Eritropoietina (hEpo)

• L’ormone hEpo è una glicoproteina acida di 34 kD.

• Regolatore primario della produzione di eritrociti

• Funzioni:

• promuove la differenziazione eritroide

• avvia la sintesi di emoglobina

GCG

Complesso EPO-recettore

Attivazione/inattivazione di EPOr

PNAS 2001;98:4379

EPO legandosi cambia la conformazione del dimero EPOr cui segue

transfosforilazione ed attivazione di JAK2: questa a sua volta fosforila residui tyr su EPOr con creazione di siti d’attracco (P) per i domini SH2 di alcuni trasduttori come Stat5 e altre proteine di segnalazione che si attivano, si

dissociano, poi dimerizzano e vanno al nucleo ove attivano geni fra cui quello che esprime proteina bcl-x antiapoptotica. La trasduzione sul recettore è inattivata da una fosfatasi, attivata dalla tirosin-fosfatasi SHP1che rimuove i P.

GCG

Attivazione/inattivazione di EPOr

meccanismo completo

Loop dell’eritropoietina

• Il sensore renale dell’ipossia avvia la produzione di EPO

• EPO segnala ai progenitori eritroidi midollari di iniziare a produrre eritrociti

• 4 gg di proliferazione e differenziazione nel midollo

• 3 giorni di maturazione. Perciò passa circa una settimana fra la segnalazione dell’evento

ipossico ed il rilascio di eritrociti in circolo

GCG

Loop dell’eritropoietina

Tipi di ipossia

•

I. ipossiemica: da bassa pO

- altitudine

•

I. anemica: da riduzione di Hb per

• deficit Fe, Cu

• deficit B₁₂

• altro (Hbpatie, emorragie, ecc.)

•

I. stagnante: da ridotto flusso ematico tessutale

•

I. citotossica: impedimento all’uso di O

da parte delle cellule - avvelenamenti

GCG

Effetti dell’ipossia

J Appl Phys 2004;96:1187

HIF-1 Hypoxia inducible factor 1

•Proteina eterodimerica specificamente coinvolta nel mantenere l’omeostasi di O₂

•Regola l’attivazione di geni inducibili dall’ipossia fra i quali il gene per EPO

•Nell’ipossia il dimero si lega alla sequenza (A)CGTG presente nell’elemento responsivo all’ipossia di geni target controllati da pO₂come ad esempio l’angiogenetico VEGF (vascular endothelial growth factor), EPO, ed alcuni della via glicolitica (MPGM, DPGM)

GCG

HIF-1 Hypoxia inducible factor 1

• 2 subunità, sempre presente e  (labile, 14q21-24) presente nell’ipossia

• nell’ipossia coopera con per attivare la trascrizione di geni target fra cui EPO

• subviene sempre prodotta ma in condizioni di normale pO₂ subisce rapida proteolisi e non interagisce con

• nella figura si osserva

l’interazione di HIF-1 con il DNA su specifiche sequenze dette HRE (Hypoxia Response Elements) locate sui promotori di geni sensibili all’ipossia

Regolazione genica da pO

• HIF-1è strettamente regolata da pO₂e si accumula rapidamente nelle cellule in ipossia(alto)

• In condizioni non ipossicheHIF-1è prodotta ma subito degradata da proteasi (ubiquitina e legame con VHL –basso)

J Appl Phys 2004;96:1195

GCG

Eritropoiesi e bilancio del Ferro

•

Regolazione basata sul controllo

meticoloso dell’assorbimento intestinale

•

Non esiste regolazione escretoria

• sangue mestruale

• desquamazione epiteliale di cute e mucose

– tratto G.I.

– tratto biliare – vie urinarie

Eritropoiesi e bilancio del Ferro

•

Deficit di Fe tessutale ed accelerata eritropoiesi aumentano di alcune volte l’assorbimento

•

Lo stimolo eritropoietico ha più potenza nell’aumentare l’assorbimento di Fe rispetto al deficit tessutale

GCG

Eritropoiesi e bilancio del Ferro

• In gravidanza una parte del Fe totale è destinata al feto in sviluppo

• Nel deficit di Fe i precursori eritroidi hanno priorità a spese degli altri tessuti

• Nel sovraccarico l’eritropoiesi procede

normalmente, ma il Fe in eccesso si deposita nei tessuti (fegato, cuore, pancreas, ecc.) in quanto la capacità di aumentare l’eliminazione di Fe è molto limitata

Distribuzione corporea del Ferro

• Fe totale 3-5 g

• 65-75% in Hb

• 0,5-2,0 mg assorbiti/gg

• perdite/gg analoghe

• eritropoiesi rifornita da SRE per riciclo

• 0,1% in transito

• riserve epatocitarie1 g

• distribuzione alterata in gravidanza, deficit e sovraccarico

Nature Rew Genetics 2000;1:208

GCG

Assorbimento di Fe - Molecole

• DMT1

• Dcytb

• Ferroportina (IREG1)

• Efestina

• HFE+₂-microglobulina

• TfR1

• TfR2

Trasportatore di mucosa

Fe-reduttasi (Fe³⁺Fe²⁺)

Trasportatore basolaterale

Fe-ossidasi (Fe²⁺Fe³⁺)

modula uptake/rilascio di Fe plasmatico nelle cripte duodenali

Recettore 1 per Tf

Recettore 2 per Tf (+)

Assorbimento del Fe-Epcidina

• Piccolo peptide circolante di sintesi epatica recentemente scoperto che regola

l’assorbimento intestinale di Fe (store regulator)

• Quando sideremia aumenta troppo (1), epcidina è rilasciata (2) e riduce assorbimento tramite ritenzione di Fe nei macrofagi e differenziazione di enterociti a ridotta espressione di proteine di trasporto (3)

• Quando sideremia diminuisce troppo l’espressione di epcidina è ridotta per favorire

l’assorbimento di Fe

GCG

Epcidina, EPO ed omeostasi del Fe

JCI 2002;110:1037

Trasporto del Fe-Transferrina

• TF lega Fe⁺⁺⁺, lo rende solubile, ne attenua la reattività, lo rilascia alle cellule

• TF rilascia Fe alle cellule dopo legame con TFR

• In circolo vi sono 4 forme di TF:

–ApoTF

–Tf monoferrica (unico Fe⁺⁺⁺legato a C-t) –Tf monoferrica (unico Fe⁺⁺⁺legato a N-t) –OloTf (2 Fe⁺⁺⁺)

GCG

Trasporto del Fe-Transferrina

•HOLO-Tf si lega a TFR

•Endocitosi del complesso

•Azione di pompa a protoni su endosoma e rilascio di Fe

•DMT1 cattura e trasporta Fe⁺⁺

fuori dall’endosoma

•Fe viene utilizzato o depositato (cellule non eritropoietiche)

•APO-TF e TFR vanno sulla membrana e si dissociano a pH neutro - il ciclo riprende

Nature Rew Genetics 2000;1:208

Destino del Fe in differenti cellule

GCG

Geni del metabolismo del Fe

esiti di possibili mutazioni

• Ceruloplasmina

• DMT1

• Epcidina

• Ferroportina

• Frataxina (triplicazione genica)

• HFE

• Efestina

• Transferrina

• sTFR2

 Fe in SNC, fegato; diabete;

anemia

 grave anemia, ridotto assorbimento

 emocromatosi

 grave anemia, sovraccarico di Fe

 atassia, mocardiopatia

 emocromatosi

 ridotto assorbimento

 grave anemia; sovraccarico di Fe in parenchimi

 aumento assorbimento;

sovraccarico di Fe

Regolazione del Ferro

Le cellule regolano il loro contenuto in Fe controllando l’espressione dei sistemi di captazione e delle proteine di deposito di Fe

LIP = Labile Iron Pool

Tf

FER

DCT1 (NRAMP2)

L’espressione dei sistemi di captazione è sovraregolata nel deficit e sottoregolata nel carico di Fe

L’espressione delle molecole di ferritina è sovraregolata nel carico e sottoregolata nel deficit di Fe

LIP TfR

IRP GCG

Regolazione del Ferro

Le proteine che consentono l'auto-regolazione del Fe intracellulare sono le IRP-1 e IRP-2 (Iron Regulatory Proteins). Sono proteine citoplasmatiche che si legano a RNA e funzionano in modotranssul mRNA che contiene gli IRE (Elementi Responsivi al Fe) strutture ad azionecis.Gli IRE, siti di legame per IRP sono strutture a forma di forcina a 28 nucleotidi. Sono presenti nelle regioni non traslate che codificano per TfR, Ferritina, ALA sintasi ed altre stutture correlate.

coding

5’ An

IRP IRP

3’

An

IRP

X

coding

UTR UTR

IRP-1

• Variazioni nel Fe intracellulare alterano la

conformazione di IRP1 da forma enzimatica attiva (aconitasi) a bassa affinità per RNA, a forma senza attività aconitasi ma ad alta affinità per RNA. Tali conversioni consentono a IRP1 di monitorare le variazioni nella disponibilità di Fe intracellulare.

• Se aumenta Fe, aumenta la forma IRP1 a bassa affinità per RNA e diminuisce il legame di IRP1 a IRE.

• Se Fe diminuisce, IRP1 aumenta la sua affinità per RNA e si lega maggiormente a IRE.

GCG

Differenze fra IRP-1 & IRP-2

•IRP-2 non ha attività aconitasi

•IRP-2 si lega a IRE come IRP-1 e funziona come repressore traslazionale

•Una diminuzione di Fe intracellulare aumenta il legame a mRNA di entrambi gli IRP (1 & 2) ma in modi differenti:

– Il controllo di IRP1 è soprattutto post-traslazionale con switch da forma non legante (aconitasi) a forma legante (no-aconitasi) che avviene con piccole variazioni della quantità di proteina IRP-1

– Invece l'aumento di legame di IRP-2 è il risultato di sintesi de-novo

•Le conseguenze delle differenti distribuzioni tessutali di IRP (1 & 2) non sono ancora note, ma le due proteine sembrano avere identico comportamento quali sensori di Fe intracellulare

Regolazione del Ferro

Le IRP (1 e 2) sentono i livelli di Fe(II) nel LIP e controllano per traslazione l’espressione dei geni che trasportano gli IRE, cioè: TfR, DCT1, Ferritina (FT), FER (Fe Reduttasi) e ALA sintasi

Tf

FER

DCT1 (NRAMP2)

L’espressione dei sistemi di captazione è sovraregolata nel deficit e sottoregolata nel carico di Fe

L’espressione delle molecole di ferritina è sovraregolata nel carico e sottoregolata nel deficit di Fe

LIP TfR

IRP

FT GCG

Controllo traslazionale coordinato di captazione di Fe e sintesi di Ferritina

•A basso Fe intracellulare la traslazione di mRNA per Ferritina è bloccata da IRP su IRE, quella per TFr, DCT1, FEP è favorita dal binding di IRP ad alta affinità. Ciò rende stabile mRNA traslato

•A Fe alto la traslazione di mRNA per Ferritina è possibile, quella per TFr, DCT1, FEP è rallentata dal mancato binding di IRP a bassa affinità con IRE. Ciò rende instabile mRNA traslato (RNAasi)

coding

5’ An

IRP IRP

Tf R, DCT1, FePortina

5’ An

Ferritina IRP

5’

RNAasi

5’ An

Alto Fe IRP Basso Fe

IRP

s60 s43 s40 IRP

IRP IRP

coding coding

coding

FT

TfR, DCT1 FeP FRasi X

X

LIP

Binding di IRP-1 e -2 proteine regolatrici di Fe

GCG

Recettore per la transferrina - TFr

• TFr è la sola via fisiologica di ingresso cellulare di Fe

• TFr sono presenti su tutte le cellule nucleate in funzione delle esigenze

• La scorta di Fe cellulare è determinata dal

numero dei TFr; più alto in midollo, fegato,

placenta

TFr è un omodimero transmembrana connesso da legami S-S.

Un gruppo acile attaccato al termine citoplasmatico della molecola ancora il tutto alla membrana plasmatica YTRF

Segnale di internalizzazione

Recettore di Transferrina TFr

Recettore solubile per la transferrina - sTFr

• Monomero troncato del recettore cellulare

• Circola complessato con TF

• Il maggior rilascio di sTFr plasmatico avviene ad opera degli eritroblasti, in secondo luogo dai reticolociti

• I livelli di sTFr sono determinati dall'attività eritropoietica midollare che può causare

variazioni da meno otto volte a più venti volte i valori normali

GCG

Deposito di Ferro - Ferritina

HRI - Heme Regulated Inhibitor

• Inibisce, tramite fosforilazione di eIF2

(fattore di iniziazione), la sintesi di Hb nei reticolociti

• L’inibizione feed-backsi osserva quando la

concentrazione intracellulare di eme declina

• NO influenza l’azione di HRI

• Il meccanismo previene la sintesi di catene

globiniche in eccesso rispetto all’eme(meglio anemia microcitica che emolitica)

• Controlla la traslazione di Hb dopo la perdita del nucleo (25% del totale)

• Agisce come sensore ed effettore a protezione degli stress

GCG

HRI - Heme Regulated Inhibitor

• A. Regolazione della sintesi di  e 

globine ad opera di HRI ed eme

• B. Risposta alterata dell’eritropoiesi nel deficit di Fe in HRI^-/-

Stress

EMBO J 2001;20:6909

Gene della -globina - attivazione della trascrizione

• Cluster di alcuni geni -like su cromosoma 11

• Livello di espressione dipendente da regione di controllo del locus(LCR)

• LCR consiste di 5 siti ipersensibili alla DNAasi (HSs) estesi su 20-30 kb e 10-60 kb a monte dei geni 

• HSs appaiono dapprima nelle CFU-E in conseguenza del binding di fattori specifici ed ubiquitari di

trascrizione (motivi CACC, E box, GATA-1, MARE)

GCG

Gene della -globina - attivazione della trascrizione

Nature Genetics 2003;35:190

Clusters dei geni per le globine

GCG

Metabolismo dell’eme

• -aminolevulinato sintetasi 2 (ALAS2) è rate limitingsulla via metabolica.

• ALAS2 è l’isoenzima eritroide

• La mutazione del gene per ALAS2 (Xp11.21) causa anemia sideroblasticaX- linked

• La mutazione è spesso associata ad allele mutante per il gene HFE

Catabolismo dell’eme

GCG

Conclusioni

• La tradizionale visione morfologica è stata integrata/sostituita dai risultati delle indagini genetiche e di biologia molecolare

• I vari meccanismi molecolari, attivi a partire da BFU-E, operano secondo un programma

finemente sintonizzato cui contribuiscono espressione di geni ed azione di regolatori

• L’intervento coordinato di geni e regolatori è sensibile a sottili variazioni che avvengono nell’ambiente esterno e si adegua ad esse tramite meccanismi epigenetici