Etude de la survie et identification des fonctions exprimées par la bactérie lactique Streptococcus thermophilus dans le tractus digestif

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Etude de la survie et identification des fonctions

exprimées par la bactérie lactique Streptococcus

thermophilus dans le tractus digestif

Ophelie Uriot

To cite this version:

Ophelie Uriot. Etude de la survie et identification des fonctions exprimées par la bactérie lactique Streptococcus thermophilus dans le tractus digestif. Médecine humaine et pathologie. Université d’Auvergne - Clermont-Ferrand I, 2016. Français. �NNT : 2016CLF1PP06�. �tel-01875799�

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U

NIVERSITÉ

B

LAISE

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U

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Année 2016 N° d’ordre 06-DOC-PH

E

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D

OCTORALE

DES

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CIENCES DE LA

V

IE ET DE LA

S

ANTE

N° d’ordre : 06-DOC-PH

Thèse

Présentée à l’Université d’Auvergne pour l’obtention du grade de DOCTEUR

(Décret du 5 juillet 1984)

Spécialité : Science de la Vie et de la Santé soutenue le 16 décembre 2016

URIOT Ophélie

Etude de la survie et identification des fonctions exprimées

par la bactérie lactique Streptococcus thermophilus

dans le tractus digestif

R a p p o r t e ur s : M. Jean-François CAVIN, Pr, Université de Bourgogne-Franche Comté Mme Françoise RUL, CR, HDR, INRA, Jouy-en-Josas

E x a mi n a t e ur s : M. Grégory JUBELIN, CR, INRA Clermont-Ferrand Theix M. Christophe CHASSARD, DR, INRA Aurillac

Mme Stéphanie BLANQUET-DIOT, Dr, HDR, Université d'Auvergne (Directrice de Thèse) Mme Annie DARY-MOUROT, Pr, URAFPA, Université de Lorraine (Co-directrice de Thèse)

Conception Ingénierie et Développement de l’Aliment et du Médicament, EA-CIDAM 4678, Université d’Auvergne

28 place Henri Dunant – 63001 Clermont-Ferrand Cedex Protéolyse et Biofonctionalités des Protéines et des Peptides,

PB2P, UR AFPA, Université de Lorraine

(3)

(4)

Résumé - Abstract

Résumé:

Streptococcus thermophilus est la bactérie lactique la plus utilisée après Lactococcus lactis dans l’industrie laitière pour la fabrication de yaourts et de fromages. Il s’agit du seul streptocoque à avoir le statut de bactérie GRAS (Generally Recognized As Safe). Malgré de récentes études montrant sa capacité à survivre dans le tractus digestif humain et des effets santé intéressants, le statut probiotique de S. thermophilus reste l’objet d’interrogations. Ainsi, les objectifs de cette thèse ont été (i) d’approfondir les connaissances sur la capacité de survie de S. thermophilus en conditions digestives humaines simulées, grâce, en particulier, au système dynamique multi-compartimenté TIM (TNO gastro-intestinal model) et (ii) d’identifier des gènes de S. thermophilus spécifiquement activés dans des conditions complexes comme l’environnement digestif, à l’aide de la technologie R-IVET (Recombinase-based In Vivo Expression Technology) basée sur l’excision d’un gène rapporteur. Le système R-IVET est composé d’un vecteur plasmidique portant la recombinase cre démunie de son promoteur et d’une cassette chromosomique composée d’un gène marqueur entouré de sites loxP reconnus par Cre. Ainsi, dans un premier temps, nous avons implanté la technologie R-IVET chez S. thermophilus LMD-9. Sa fonctionnalité a été testée et validée in vitro et dans le tractus digestif de la souris. Puis, l’étude de la survie de quatre souches de S. thermophilus dans le système TIM a montré que trois d’entre elles étaient plus résistantes que la quatrième, très sensible aux stress gastro-intestinaux. Ces résultats confirment donc que la survie de S. thermophilus dans l’environnement digestif est souche-dépendante. Ils montrent également que la survie de S. thermophilus est influencée par la matrice alimentaire, celle-ci étant plus importante en lait fermenté qu’en lait liquide. Enfin, dans un troisième temps, nous avons construit une première banque génomique R-IVET, en clonant en amont de cre des fragments d’ADN génomiques provenant de LMD-9. Cette banque a été testée uniquement en conditions gastriques simulées dans le TIM. Puis, après avoir optimisé notre outil chez S. thermophilus en améliorant la méthode d’identification des gènes activés, une seconde banque R-IVET a été testée dans l’ensemble du tractus gastro-intestinal (TIM) et en système batch en présence du microbiote intestinal. Ces expériences nous ont permis de mettre en évidence, pour la première fois, des gènes de S. thermophilus spécifiquement activés dans les différents compartiments digestifs de l’homme. Ce travail de thèse contribue ainsi à approfondir les connaissances sur le comportement de cette bactérie dans le tractus gastro-intestinal humain. A moyen terme, ces travaux devraient permettre d’identifier des marqueurs de survie de S. thermophilus et de mieux comprendre son activité métabolique dans l’environnement digestif, facilitant la sélection de souches dans la perspective de développement d’aliments fonctionnels.

Mots clés: Streptococcus thermophilus, probiotique, Recombinase-based In Vivo Expression Technology, survie, metabolisme, tractus digestif humain, modèle gastrointestinal TIM

Abstract:

Streptococcus thermophilus is the lactic acid bacterium most commonly used after Lactococcus lactis in the dairy industry for the production of yogurt and cheese. It is the only streptococcus strain to have the GRAS status (Generally Recognized As Safe). Despite recent studies showing its ability to survive through the human digestive tract and valuable health effects, the probiotic status of S. thermophilus remains questioned. Thus, the objectives of this pHD work were (i) to increase knowledge on the survival of S. thermophilus in human digestive environment, by using the dynamic multi-compartmental TIM system (TNO gastro-intestinal model) and (ii) to identify the genes from S. thermophilus that are specifically activated in complex digestive environment using the IVET technology (Recombinase-based In Vivo Expression Technology). R-IVET is based on the excision of a reporter gene and consists of a plasmid vector carrying the promoterless recombinase cre and a chromosomal cassette composed of a marker gene flanked by loxP recognized by Cre. First, we introduced the R-IVET technology in S. thermophilus LMD-9. Its functionality was tested and validated in vitro and in the mice digestive tract. Then, the survival of four S. thermophilus strains was investigated in the TIM system and we showed that 3 of these strains were more resistant than the other one, very sensitive to gastrointestinal stresses. These results strengthen the idea that the survival of S. thermophilus is strain-dependent. We also highlighted that the survival of S. thermophilus was influenced by the food matrix, being higher in fermented compared to liquid milk. Lastly, we constructed a first genomic R-IVET library, by cloning upstream of cre genomic DNA fragments from LMD-9. This librarywas tested only in gastric condition (TIM). After optimization of our tool in S. thermophilus (improvement of the method allowing identification of the activated genes), a second R-IVET library was tested throughout the gastrointestinal system (TIM) and in batch system including intestinal microbiota. By identifying bacterial genes specifically activated in human digestive conditions, this work contributes to extend our knowledge on the behavior of S. thermophilus in the human gastrointestinal tract. This could open up opportunities in determining survival markers for S. thermophilus and better describing its metabolic activity in the human gut, then facilitating the selection of strains that can be included in functional foods.

Keywords: Streptococcus thermophilus, probiotic, Recombinase-based In Vivo Expression Technology, survival, metabolic activity, human digestive tract, gastrointestinal TIM model

(5)

(6)

Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier Mme Françoise Rul et M. Jean-François Cavin d’avoir accepté d’être rapporteurs de ce travail, pour le temps passé à la lecture du manuscrit et à la critique de ce travail. Je remercie également M. Christophe Chassard et M. Grégory Jubelin pour avoir accepté d’évaluer ce travail.

Je tiens à remercier Mme Annie Dary-Mourot, responsable de l’équipe PB2P, et Mme Monique Alric, responsable de l’équipe EA-CIDAM, pour m’avoir accueillie au sein de leur équipe.

Je remercie Mme Stéphanie Blanquet-Diot et Mme Annie Dary-Mourot, mes directrices de thèse, pour la confiance que m’avez accordée en me permettant d’effectuer ce travail, pour votre soutien tout au long de la thèse et pour votre encadrement. J’ai beaucoup appris à vos côtés et je vous en remercie.

Je remercie Sylvain Denis pour avoir été présent lors de cette thèse, pour votre aide, pour vos conseils, m’avoir appris à me servir du TIM et pour tout le reste. Merci également à Sandrine Chalancon pour avoir été présente et m’avoir fournit une aide indispensable lorsque j’étais à Clermont-Ferrand et pour la gentillesse que tu as eu à mon égard. Sans vous deux, les manips TIM ne se seraient pas passées aussi bien.

Je remercie également Emilie Lorson qui a été d’une aide précieuse notamment lors de cette merveilleuse expérience qu’est le repiquage de milliers de colonies et pour la patience dont tu as fait preuve lors des centaines de PCR que tu as réalisées. Un grand merci aussi pour ton amitié et pour ton soutien.

Je remercie également Fleur Awussi avec qui j’ai partagé un bureau, pour avoir partagé avec moi toutes les émotions liées à nos thèses (joie, rire, colère, déprime,…). Tu as été une véritable amie et les petits échanges que nous avons eus lors de cette thèse vont me manquer.

Je remercie également Yvonne Roussel pour votre présence au début de ma thèse et pour vos conseils.

Je remercie également les membres des deux équipes pour leur acceuil et leur soutien (une petite pensée pour les doctorants qui vont soutenir prochainement).

Enfin, je remercie ma famille. Mes deux frères que j’ai dû rendre sourd avec mes états d’âme. Et à ma mère qui m’a soutenue dès le début quand j’ai eu l’idée saugrenue de faire une thèse. J’espère te rendre fière.

(7)

(8)

i

T

able des matières

Liste des figures et tableaux ... iv

Abréviations ... vi

Avant-propos ... 1

Première partie ‒ synthèse bibliographique ‒... 5

CHAPITRE 1: LA DIGESTION HUMAINE ET SA MODELISATION IN VITRO ... 7

1. Le tractus gastro-intestinal humain ... 9

1.1. Histologie du tube digestif... 9

1.2. Digestion bucco-œsophagienne ... 11

1.3. Digestion gastrique ... 12

1.3.1. Anatomie et péristaltisme de l’estomac ... 12

1.3.2. Sécrétions gastriques ... 13

1.4. Digestion intestinale ... 15

1.4.1. Anatomie et péristaltisme de l’intestin grêle ... 15

1.4.2. Cellules et sécrétions de la muqueuse intestinale ... 16

1.4.2.1. Entérocytes et absorption des nutriments ... 17

1.4.2.2. Cellules caliciformes et production de mucus ... 18

1.4.2.3. Cellules de Paneth et sécrétions de peptides antimicrobiens ... 18

1.4.2.4. Cellules du système lymphoïde associé à l’intestin ... 19

1.4.3. Sécrétions des glandes annexes et rôle dans la digestion ... 19

1.4.3.1. Le foie, la vésicule biliaire et la sécrétion de bile ... 20

1.4.3.2. Le pancréas et les sucs pancréatiques ... 20

1.5. Digestion colique ... 22

1.6. Microbiote digestif ... 23

2. La digestion artificielle: modèles in vitro de digestion humaine ... 26

2.1. Modèles gastriques ... 26

2.1.1. Statiques ... 26

2.1.2. Dynamiques ... 27

2.2. Modèles gastro-intestinaux ... 29

(9)

ii

2.2.2. Bi-compartimentés dynamiques ... 30

2.2.3. Multi-compartimentés dynamiques ... 33

2.2.3.1. Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem: SHIME ... 33

2.2.3.2. TNO gastro-Intestinal Model: TIM ... 35

2.3. Avantages et limites des systèmes de digestion in vitro ... 37

CHAPITRE 2: Streptococcus thermophilus, UN nouveau probiotique? .. 39

3. S. thermophilus, une bactérie lactique ... 41

3.1. Généralités sur S. thermophilus ... 41

3.2. Taxonomie et adaptation au lait ... 42

3.3. Voies métaboliques de S. thermophilus ... 43

3.3.1. Métabolisme carboné de S. thermophilus ... 44

3.3.1.1. Transport des sucres à travers la membrane plasmique ... 44

3.3.1.2. Métabolisme des sucres ... 45

3.3.1.3. Métabolisme du pyruvate ... 47

3.3.1.4. Régulation du métabolisme carboné ... 47

3.3.1.4.1. Organisation et régulation par GalR du cluster galKTEMlacSZ ... 47

3.3.1.4.2. Régulation par les protéines CcpA et HPr ... 48

3.3.2. Métabolisme azoté de S. thermophilus ... 50

3.3.2.1. Besoins en acides aminés ... 50

3.3.2.2. Système protéolytique ... 51

3.3.3. Métabolisme de l’oxygène de S. thermophilus ... 53

3.4. Utilisation de S. thermophilus en industrie laitière ... 54

3.4.1. Production de yaourt ... 54

3.4.2. Production de fromage ... 55

4. S. thermophilus, vers un nouveau probiotique? ... 57

Revue: Streptococcus thermophilus: from yogurt starter to a new promising probiotic candidate? ... 59

CHAPITRE 3: MéTHodEs d’éTudE du TRAnsCRIPToME bACTéRIEn dAns un environnement complexe ... 97

5. Méthodes basées sur l’hybridation ... 99

5.1. Technologie des puces à ADN ... 100

5.2. Technique SCOTS ... 101

(10)

iii

6.1. Méthode STM ... 103

6.2. Méthode IVET, R-IVET et DFI ... 105

6.2.1. Technologie IVET ... 105

6.2.2. Méthode DFI ... 106

6.2.3. Technologie R-IVET ... 107

Seconde partie ‒ travaux expérimentaux ‒ ... 109

Chapitre1: développement de la recombinase-based in vivo expression technology (r-ivet) chez Streptococcus thermophilus ... 111

Publication 1: Development of the recombinase-based in vivo expression technology in Streptococcus thermophilus and validation using the lactose operon promoter ... 113

Commentaire de la publication 1 ... 127

CHAPITRE 2: éTudE dE lA suRvIE ET dE l’ACTIvITé MéTAbolIquE dE Streptococcus thermophilus en conditions gastriques simulées ... 131

Publication 2: Use of the dynamic gastro-intestinal model TIM to explore the survival of the yogurt bacterium Streptococcus thermophilus and the metabolic activities induced in the simulated human gut ... 133

CHAPITRE 3: oPTIMIsATIon dE l’ouTIl R-IVET et validation en condtions digestive simulées ... 153

Publication 3: Use of the Technology R-IVET to identify in Streptococcus thermophilus genes specifically expressed under simulated human digestion conditions and in presence of intestinal microbiota ... 155

Troisième partie ‒Conclusions et perspectives‒ ... 193

(11)

iv

L

iste des figures et tableaux

Liste des figures:

Figure 1: Organisation générale du système digestif humain et des glandes annexes ... 10

Figure 2: Structure fondamentale du tube digestif ... 11

Figure 3: Anatomie de l’estomac ... 13

Figure 4: Structure de la muqueuse de l’estomac ... 14

Figure 5: Représentation de la structure de l’épithélium intestinal ... 16

Figure 6: Représentation schématique de la structure de l’épithélium de l’intestin grêle ... 17

Figure 7: Organes annexes du système digestif ... 19

Figure 8: Anatomie du gros intestin ... 22

Figure 9: Espèces microbiennes dominantes dans les différentes régions du système digestif humain 24 Figure 10: Représentation schématique de la cellule digestive de l’Université de Leeds ... 27

Figure 11: Le DGM (Dynamic Gastric Model) ... 28

Figure 12: HGS (Human Gastric Simulator) ... 28

Figure 13: TIM-agc (TNO gastro-Intestinal Model advanced gastric compartment) ... 29

Figure 14: Modèle bi-compartimenté dynamique de Mainville ... 30

Figure 15: Système bi-compartimenté dynamique de Levi et Lesmes ... 31

Figure 16: Système DIDGI, système dynamique de digestion gastro-intestinale ... 32

Figure 17: TinyTIM (TNO gastro-intestinal model) ... 32

Figure 18: Représentation du schématique SHIME ... 33

Figure 19: Représentation schématique du M-SHIME ... 34

Figure 20: Représentation schématique du TIM-1 ... 35

Figure 21: Photographie de Streptococcus thermophilus ... 41

Figure 22: Transport et métabolisme carboné chez S. thermophilus ... 46

Figure 23: Organisation du cluster gal-lac chez S. thermophilus ... 48

Figure 24: Régulation du transport du lactose chez S. thermophilus ... 49

Figure 25: Système protéolytique de S. thermophilus ... 52

Figure 26: Représentation du principe de la puce à ADN ... 100

Figure 27: Représentation de la technique SCOTS (Selective capture of transcribed sequence) ... 102

Figure 28: Représentation de la technique STM (Signature tagged mutagenesis) ... 104

Figure 29: Représentation du principe de la technique IVET ... 106

Figure 30: Principe de la technique R-IVET à sélection négative... 128

Figure-1: Construction of the S. thermophilus mutant STUL5003. ... 165

(12)

v

Liste des Tableaux:

Table 1: Evolutionary stages of probiotic definitions (adapted from Vasiljevic and Shah, 2008) ... 64

Table 2: Main bacterial and yeast probiotics and their health effects, as observed in animal models or during human trials ... 66

Table 3: Overview of S. thermophilus survival studies in the digestive environment: human trials, in vivo assays in animal models and in vitro experiments ... 70

Table 4: Characterization of some bacteriocins produced by S. thermophilus ... 80

Table-1: Bacterial strains and plasmid used in the present study ... 161

Table-2: Oligonucleotides used in the present study with their relevant characteristics ... 162

Table-3: Parameters of the TIM model when simulating the digestion of milk by a healthy adult. ... 166

Table-4: Survival rates and number of R-IVET clones analyzed in each compartment of the TIM system and in the batch cultures ... 172

Table-5: S. thermophilus LMD-9 loci identified using R-IVET technology during the passage through the TIM model ... 176

Table-6: S. thermophilus LMD-9 loci identified using R-IVET batch cultures with human intestinal microbiota ... 177

(13)

vi

A

bréviations

AAD Antibiotic-associated diarrhea ABC ATP-binding cassette transporters

AckA Acétate kinase

AcoABCL Complexe acétoïne déshydrogénase

Ac-P Acétyl-phosphate

ADN Acide désoxyribonucléique

ADNc Acide désoxyribonucléique complémentaire

ADP Adénosine diphosphate

AldB α-acétolactate déshydrogénase

Als α-acétolactate synthase

ARCOL Artificial colon

ARN pol Acide ribonucléique polymerase

ARN Acide ribonucléique

ATP Adénosine triphosphate

Asp Acid-shock protein

B. Bifidobacterium

C. Clostridium

CcpA Catabolite control protein A Cellules M Microfold cells

CFU Colony forming unit

CoA Coenzyme A

DFI Differential fluorescence induction

DGM Dynamic gastric model

DiDGI Système dynamique de digestion gastro-intestinale DVC-FISH Direct viable count - fluorescent in situ hybridization

E. Enterococus

EA CIDAM Equipe d’accueil « Conception, Ingénierie et Développement de l’Aliment et du Médicament »

EFSA European food safety authority EHEC Escherichia coli entérohémorragiques

EI Enzyme I

EIEC Enteroinvasive Escherichia coli

EPS Exopolysaccharide

EQPS European presumption of safety list of food bacteria

erc élément de répression catabolique

ETEC Escherichia coli entérotoxinogènes

FACS Fluorescence activated cell sorting FAO Food and agriculture organization

(14)

vii

FDA Food and drug administration

Fru-6P Fructose-6-phosphate

FruB Fructo-1-phosphate kinase

GalE UDP glucose 4-epimerase

GalK Galactokinase

GalM Galactose maturotase

GalT Galactose 1-phosphate uridylyltranferase

GF Germ-free

GFP Green fluorescent protein

GIT Gastrointestinal tract

GlcK Glucose kinase

Glu-6P Glucose-6-phosphate

Gpi Phosphoglucose isomérase

GRAS Generally recognized as safe

HCl Acide chlorhydrique

HGS Human gastric simulator

His Histidine

HMA Human-associated microbiota

HPr Histidine phophocarrier protein

Hsp Heat-shock protein

IL Interleukin

IVET In vivo expression technology

J.G. Jus gastrique

J.P. Jus pancréatique

L. Lactococcus

LAB Lactic acid bacteria

LacS Transporteur du lactose

LacZ β-galactosidase

Lb. Lactobacillus

Ldh L-lactate déshydrogénase

MLST Multilocus sequence typing

M-SHIME Mucosal-simulator of the human intestinal microbial ecosystem NAD+ Nicotinamide adénine dinucléotide sous forme oxydée

NADH Nicotinamide adénine dinucléotide sous forme réduite

NaHCO3 Bicarbonate de sodium

P Phosphate

PB2P Protéolyse et biofonctionnalités des protéines et des peptides

PEP Phospho-énolpyruvate

Pfk Phosphofructokinase

Pfl Pyruvate formate lyase

PflA Pyruvate formate lyase activation enzyme

PgmA Phosphoglucomutase

Pta Phosphotransacétylase

(15)

viii R-IVET Recombinase-based in vivo expression technology

ROS Reactive oxygen species

S. Streptococcus

SCOTS Selective capture of transcribed sequences ScrB Saccharose-6-phosphate hydrolase

ScrK Fructokinase

Ser Sérine

SHIME Simulator of the human intestinal microbial ecosystem

SOD Superoxyde dismutase

SpecRKanS Phénotype spectinomycine résistant et kanamycine sensible SpecSKanR Phénotype spectinomycine sensible et kanamycine résistant

STM Signature-tagged mutagenesis

TGI Tractus gastro-intestinal

THG Transfert horizontal de gènes TIM-1 (TIM) TNO gastro-intestinal model

TIM-agc TNO gastrointestinal model advanced gastric compartment

UDP Uridine diphosphate

UDP-Gal UDP-galactose

UDP-Glu UDP glucose

UFC Unité formant colonie

URAFPA Unité de Recherche Animal et Fonctionnalité des Produits Animaux

V. Vibrio

(16)

1

A

vant-propos

Au début du 20èmesiècle, Elie Metchnikoff a proposé l’existence d’un le lien entre la santé de l’homme et la consommation de «microbes utiles» (Metchnikoff, 1907). Depuis, le concept de probiotique, défini comme « des micro-organismes vivants qui, lorsqu’ils sont administrés en quantité adéquate produisent un effet bénéfique pour la santé de l’hôte » (FAO/WHO, 2002), a été établi.

De plus en plus d’études sont réalisées sur les probiotiques et leurs effets bénéfiques sur la santé de l’homme. Le commerce de ces bactéries s’est fortement accru depuis plus de 10 ans et de nombreuses recherches sur les effets probiotiques de bactéries utilisées en alimentaire se sont développées. C’est ainsi que la recherche alimentaire s’oriente vers le concept de nutrition « positive » et le développement d’aliments fonctionnels qui permettraient le traitement préventif ou curatif de certaines maladies telles que le syndrome du colon irritable, les diarrhées aigües ou encore, agiraient comme immunostimulants. Cependant, depuis l’adoption de la réglementation européenne sur les allégations nutritionnelles et santé (n°1924/2006, 1er juillet 2007), les industriels doivent apporter des preuves scientifiques étayées pour avoir l’autorisation d’apposer une allégation santé sur le packaging d’un nouveau produit.

Les bactéries probiotiques sont souvent administrées sous la forme de gélules (compléments alimentaires) mais comme évoqué précédemment, leur administration via leur inclusion dans un aliment est de plus en plus explorée. Il s’agit souvent de matrices laitières telles que les laits fermentés ou les yaourts. Ainsi, le yaourt, résultat de la fermentation du lait par Streptococcus (S.) thermophilus et Lactobacillus (Lb.) delbrueckii subsp. bulgaricus, a été accrédité par l’EFSA (European Food Safety Authority) en 2010 d’une allégation santé portant sur l’amélioration de la digestibilité du lactose pour les personnes intolérantes.

S. thermophilus est l’une des bactéries les plus utilisées en industrie laitière, après Lactococcus (L.) lactis. C’est une bactérie lactique qui bénéficie d’une image très positive. En

effet, il est reconnu comme GRAS (Generally Recognized As Safe) par la FDA (Food and Drug Administration) et qui appartient à la liste EQPS (European Presumption of Safety list of food bacteria). Pourtant, malgré son utilisation massive, sa consommation importante par

(17)

Avant-Propos

2

l’homme et son image positive, les propriétés probiotiques de S. thermophilus ont été à ce jour relativement peu explorées, certainement en raison de travaux soutenant son incapacité à survivre lors du transit digestif (Ballesta et al., 2008; del Campo et al., 2005; Pedrosa et al., 1995). Dans le cadre du développement de produits nutraceutiques ou d’aliments fonctionnels à partir de S. thermophilus, il est important de caractériser les effets probiotiques potentiels de

S. thermophilus, et par conséquent il est nécessaire de mieux connaître l’état physiologique de

cette bactérie dans le tractus digestif humain.

Les travaux de recherche présentés dans ce manuscrit ont été effectués au sein de l’Equipe d’Accueil « Conception, Ingénierie et Développement de l’Aliment et du Médicament » (EA-CIDAM 4678), de l’Université d’Auvergne, dirigée par le Professeur Monique Alric et l’équipe PB2P (Protéolyse et Biofonctionnalités des Protéines et des Peptides) du laboratoire URAFPA, de l’Université de Lorraine, dirigée par le Professeur Annie Dary-Mourot. Ces travaux ont été réalisés sous la direction du Docteur Stéphanie Blanquet-Diot (EA-CIDAM) et du Professeur Annie Dary-Mourot (PB2P, URAFPA).

Le laboratoire EA-CIDAM possède une expertise reconnue dans le domaine de la digestion artificielle. Cette équipe a mis en place une plate-forme technologique associant des modèles in vitro de mastication, digestion, fermentation et absorption à des technologies de formulation et des outils moléculaires de génomique et post-génomique. L’objectif de cette équipe est de développer des produits ou des concepts innovants dans le domaine de la Nutrition et Santé Humaine ou Animale. Actuellement, leur recherche s’oriente autour des conditions physiopathologiques dans l’environnement digestif humain associées (i) au vieillissement, (ii) à la présence de polluants d’origine alimentaire et (iii) à la présence de bactéries pathogènes comme les Escherichia coli entérohémorragiques (EHEC) ou encore enterotoxinogènes (ETEC). Pour chacune de ces conditions, l’équipe évalue l’intérêt de stratégies basées sur l’utilisation de souches probiotiques.

L’équipe PB2B de l’URAFPA s’intéresse aux produits laitiers en tant que vecteurs d’ingrédients qui pourraient en modulant certaines fonctions physiologiques du consommateur maintenir ou renforcer sa santé, et ainsi prévenir certaines pathologies. L’équipe a développé une expertise sur le lait et la production de peptide bioactifs à partir des protéines du lait. Elle s’intéresse également à S. thermophilus et cherche (i) à caractériser son système protéolytique afin de produire des peptides bioactifs à partir des protéines du lait, (ii)

(18)

Avant-Propos

3 à évaluer son potentiel probiotique et (iii) à étudier son comportement dans l’environnement digestif humain.

Ainsi, les objectifs de cette thèse ont été, dans un premier temps, d’évaluer la capacité de survie de plusieurs souches de S. thermophilus en conditions digestives humaines simulées dans le modèle gastro-intestinal TIM (TNO gastro-intestinal model) de l’EA-CIDAM et l’influence du mode d’administration des souches. Dans un second temps, un outil basé sur la technologie R-IVET (Recombinase-based In Vivo Expression Technology) a été développé chez S. thermophilus afin d’identifier les gènes qui sont exprimés dans un environnement complexe comme le tractus digestif humain. Puis, nous avons cherché à optimiser l’outil R-IVET par construction d’un système de sélection positif. Enfin, nous avons étudié le comportement de S. thermophilus dans l’environnement digestif en recherchant des gènes activés en conditions digestives humaines simulées en combinant l’outil R-IVET au modèle gastro-intestinal TIM et à des systèmes batch simples reproduisant l’environnement colique humain.

La première partie de ce manuscrit présente le contexte scientifique général. Cette synthèse bibliographique s’articule autour de trois chapitres. Un premier chapitre introductif décrit la physiologie générale du tractus digestif humain, les conditions rencontrées dans la lumière gastro-intestinale chez l’homme ainsi que les principaux modèles in vitro permettant de modéliser l’environnement digestif humain. Un second chapitre est consacré à

S. thermophilus et récapitule les données disponibles sur sa survie dans l’environnement

digestif ainsi que ses propriétés probiotiques. Ce chapitre est rédigé sous la forme d’une revue scientifique que nous souhaiterions soumettre à Journal of Functional Foods. Enfin, un dernier chapitre décrit les technologies génétiques utilisées pour identifier/étudier l'expression de gènes qui sont importants pour la survie et la physiologie des bactéries dans des environnements complexes tels que le tractus digestif humain. Les résultats expérimentaux sont exposés sous la forme de trois publications (deux parues et une en préparation) puis commentés dans la seconde partie de ce manuscrit. Enfin, dans la partie discussion générale et conclusion, l’ensemble des résultats de cette thèse sera discuté et des perspectives concernant l’ensemble de ce travail proposées.

(19)

(20)

5

Première partie ‒ synthèse bibliographique ‒

P

remière PARTIE

(21)

(22)

7

CHAPITRE 1: LA DIGESTION HUMAINE ET SA MODELISATION IN VITRO

Chapitre 1

La digestion humaine et sa modélisation

in vitro

SOMMAIRE

1. Le tractus gastro-intestinal humain ... 9 1.1. Histologie du tube digestif... 9 1.2. Digestion bucco-œsophagienne ... 11 1.3. Digestion gastrique ... 12 1.4. Digestion intestinale ... 15 1.5. Digestion colique ... 22 1.6. Microbiote digestif ... 23 2. La digestion artificielle: modèles in vitro de digestion humaine ... 26 2.1. Modèles gastriques ... 26 2.2. Modèles gastro-intestinaux ... 29 2.3. Avantages et limites des systèmes de digestion in vitro ... 37

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Chapitre 1: La digestion humaine et sa modélisation in vitro

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CHAPITRE 1: LA DIGESTION HUMAINE ET SA MODELISATION

IN VITRO

La digestion humaine est définie par un ensemble d’actions mécaniques, chimiques et fermentaires liés au fonctionnement de l’appareil digestif. Cette succession d’étapes, où chaque partie du tractus digestif à un rôle spécifique, permet la transformation des aliments en nutriments. L’appareil digestif assure le transfert des nutriments, de l’eau et des électrolytes apportés par l’alimentation vers l’organisme. Ce chapitre présente les paramètres essentiels de la digestion ainsi que les différents modèles in vitro développés pour reproduire la digestion gastro-intestinale humaine.

1. Le tractus gastro-intestinal humain

L’appareil digestif est constitué de la bouche, du pharynx, de l’œsophage, de l’estomac, de l’intestin grêle (duodénum, jéjunum et l’iléum), du gros intestin (caecum, appendice, côlon ascendant, côlon transverse, côlon descendant, côlon sigmoïde et rectum) et de l’anus. Associés au tube digestif, les organes digestifs sont les glandes salivaires, le foie, la vésicule biliaire et le pancréas (Figure 1) (Sherwood, 2015).

1.1. Histologie du tube digestif

De l’œsophage à l’anus, la paroi du système digestif est constituée de quatre couches principales, les tuniques: la séreuse, la musculeuse, la sous-muqueuse et la muqueuse de la couche la plus externe à la plus interne. Selon le segment du tractus digestif considéré, les tuniques sont constituées d’un tissu prépondérant avec des épaisseurs différentes (Figure 2).

Formant le péritoine viscéral, la séreuse est la tunique la plus externe du tube digestif et a un rôle essentiellement protecteur. Elle est composée de tissu conjonctif lâche aréolaire recouvert d’une couche de cellules épithéliales squameuses, le mésothélium. Néanmoins l’œsophage qui est situé dans la cavité thoracique, ne possède pas de séreuse, cette tunique est remplacée par une enveloppe fibreuse ordinaire appelée adventice.

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Figure 1: Organisation générale du système digestif humain et des glandes annexes Le système digestif humain est composé de la cavité buccale, du pharynx, de l’œsophage, de l’estomac (proximal [1] et distal [2]), de l’intestin grêle (duodénum [3], jéjunum [5] et iléum [6]), du gros intestin (côlon ascendant [7], côlon transverse [8], côlon descendant [9], côlon sigmoïde [10]), du rectum et de l’anus. Des organes et glandes annexes sont également associés à ce système: les trois principales glandes salivaires (parotides, sublinguales et submandibulaires), le pancréas, le foie, la vésicule biliaire et l’appendice. [4] Valvule iléocæcale. (Modifié d’après Sherwood, 2015).

La musculeuse est composée de deux couches de cellules musculaires lisses: une couche circulaire interne et une couche longitudinale externe. Elles sont contrôlées par un système nerveux autonome grâce à des neurones entériques présent entre les deux couches de fibres musculaires. Le péristaltisme et le brassage du bol alimentaire (ou chyme) résultent de l’activité conjointe des deux couches musculaires. Au niveau des sphincters, la musculeuse est plus épaisse et contrôle le passage du chyme d’un organe à un autre.

La sous-muqueuse est constituée d’un tissu conjonctif alvéolaire épais responsanble de l’elasticité du tube digestif. Ce sont les fibres élastiques abondantes de cette tunique qui permettent à l’estomac de revenir à sa forme initiale après un repas copieux. Cette tunique présente des neurofibres et est riche en vaisseaux sanguins et lymphatiques qui desservent les tissus environnants.

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11 La muqueuse est la tunique la plus interne du tractus. L’épithélium qui la constitue est directement en contact avec la lumière du tube digestif. Cette couche remplit différentes fonctions: (i) la sécrétion d’enzymes digestives et d’hormones, (ii) l’absorption des produits de digestion et leur transfert dans le sang et (iii) elle forme une barrière protectrice. La muqueuse est une barrière (i) physique: cohésion des cellules épithéliales, (ii) chimique: production de mucus et de sécrétions défensives et protectrices et (iii) immunitaire: interaction entre les cellules épithéliales et le système lymphoïde associé au tube digestif (Marieb et Hoehn, 2015).

Figure 2: Structure fondamentale du tube digestif

La paroi du tube digestif est composée de quatre couches principales: la muqueuse, la sous-muqueuse, la musculeuse et la séreuse (de la couche la plus interne à la plus externe) (Marieb et Hoehn, 2015).

1.2. Digestion bucco-œsophagienne

Dans la cavité orale débute les premières étapes de la digestion: la mastication et la sécrétion de salive. Par l’action des dents, des joues et de la langue, la mastication prépare les aliments en réduisant la taille des particules et forme le bol alimentaire favorisant l’action des enzymes digestives intestinales. La salive, sécrétée par les trois paires de glandes salivaires: parotides, submandibulaires et sublinguales, est constituée essentiellement d’eau (95 % à 99,5 %), d’électrolytes, de protéines tel que des enzymes ou des immunoglobulines, de l’urée

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et de l’ammoniaque (de Almeida et al., 2008). La salive a pour rôle de favoriser la formation du bol alimentaire lors de la mastication et la déglutition ainsi que d’hydrolyser des polysaccharides en dextrines grâce à l’activité de l’amylase salivaire qui se poursuit dans l’estomac jusqu’à son inhibition par l’acidité gastrique (Dawes et al., 2015). Lors de la déglutition, un acte reflexe, le bol alimentaire est poussé à l’arrière de la cavité buccale par l’action de la langue, dans le pharynx, puis il est entrainé jusqu’à l’estomac par des contractions péristaltiques de l’œsophage qui sécrète du mucus afin de faciliter cette progression (Sherwood, 2015).

1.3. Digestion gastrique

1.3.1. Anatomie et péristaltisme de l’estomac

L’estomac est une poche de 15 à 25 cm de long en forme de « J » (Figure 1). A jeun, le pH gastrique à une valeur médiane de 1,55. Lors d’un repas, le pH gastrique augmente suite à la présence des aliments pour atteindre une valeur comprise entre 5 et 6 lors des premières minutes post-ingestion, puis dans les deux heures post-ingestion, le pH gastrique diminue pour atteindre des valeurs inférieures à 2 (Malagelada et al., 1979; Van Wey et al., 2014). A jeun, son volume est d’environ 50 mL et peut augmenter jusqu’à 1,5 à 2 L (même jusqu’à 4 L) en phase postprandiale.

L’estomac a un rôle de stockage et de brassage des aliments. Le bol alimentaire arrive dans l’estomac en passant par le cardia (Figure 3) qui reste fermé après le passage des aliments pour réduire le risque de reflux œsophagien. La partie proximale de l’estomac, constituée du fundus et du corps (Figure 3), joue un rôle de réservoir des aliments déglutis. L’essentiel des sécrétions digestives est sécrété dans cette région. La partie suivante correspond à l’estomac distal ou antre (Figure 3) qui assure la fragmentation des solides et leur homogénéisation avec les sécrétions gastriques et régule la vidange du produit de la digestion dans le duodénum. A l’extrémité de l’estomac se trouve le pylore qui ferme l’estomac.

En présence d’aliments, les fibres musculaires circulaires internes de la paroi gastrique se contractent pour former un anneau qui se propage du cardia au pylore à la fréquence de trois contractions par minute. Ces ondes péristaltiques sont responsables du mélange des aliments avec les sécrétions digestives pour obtenir le chyme. Chaque contraction pousse le chyme vers le pylore qui joue un rôle de filtre et laisse passer une petite quantité de chyme (5 à 30 mL), composé de liquide et de particules de taille inférieure à 1 ou 2 mm, vers le

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13 duodénum. Le reste du chyme reflue vers le centre de l’estomac afin d’être d’avantage dégradé. Lorsqu’une onde péristaltique atteint le pylore, celui-ci se referme (Khan et al., 2009; Marieb et Hoehn, 2015; Sherwood, 2015). Le temps de transit gastrique médian chez l’Homme, pour un repas standard (1500 kJ) a été estimé à environ 56 min (Worsöe et al., 2011).

Figure 3: Anatomie de l’estomac

L’estomac débute au niveau du cardia et se termine au pylore. Il est constitué de trois parties: le fundus et le corps formant la partie proximale et ayant un rôle de réservoir alimentaire et de sécrétion des sucs digestifs et l’antre ou estomac distal ayant un rôle de fragmentation du bol alimentaire (Marieb et Hoehn, 2015).

De nombreux facteurs peuvent influencer la vitesse d’évacuation du chyme, les principaux étant le volume et la fluidité du contenu gastrique. La composition d’un repas est aussi un autre facteur qui régule directement la vidange gastrique. Par exemple, un bol alimentaire riche en lipides inhibe fortement la vidange gastrique. Enfin, des facteurs extra-digestifs peuvent également influencer la vidange gastrique tels que les émotions (tristesse, colère, peur) ou encore la douleur. Ces effets dépendent essentiellement des individus et sont donc imprévisibles (stimulation ou inhibition de la vidange gastrique) (Sherwood, 2015).

1.3.2. Sécrétions gastriques

La paroi gastrique est constituée d’invaginations, les cryptes de l’estomac, qui sont constituées des cellules glandulaires sécrétrices responsables de la production des sucs gastriques: les cellules à mucus, les cellules pariétales, les cellules principales et les cellules

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endo/paracrines (Figure 4). La sécrétion gastrique est stimulée par le système parasympathique, à la vue, l’odeur et le goût des aliments.

Les cellules à mucus du collet sécrètent du mucus alcalin et du bicarbonate de sodium (NaHCO3) afin de protéger la muqueuse gastrique contre les agressions mécaniques,

l’auto-digestion et l’acidité gastrique. Les cellules pariétales, ou bordantes, sécrètent de l’acide chlorhydrique (HCl), contribuant à l’acidification du pH gastrique et de la dénaturation des protéines (ruptures des ponts disulfures et des liaisons hydrogènes), et le facteur intrinsèque, une glycoprotéine nécessaire à l’absorption de la vitamine B12 au niveau intestinal. Les

cellules principales, ou peptiques, sécrètent le pepsinogène qui est le précurseur d’une endopeptidase, la pepsine, activée par hydrolyse acide et la lipase gastrique impliquée dans la digestion des lipides. Enfin, les cellules endo/paracrines (des cellules enterochromaffine-like (ECL), G et D) sécrètent des hormones telles que la gastrine et l’histamine stimulant la production d’HCl par les cellules pariétales, la sérotonine provoquant la contraction des couches musculaires lisses entourant l’estomac, la somatostatine régulant la sécrétion des hormones et la ghréline stimulant l’appétit (Marieb et Hoehn, 2015; Sherwood, 2015).

Figure 4: Structure de la muqueuse de l’estomac

(a) Coupe longitudinale de la paroi de l’estomac qui est constituée de la séreuse (enveloppe externe de l’estomac), de la musculeuse (trois couches de fibres musculaires), de la sous-muqueuse (tissu conjonctif) et la muqueuse (paroi interne de l’estomac contenant les cryptes et les glandes gastriques). (b) Schéma des cryptes et des glandes gastriques. (c) Emplacement des cellules composant une glande gastrique. Quatre types de cellules composent les cryptes de l’estomac: les cellules à mucus (production de mucus), les cellules pariétales (production de acide chlorhydrique et du facteur intrinsèque), les cellules endo/paracrines (production de la gastrine, l’histamine, la somatostatine et la ghréline), et les cellules principales (production de pepsinogène et de lipase) (Marieb et Hoehn, 2015).

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15 1.4. Digestion intestinale

La quasi-totalité de la digestion du chyme et de l’absorption a lieu dans l’intestin grêle. L’essentiel du processus de digestion s’effectue par les sécrétions de la muqueuse intestinale et par les sécrétions des glandes annexes: le pancréas, le foie et la vésicule biliaire qui lui sont associés (Figure 1).

1.4.1. Anatomie et péristaltisme de l’intestin grêle

L’intestin grêle est la partie la plus longue du système digestif, il mesure 6 à 7 m (maintenue à 2 à 4 m avec le tonus musculaire). Il s’étend du pylore à la valvule iléocæcale et est divisé en trois partis: le duodénum (20 cm), le jéjunum (2,5 m) et l’iléum (3,5) (Figure 1). Chez l’Homme, après une période de jeune, les pH médians de ces trois sections sont respectivement 6,4; 7,1 et 7,4 (Fallingborg et al., 1998). A jeun, son volume est de 100 mL et peut atteindre un volume de 500 mL en phase postprandiale. Le temps de transit médian dans l’intestin grêle de 4 h environ (Worsöe et al., 2011).

Le duodénum est incurvé autour de la tête du pancréas et reçoit les sécrétions digestives des glandes annexes au système digestif (foie, vésicule biliaire et pancréas). Le conduit cholédoque et le conduit pancréatique, apportant respectivement la bile produit par le foie et le suc pancréatique, se rejoignent au niveau de l’ampoule hépato-pancréatique, également nommée ampoule de Vater. Cette ampoule déverse son contenu dans le duodénum par la papille duodénale majeure. Les apports en bile et suc pancréatique dans le duodénum sont régulés par le muscle sphincter de l’ampoule hépato-pancréatique. En ce qui concerne le jéjunum et l’iléon ne se distinguent que par leur couleur, rose pâle et rouge, respectivement.

La grande capacité d’absorption de l’intestin grêle est liée à une adaptation structurelle de la muqueuse et de la sous-muqueuse, qui augmente considérablement la surface totale d’échange, jusqu’à atteindre 200 m2

. La muqueuse et la sous-muqueuse forment des plis circulaires (Figure 5a) atteignant des hauteurs de 1 cm et donnant un mouvement tourbillonnant au chyme favorisant son mélange avec les sécrétions intestinales. Ce phénomène permet d’augmenter l’absorption des nutriments en ralentissant la progression du chyme. La surface d’absorption est augmentée par la présence d’invaginations et de replis sur les plis circulaires, ce sont les villosités (Figure 5b). Ces villosités, d’une hauteur de 1 mm, sont plus nombreuses et plus larges au niveau du duodénum, elles deviennent plus étroites et plus courtes au fur et à mesure de la progression vers l’extrémité iléale. L’épithélium intestinal est constitué d’entérocytes dont la face apicale du côté de la lumière intestinale

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présente de très nombreuses évaginations, les microvillosités, qui forment une bordure en brosse (Marieb et Hoehn, 2015; Sherwood, 2015).

Figure 5: Représentation de la structure de l’épithélium intestinal

(a) Structure de la muqueuse de l’intestin grêle formant des plis circulaires. (b) Structure d’une villosité avec l’agrandissement d’un entérocyte constituant l’épithélium intestinal (Sherwood, 2015).

Lors de la digestion du chyme, le péristaltisme qui parcourt l’intestin grêle est différent de celui de l’estomac. Les cellules musculaires circulaires, constituant la paroi intestinale, se contractent en ondes de segmentation (succession de contractions et de relaxations stationnaires) qui induisent la fragmentation du contenu intestinal. Ces ondes mélangent le chyme aux sécrétions intestinales et induisent une progression du chyme suffisamment lente pour être optimale (Khan et al., 2009; Sherwood, 2015).

1.4.2. Cellules et sécrétions de la muqueuse intestinale

La muqueuse est la couche la plus complexe de la paroi intestinale. Elle est composée d’un épithélium complexe qui repose sur la sous-muqueuse intestinale, riche en vaisseaux sanguins et lymphatiques. La muqueuse et sous-muqueuse intestinales ont une structure riche en replis, les villosités, et en invagination, les cryptes de Lieberkühn (Figure 6). Les cryptes de Lieberkühn ont un rôle dans l’homéostasie cellulaire et dans le renouvellement des cellules de l’épithélium de l’intestin grêle (présence de cellules souches au fond des cryptes).

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17 Figure 6: Représentation schématique de la structure de l’épithélium de l’intestin grêle Quatre type de cellules composent l’épithélium, issus de la différentiation des cellules souches situées au fond des cryptes intestinales: (i) les entérocytes (absorption de nutriments), (ii) les cellules de Paneth (sécrétion de peptides antimicrobien), (iii) les cellules entéroendocrines (sécrétion d’hormones) et (iv) les cellules caliciformes (sécrétion de mucus). L’épithélium de l’intestin grêle possède des régions spécialisées, les follicules composés des cellules M (initiation de la réponse immunitaire) à la surface des plaques de Peyer (Modifié d’après Peterson et Artis, 2014).

L’épithélium intestinal, monostratifié, se compose principalement de quatre populations cellulaires dérivant de cellules souches pluripotentes et dont les proportions diffèrent selon les segments concernés: (i) les entérocytes (absorption de nutriments), (ii) les cellules caliciformes (sécrétion de mucus), (iii) les cellules de Paneth (sécrétion de peptides antimicrobiens) et (iv) les cellules entéroendocrines (sécrétion d’hormones). Les cellules sont liées entre elles par des jonctions serrées et des desmosomes formant ainsi une barrière physique étanche. Des cellules immunitaires, les cellules M (microfold cells), sont retrouvées aux niveaux de l’iléon (Du et al., 2015; Peterson et Artis, 2014; Roth et al., 2012).

1.4.2.1. Entérocytes et absorption des nutriments

Dans la lumière de l’intestin, la digestion des lipides est complète alors que celle des glucides et des protéines est incomplète. La digestion de ces derniers est achevée au niveau de la bordure des cellules épithéliales intestinales. Les entérocytes (Figure 6) qui constituent environ 80 % des cellules de l’épithélium intestinal, ont avant tout un rôle d’absorption mais aussi un rôle digestif. Des enzymes hydrolytiques, synthétisées directement par la cellule ou absorbées à partir du chyme et des sucs pancréatiques, sont ancrées à la membrane cellulaire

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des entérocytes (au niveau du pôle apical). Ces enzymes hydrolytiques sont: les entéropeptidases qui activent le trypsinogène, une pro-enzyme pancréatique sécrétée dans le duodénum, en trypsine, les disaccharidases qui hydrolysent les disaccharides en sucres simples, et les aminopeptidases qui hydrolysent les extrémités aminées des polypeptides. Les protides et des glucides alimentaires seront alors absorbés par les entérocytes et apportés jusqu’aux capillaires sanguins présent sous l’épithélium intestinal.

Les produits de digestion peuvent être absorbés par trois mécanismes distincts: (i) la diffusion passive: passage des nutriments selon un gradient de concentration à travers la membrane des entérocytes, (ii) la diffusion facilitée: passage des nutriments assuré par des transporteurs membranaires selon un gradient de concentration et (iii) le transport actif: passage des nutriments contre le gradient de concentration qui utilise des transporteurs membranaires et de l’énergie ou encore un co-transport avec d’autres molécules.

1.4.2.2. Cellules caliciformes et production de mucus

Les cellules caliciformes sont présentes entre les entérocytes au niveau des villosités et des cryptes. Ces cellules produisent en continu du mucus, une sécrétion acqueuse de 2 % de mucine (Figure 6). Une couche de mucus recouvre l’intestin grêle et concentre les peptides antimicrobiens produits par les cellules de Paneth et les Immunoglobulines A. Cette couche de mucus constitue une barrière physique étanche aux microorganismes et aux toxines qu’ils produisent et permet leur maintien à distance de l’épithélium (Peterson et Artis, 2014).

1.4.2.3. Cellules de Paneth et sécrétions de peptides antimicrobiens

Les cellules de Paneth sont présentes uniquement au fond des cryptes intestinales (Figure 6). Elles jouent un rôle important dans la sécrétion de peptides antimicrobiens, bien que tous les types cellulaires de l’épithélium intestinal participent à ce processus. Ces molécules antimicrobiennes sont sécrétées dans le mucus et participent à la protection contre les bactéries du microbiote et les agents pathogènes en formant une barrière protectrice bactéricide (action lytique par destruction partielle de la paroi bactérienne). Ces molécules sont les défensines, la phospholipase A2 (sPLA2), RegIIIγ, l’angiogénine, les cathélicidines et les lectines de type C (Antoni et al., 2014; Bulet et al., 2004). Les lectines de type C jouent un rôle important dans la réponse immunitaire, elles activent les fonctions immunitaires telles que la phagocytose en se liant aux microorganismes. Les défensines-α sont sécrétées en réponse immédiate à la présence de bactéries (Nakamura et al., 2016; Selsted et Ouellette, 2005).

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Au niveau de la paroi de l’intestin, la lamina propria située sous l’épithélium présente des follicules lymphoïdes épars ou agrégés qui font partie du MALT (Mucosa-Associated Lymphatic Tissue). Ces plaques, plaques de Pleyer, contribuent à la défense contre les agents pathogènes qui ont pu pénétrer le système digestif. Leur nombre augmente vers l’extrémité distale de l’intestin grêle. Elles sont constituées d’un domaine sous-épithélial qui sépare la plaque de Peyer de l’épithélium intestinal contenant des lymphocytes B et d’un centre germinatif contenant des lymphocytes B (produisant des IgA), des lymphocytes T et des macrophages (Figure 6).

Les plaques de Peyer sont encadrées par un épithélium associé au follicule (FAE) principalement composé de cellules M intercalées entre les entérocytes et de cellules dendritiques (Figure 6). Les cellules M, très actives dans la phagocytose et la transcytose, sont impliquées dans l’échantillonnage d’antigènes et de microorganismes présents dans la lumière intestinale pour la présentation au système immunitaire sous-jacent, notamment aux cellules dendritiques, et initier une réponse immunitaire de la muqueuse (Ohno, 2016; Peterson et Artis, 2014).

1.4.3. Sécrétions des glandes annexes et rôle dans la digestion

Dans l’intestin grêle, la digestion chimique dépend des sécrétions biliaires et pancréatiques sécrétées par les organes digestifs annexes: le foie, la vésicule biliaire et le pancréas (Figure 7).

Figure 7: Organes annexes du système digestif

La synthèse des différentes sécrétions digestives est assurée par le pancréas, le foie et la vésicule biliaire: le suc pancréatique se déverse par le canal de Wirsung dans le duodénum; la bile est sécrétée par le foie directement ou stockée dans la vésicule biliaire avant d’être déversée dans le duodénum par le canal cholédoque.

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1.4.3.1. Le foie, la vésicule biliaire et la sécrétion de bile

De nombreuses fonctions régulatrices et métaboliques sont assurées par le foie, mais son unique rôle direct dans la digestion est la synthèse de bile avec une production moyenne de 0,8 à 1 L par jour. La vésicule biliaire est une petite poche musculeuse capable de stocker la bile produite par le foie. Elle peut contenir un volume de 10 à 50 mL de bile concentrée suite à l’absorption d’eau et d’ions. La bile ainsi contenue dans la vésicule est 4 à 6 fois plus concentrée que la bile hépatique. Avant sa libération, la concentration de la bile peut même atteindre un facteur 10 à 20 fois supérieures, et dans certains cas dépasser les limites de solubilité des acides biliaires, engendrant des calculs.

La bile est déversée dans le duodénum via le canal cholédoque à une hauteur de 500 mL par jour. Elle est composée d’eau, de sels biliaires (molécules amphiphiles dérivées du cholestérol), de sels minéraux, de cholestérol, de lécithine, de pigments biliaires (bilirubine et biliverdine). Chez l’Homme, les principaux sels biliaires primaires sont l’acide cholique et l’acide chénodéoxycholique. Lors de la digestion, les sels biliaires permettent la digestion des lipides en les émulsifiant (formation de micelles lipidiques), ce qui favorise l’activité de la lipase pancréatique. Au niveau de l’iléum, la majorité des sels biliaires (95 %) est réabsorbée vers le sang, grâce à un système de transport actif, et retourne au foie par l’intermédiaire de la veine porte hépatique. Dans le foie, ils seront reconjugués et pourront à nouveau être sécrétés dans la bile. Ce phénomène de recyclage des sels biliaires correspond au cycle entéro-hépatique et celui-ci se repète deux à trois au cours d’un repas (Marieb et Hoehn, 2015; Sherwood, 2015). Dans le duodénum, les concentrations initiales en sels biliaires sont de 10 à 15 mmol/L et diminuent progressivement dans les deux heures après le repas pour atteindre une valeur de 5 mmol/L. Après un repas, les concentrations sont respectivement 10 mmol/L et 2 à 4 mmol/L dans le jéjunum et l’iléum (Northfield et McColl, 1973).

1.4.3.2. Le pancréas et les sucs pancréatiques

Le pancréas est une glande mixte ou amphicrine qui sécrète un ensemble d’enzymes, le suc pancréatique, permettant la dégradation des macromolécules du chyme. Le suc pancréatique est déversé dans le duodénum par le conduit pancréatique, aussi nommé le canal de Wirsung, qui fusionne avec le canal cholédoque juste avant le duodénum (au niveau de l’ampoule hépato-pancréatique). Le pancréas produit un volume d’enzymes quotidien, sécrété dans le duodénum, d’environ 1500 mL (Sherwood, 2015).

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21 Le tissu endocrine est composé des Îlots de Langerhans (1 % des cellules pancréatiques) qui sécrètent dans le sang des substances endocrines: insuline (hormone hypoglycémiante), glucagon (hormone hyperglycémiante), somatostatine (hormone régulatrice des sécrétions endocrines) et polypeptide pancréatique (inhibiteur de la sécrétion pancréatique exocrine). Le tissu exocrine est plus abondant et se compose de cellules acineuses sécrétant des quantités importantes de bicarbonate (neutralisation de l’acidité du chyme gastrique) et des proenzymes inactives. Le suc pancréatique est composé d’enzymes protéolytiques (trypsine, chymotrypsine, carboxypeptidase), de ribonucléases (RNase) et de désoxyribonucléases (DNase) utilisées pour la dégradation des résidus nucléotidiques, ainsi que des lipases et des amylases pancréatiques.

L’activation des enzymes a lieu dans la lumière duodénale afin de protéger le pancréas contre l’autodigestion. Elle débute par la conversion du trypsinogène en trypsine active par l’intermédiaire d’une protéase présente sur la bordure en brosse des entérocytes de la muqueuse duodénale: l’entéropeptidase ou entérokinase. La trypsine active alors plus de trypsinogène en trypsine ainsi que le chymotrypsinogène et le procarboxypeptidase en chymotrypsine et carboxypeptidase actives. Chacune de ces enzymes pancréatiques hydrolyse différentes liaisons peptidiques: la trypsine et la chymotrypsine sont des endopeptidases (coupent à l’intérieur de la chaine peptidique) et les carboxypeptidases sont des exopeptidases (libèrent acide-aminé en C-terminal ou N-terminal) (Khan et al., 2009; Marieb et Hoehn, 2015).

Seule la lipase pancréatique est capable de digérer les lipides. Secrétée sous forme active, elle hydrolyse les triglycérides des aliments en monoglycérides et acides gras libres, la forme absorbable des lipides. L’amylase pancréatique est sécrétée sous forme active et poursuit l’activité de l’amylase salivaire. Grâce à une activité plus forte que l’amylase salivaire, elle transforme l’amidon en dextrines puis en maltose.

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1.5. Digestion colique

Le gros intestin est la partie terminale du tractus digestif et s’étend de la jonction iléo-caecale à l’anus sur environ 1 m à 1,5 m et est constitué de plusieurs parties: le cæcum prolongé par l’appendice, le côlon ascendant, le côlon transverse, le côlon descendant, le côlon sigmoïde, le rectum et l’anus (Figure 8).

Figure 8: Anatomie du gros intestin

Le côlon humain est composé du côlon ascendant, du côlon transverse et du côlon descendant, suivis du côlon sigmoïde et du rectum (Marieb et Hoehn, 2015).

Le côlon a pour fonctions physiologiques la réabsorption hydro-électrolytique, la dégradation des composés non-digestibles et le stockage des selles avant défécation. Le côlon a un rôle essentiel dans le contrôle du volume et de la composition ionique des selles, en sécrètant les ions potassium et bicarbonate et en absorbant les ions sodium et chlorure (Khan

et al., 2009). Le côlon abrite une population microbienne dense qui participe à la fermentation

et/ou putréfaction de substrats exogènes (glucides non digérés ou non absorbés par l’intestin grêle) et endogènes (protéines issues de la desquamation cellulaire, enzymes digestives, mucus), ce qui conduit à la production de nombreux métabolites, tels que les vitamines B et K et les acide gras à chaines courtes. Les métabolites produits sont principalement absorbés et utilisés par l’hôte.

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23 L’épithélium colique est essentiellement composé de cellules caliciformes et d’entérocytes (les colonocytes). Cet épithélium se différencie de l’épithélium de l’intestin grêle par l’absence de plis et de villosités, les nutriments étant essentiellement absorbés dans l’intestin grêle. Les colonocytes sont responsables de l’absorption de l’eau et des électrolytes. De très nombreuses cellules caliciformes sécrétant un gel muqueux favorisent le glissement des particules alimentaires non digérées et des fèces. La production du mucus est la seule sécrétion produite dans le côlon. Le mucus produit est alcalin et à un rôle de protection des muqueuses contre les agressions chimiques et mécaniques. Le NaHCO3 neutralise les produits

acides résultant des fermentations bactériennes hébergées dans le côlon. Le mucus colique est constitué de deux couches: une couche interne fermement ancrée à la surface de l’épithélium et qui sert de barrière en empêchant le passage des bactéries et une couche externe formée à partir de la couche interne, non-ancrée à l’épithélium et plus lâche que la couche interne, ce qui permet le passage et la colonisation des bactéries (Johansson et al., 2013).

La progression des résidus le long du gros intestin est assurée par des contractions de segmentation lente et durant entre 12 et 24 h lors d’un transit normal. On considère que ce temps de transit est de 3 à 5 h dans le côlon ascendant, de 0,2 à 4 h dans le côlon transverse et de 5 à 72 h dans le côlon descendant et sigmoïde (Wilson, 2010).

1.6. Microbiote digestif

Le système digestif héberge une communauté d’environ 1014

microorganismes en symbiose avec l’hôte. Ce microbiote est majoritairement composé de bactéries mais la présence d’eucaryotes (appartenant principalement au règne des fungi comme les levures), de virus et d’archées est observée (Eckburg et al., 2005; Hugon et al., 2016; Walker et al., 2014). Le microbiote est composé de plus de 1000 espèces différentes, essentiellement anaérobie strictes, appartenant à différent phyla bactériens (Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria et Fusobacteria, Verrucomicrobia, Cyanobacteria et Spirochaetes) ainsi qu’à des Archae appartenant au phyllum des Euryarchaeota (Hugon et al., 2016).

Avant la naissance, le tube digestif est stérile. Le microbiote intestinal se met en place pendant les deux premières années de la vie. La colonisation des différentes espèces est influencée par les conditions variables d’environnement et d’hygiène, ce qui explique qu’à l’âge adulte, chaque individu héberge un microbiote qui lui est propre et relativement stable dans le temps (Qin et al., 2010; Rambaud et al., 2004).

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Figure 9: Espèces microbiennes dominantes dans les différentes régions du système digestif humain

Les trois phyla majoritaires sont les Firmicutes, les Bacteroidetes et les Actinobacteria. Les Proteobacteria et les Fusobacteria sont présents principalement au niveau buccal (Rambaud et al., 2004).

La population bactérienne n’est pas homogène sur l’ensemble du système digestif (Figure 9), en raison des différentes conditions rencontrées dans les différentes régions du tractus digestif (pH, niveau d’anaérobie, sels biliaires et composition de mucus) (Simrén et

al., 2013).

La cavité buccale présente une biomasse bactérienne d’environ 108 à 109 UFC/g, majoritairement représentée par les Firmicutes, Bactéroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria et les Fusobacteria. Ces phyla sont également retrouvés dans l’œsophage (Ahn et al., 2011; Rambaud et al., 2004).

Les conditions rencontrées dans l’estomac, où le pH est fortement acide, ont longtemps laissé penser que l’implantation de microbiote était impossible. La biomasse dans l’estomac est faible, allant de 101