Méthodes basées sur l’hybridation

5.2. Technique SCOTS ... 101 6. Méthodes basées sur les constructions génétiques ... 103 6.1. Méthode STM ... 103 6.2. Méthode IVET, R-IVET et DFI ... 105

Chapitre 3: Méthodes d’étude du transcriptome bactérien dans un environnement complexe

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CHAPITRE 3: MéTHodEs d’éTudE du TRAnsCRIPToME

bactérien dans un environnement

complexe

Les bactéries, organismes de très petite taille et d’organisation simple, sont néanmoins des systèmes complexes et dynamiques. Elles sont capables de s’adapter rapidement à un nouvel environnement par la modification de leur métabolisme et la production de nouvelles protéines.

Classiquement, les études sur la physiologie bactérienne sont réalisées in vitro en conditions de laboratoires. Si ces analyses ont permis la compréhension de nombreux mécanismes chez les bactéries, il est de plus en plus courant d’étudier la physiologie bactérienne en conditions complexes telles que celles rencontrées dans leur niche écologique ou dans le TGI. Des technologies sophistiquées ont été développées pour analyser les fonctions bactériennes activées dans ces environnements. Ce sont des méthodes permettant l’analyse du transcriptome (analyse des ARNs produits) et du protéome (analyse des protéines produites). L’analyse du transcriptome englobe des techniques permettant la détection de promoteurs induits ou la caractérisation des changements d’expression génique par la mise en évidence de transcrits (ARNm).

Au regard des travaux réalisés dans cette thèse, ce chapitre présentera uniquement les techniques de transcriptomique qui peuvent être séparées en deux catégories: les méthodes basées sur l’hybridation et les méthodes basées sur des constructions génétiques (An et Grewal, 2012). Ainsi les techniques d’analyse du transcriptome telles que le RNAseq, basée sur du séquençage à haut débit, ainsi que les techniques d’analyse du protéome comme l’électrophorèse bidimensionnelle sur gel ou encore les puces à protéines ne seront pas présentées.

5. Méthodes basées sur l’hybridation

Les méthodes basées sur l’hybridation correspondent aux puces à ADN (« cDNA microarrays ») et à la technique SCOTS (« Selective capture of transcribed sequences »).

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5.1. Technologie des puces à ADN

La biopuce est une technique couramment utilisée. En plus des puces à ADN présentées ici, il existe des biopuces à protéines (Atak et al., 2016; Gupta et al., 2016) et des biopuces à cellules vivantes (Elad et al., 2008; Jonczyk et al., 2016) qui fonctionnent sur le même principe.

Figure 26: Représentation du principe de la puce à ADN

Les ARNs provenant des deux conditions expérimentales à comparer sont extraits puis sont convertis en ADNc et marqués avec des fluorochromes différents. Les ADNc sont hybridés sur une puce qui comprend un grand nombre d’oligonucléotides ou d’ADNc provenant de la bactérie étudiée. Après hybridation sur la puce, les fluorochromes sont excités par un laser et la fluorescence émise est mesurée.

Les puces à ADN sont constituées de sondes immobilisées sur un support solide. Ces sondes sont des fragments d’ADN représentant la totalité ou une partie du génome étudié ou

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101 encore de l’ADN codant pour des éléments de régulation tels que les petits ARN (Gomez et

al., 2011). Le principe de la puce est simple (Figure 26). Les ARNm des microorganismes

étudiés dans des conditions différentes sont extraits puis convertis en ADNc et marqués par des fluorochromes. Lorsque les fluorochromes sont excités par un laser, un signal fluorescent est émis au niveau des sondes lorsque les ADNc marqués sont hybridés à celles-ci. Il est ainsi possible de comparer les niveaux d'ARNm produits par une bactérie cultivée dans des conditions différentes. L’utilisation de puces à ADN permet de mesurer/comparer rapidement les niveaux d’expression d’un grand nombre de gènes (génome complet) en même temps et ceci en utilisant une faible quantité d’ADNc (Cao et al., 2011).

Cependant, cette technique est limitée par la difficulté à extraire des ARNm bactériens de qualité suffisante à partir des conditions in vivo testées. L’ARNm bactérien a une demi-vie courte et est extrait avec une grande quantité d’ARNr et d’ARN provenant de l’environnement étudié. Les puces à ADN apparaissent alors peu adaptées à l’étude de l’état physiologique des bactéries dans un système in vivo complexe, comme le TGI humain. Cependant, cette technique a permis par exemple d’identifier les gènes exprimés par Vibrio (V.) cholerae dans l’intestin grêle de lapin (Xu et al., 2003). De plus, des puces à ADN sont utilisées pour étudier la diversité du microbiote intestinal (Tottey et al., 2013).

5.2. Technique SCOTS

La technique SCOTS permet de minimiser les facteurs limitant des puces à ADN dans les systèmes in vivo. En effet, cette méthode s’affranchit de la faible quantité de cellules bactériennes (contexte eucaryote-hôte) par l’amplification spécifique du transcriptome bactérien.

Cette approche complexe consiste en la combinaison d’une hybridation soustractive à des PCRs avec des amorces « taggées » permettant la capture des gènes bactériens exprimés dans un environnement particulier (Figure 27) (Graham et Clark-Curtiss, 1999). Comme pour la puce à ADN, l’ARN total bactérien et eucaryote est extrait et les ARNs sont ensuite convertis en ADNc à l’aide d’amorces spécifiques. L’amorce du côté 3’ est composée d’une séquence aléatoire tandis que l’amorce du côté 5’ contient un élément spécifique, le tag. Pour identifier les gènes bactériens transcrits en réponse à leur environnement, l’ADNc bactérien est séparé de l’ADNc non-bactérien par capture sélective. Les ADNc bactériens sont hybridés avec de l’ADN bactérien biotinylé permettant leurs captures par des billes recouvertes de streptavidine et leur retrait du mélange réactionnel. Ces ADNc sont ensuite récupérés pour

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être amplifiés par PCR avec les amorces tag. Les ADNc enrichis sont ensuite clonés dans un vecteur de clonage pour construire une banque de gènes activés ou réprimés dans l’hôte. Le séquençage des inserts permet d’identifier la nature du gène transcrit dans les conditions utilisées.

Figure 27: Représentation de la technique SCOTS (Selective capture of transcribed sequence)

A: Les ARN totaux bactériens et eucaryotes produits lors de la croissance dans deux conditions différentes (in vitro et in vivo) sont extraits puis convertis en ADNc double brins taggés par l’utilisation d’amorces 5’ spécifiques. Ces ADNc subissent une étape de normalisation permettant de ne recueillir que les ADNc d’origine bactérienne. B. Etape d’hybridation soustractive visant à recueillir les ADNc bactériens provenant de l’expression des gènes différemment exprimés entre les deux conditions de croissance (d’après An et Grewal, 2012).

La technique SCOTS a été initialement développée pour identifier des gènes exprimés par Mycobacterium tuberculosis dans les macrophages (Graham et Clark-Curtiss, 1999). Depuis, elle a été essentiellement utilisée pour identifier les gènes de bactéries pathogènes exprimés dans les conditions spécifiques d’infection de l’hôte (An et Grewal, 2012), comme par exemple lors de l’étude des interactions entre le pathogène S. agalactiae avec les macrophages (Guo et al., 2014) ou encore dans l’étude du pathogène Helicobacter pylori en conditions gastriques (Graham et al., 2002). Même si elle a été utilisée principalement pour

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103 étudier des interactions hôte/pathogènes, la technique SCOTS est applicable à tout type de bactérie, il est donc envisageable de l’appliquer à des probiotiques. De plus, cette technique peut-être utilisée dans l’environnement digestif puisque l’étude de Graham et al. (2002), citée ci-dessus, a été réalisé dans l’estomac de rongeurs.

La technique SCOTS ne nécessite pas une grande quantité et qualité d’ARNm ou d’informations génétiques préliminaires. A partir d’une faible quantité de cellules bactériennes, les gènes exprimés « in vivo » peuvent être détectés. Cependant, il ne s’agit pas de méthode de quantification pour l’étude d’expression des gènes. Toutefois, elle peut être combinée avec les puces à ADN, permettant ainsi de quantifier les niveaux d’expression des gènes exprimés dans des conditions complexes (An et Grewal, 2012).