Métabolisme azoté de S. thermophilus

Contrairement au métabolisme carboné, le métabolisme azoté de S. thermophilus est moins connu. Le lait comprend des composés azotés de deux types classés selon leur solubilité. La fraction soluble correspond aux molécules azotées non protéiques comme les acides aminés libres, les petits peptides, les vitamines du groupe B, les bases azotées et l’urée. La fraction non soluble est composée de molécules azotées de hauts poids moléculaires tels que les peptides constitués de plus de huit résidus, les caséines et les protéines solubles issues des glandes mammaires. Le lait étant pauvre en acides aminés libres et en petits peptides et

S. thermophilus étant auxotrophe pour certains acides aminés, la croissance en lait implique

(1) d’hydrolyser les caséines, (2) d’internaliser et/ou de dégrader les peptides résultants et (3) de synthétiser de novo des acides aminés (Hols et al., 2005).

3.3.2.1. Besoins en acides aminés

S. thermophilus requiert un apport exogène d’acides aminés pour sa croissance. Les

besoins en acides aminés dépendent des souches (Letort et Juillard, 2001).

La faible concentration en acides aminés libres dans le lait implique que la biosynthèse

de novo d’acides aminés devient nécessaire pour la croissance en lait de S. thermophilus.

L’analyse du génome de deux souches, CNRZ1066 et LMG18311, a montré la présence de la plupart des gènes codant les enzymes nécessaires à la synthèse des acides aminés, ce qui leur permettrait de synthétiser la plupart des acides aminés dont elles ont besoin (Hols et al., 2005). Des expériences d’omission ont montré qu’une majorité des souches de

S. thermophilus (13/15) testées ne pouvaient croître sans glutamate (Letort et Juillard, 2001).

De plus, la présence d’un cluster cbs-cblB(cglB)-cysE (également appelé cysM2-metB2-cysE2) chez ces souches serait impliqué dans la synthèse des acides aminés soufrés, présents en faible quantité dans le lait (Herve-Jimenez et al., 2008; Hols et al., 2005; Liu et al., 2009).

La plupart des souches de S. thermophilus sont capables de croître avec comme seule source d’acides aminés un mélange de glutamine, méthionine, leucine, valine et histidine. Ce

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51 qui implique que la plupart des voies de synthèse des autres acides aminés sont fonctionnelles (Hols et al., 2005). De plus, il a été montré que, même s’ils ne sont pas essentiels à la croissance, l’ajout de leucine, valine, méthionine et cystéine stimule la croissance de

S. thermophilus (Garault et al., 2000; Hols et al., 2005; Letort et Juillard, 2001).

3.3.2.2. Système protéolytique

Le système protéolytique de S. thermophilus est composé d’une protéase ancrée dans la paroi membranaire (PrtS) capable de dégrader les caséines, de systèmes de transport de peptides et d’acides aminés libérés et de peptidases intracellulaires nécessaires à la dégradation des peptides dérivés de la caséine (Hols et al., 2005) (Figure 25).

Etant donné que PrtS est la seule protéase qui a été identifiée chez S. thermophilus, sa présence ou son absence sont essentiels pour déterminer le profil protéolytique ou non-protéolytique des souches de S. thermophilus (Delorme et al., 2010; Galia et al., 2009; Shahbal et al., 1991). La protéase PrtS est essentielle pour la croissance de S. thermophilus lorsqu’il est présent seul dans le lait. Cependant en co-culture avec Lb. bulgaricus,

S. thermophilus est capable de croître en utilisant les peptides libérés par Lb. bulgaricus

(Courtin et al., 2002). Ceci pourrait expliquer l’absence de PrtS chez de nombreuses souches de S. thermophilus (Shahbal et al., 1991). Après clivage de la séquence signal par le système Sec, la protéase PrtS est ancrée de manière covalente dans la paroi de la bactérie par le motif LPXTG grâce à la sortase A (SrtA) qui est ancrée dans la membrane (Figure 25) (Chang et

al., 2012; Delorme et al., 2010; Fernandez-Espla et al., 2000). Deux types d’hydrolyse des

caséines par PrtS ont été identifiés: (i) PrtS clive préférentiellement après un résidu basique (arginine, lysine et histidine) agissant en cela comme la trypsine mais avec une activité étendue à l’histidine et (ii) PrtS clive après un résidu hydrophobe (leucine, phénylalanine, méthionine et tyrosine), activité ressemblant à l’activité chymotrypsine (Chang et al., 2014).

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Figure 25: Système protéolytique de S. thermophilus

(1) Export de la protéase PrtS immature par le système Sec et ancrage de la protéase PrtS dans la paroi par clivage du motif LPXTG (partie noire de PrtS immature supprimée) par la sortase A (SrtA). (2) Hydrolyse par PrtS de la caséine en oligopeptides. Ces derniers sont hydrolysés par la peptidase extracellulaire PepX. (3) Internalisation des oligopeptides par les systèmes de transport Ami, Ots et DtpT. (4) Hydrolyse des oligopeptides en acides aminés libres par les peptidases intracellulaires (Awussi et al., en préparation).

Le transport des peptides ou acides aminés chez S. thermophilus est assuré par le système DtpT (Proton dependant di-tripeptide transporteur), Ami et Ots (Figure 25) (Garault

et al., 2000; Jameh et al., 2016). Le système Ami est un transporteur de type ABC qui assure

le transport des oligopeptides jusqu’à 23 résidues (Garault et al., 2000). Il est constitué de deux protéines, AmiC et AmiD, qui forment le canal, de deux ATPases, AmiE et AmiF, qui fournissent l’énergie nécessaire au transport et de la protéine OBP (Oligopeptide binding proteins). Chez la souche LMD-9, neuf transporteurs de type ABC ont pu être identifiés: 2 transporteurs d’oligopeptides opp, 3 transporteurs d’acides aminés polaires, 2 transporteurs d’acides aminés ramifiés, 1 transporteur de la glutamine et 1 transporteur spermidine/putrescine (Goh et al., 2011). Le système DtpT est spécialisé dans le transport d’une large variété de di- et tri-peptides (Hols et al., 2005). Il a été montré que ce système serait surexprimé en fin de phase de croissance en lait (Herve-Jimenez et al., 2008). Ce système a été identifié chez toutes les souches provenant de la collection de 30 souches de

Paroi Membrane Cytoplasme Milieu extracellulaire Système Ami Système Ots Système DtpT Sec PrtS PrtS Forme immature Forme mature SrtA 1 PepX Caséine 2 ₃

Systèmes de transport des oligopeptides

Acides aminés libres

PepO Endopeptidases PepF Oligopeptidases PepB PepQ Peptidases proline-spécifiques PepP PepX PepF Aminopeptidases non-spécifiques PepB PepA Aminopeptidases spécifiques PepM PepS PepV Di- et tri-peptidases PepT 4

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53 l’équipe PB2P et l’analyse des protéines a montré qu’il était bien conservé (98 à 100 % d’identité parmi les souches) (Jameh et al., 2016). Le système Ots (Oligopeptide Transporter) est un transporteur de type ABC peptide/nickel qui permet le passage d’oligopeptides (di-et tri-peptides). Il est constitué de OtsB et OtsC qui forment le canal de transport, OtsD une double ATPase fournissant l’énergie et OtsA appartenant à la famille des « peptide/nickel

binding proteins » (Jameh et al., 2016).

Une peptidase (PepX) ancrée dans la paroi ainsi qu’une quinzaine de peptidases intracellulaires ont pu être identifiées chez S. thermophilus (Hafeez et al., 2015, 2013; Rul et Monnet, 1997). Une fois internalisés dans la cellule, les peptides sont hydrolysés en acides aminés libres par l’action des peptidases intracellulaires. Elles incluent des aminopeptidases générales (large spécificité: PepC et PepN), des aminopeptidases spécifiques (PepA, PepS et PepM), des oligopeptidases (PepF et PepB), une endopeptidase (PepO), des di- et tri-peptisases (PepV et PepT) et des peptidases spécifique à la proline (PepX, PepQ et PepP) (Figure 25) (Goh et al., 2011; Hols et al., 2005).