Etude du polymorphisme des enzymes de détoxification des xénobiotiques dans le cancer du nasopharynx

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE MENTOURI DE CONSTANTINE FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE DEPARTEMENT DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE N° d’ordre :

N° de série :

THESE

Présentée pour l’obtention du diplôme de docteur en sciences Option :

Génétique-biologie moléculaire Par

KELLIL – BENDJEMANA KATIA

THEME

ETUDE DU POLYMORPHISME DES ENZYMES

DE DETOXIFICATION DES XENOBIOTIQUES DANS LE CANCER DU NASOPHARYNX

Soutenu le : 01 -07-2008

Devant le jury :

Président : ABADI. N Prof. Université de Constantine Rapporteur : SATTA. D Prof. Université de Constantine Examinateur : BENOUARETH. D Prof. Université de Guelma

BENDJEDDOU. D M.C. Université de Guelma BOURAS. M M.C. Université de Batna

DEDICACE

Je dédie ce travail :

A mon mari en témoignage de ma gratitude pour ses

encouragements, sa patience, son aide et son incitation à poursuivre

mon rêve

A mon fils Rachid anis a qui je souhaite un avenir plein de joie,

de réussite et de bonheur.

A mes parents en témoignage de ma reconnaissance pour tout

ce que je leur dois. Qu’ils trouvent ici l’expression de ma profonde

gratitude et de mon amour.

A ma belle famille pour leurs encouragements et leurs soutiens

A mon frère Mehdi et sa petite famille, ainsi qu'à la famille

Hanachi, Mme Djezzar, la famille Goudgil pour leurs soutiens.

Ainsi qu’a tous mes amis en particuliers tous ceux qui m’ont

procuré aide et réconfort durant la réalisation de ce travail. Avec

toute mon affection.

REMERCIEMENTS

Au terme de ce travail, il m’est agréable d’adresser mes plus vifs

remerciements à tous ce qui ont contribué à sa réalisation.

Je remercie mon professeur Mme SATTA Dalila de

l'université de Constantine pour sa précieuse aide et de

n

’avoir négligé aucun effort pour m'apporter soutien et

recommandation. Ces précieux conseils et ces qualités de

rigueurs scientifiques ont largement contribué à ma

formation.

Je

remercie

le

professeur

Mme

YEKHLEF

de

l'université de Constantine pour son aide

J’adresse mes remerciements à Monsieur le professeur

agrégé F ethi Guemira chef de service de biologie clinique

ainsi que le professeur agrégé Mme Monia Abdennebi de

l’institut Salah Azaiez de Tunis, pour m’avoir fait l’honneur

de me confier ce travail et permis de suivre mon stage

pratique au sein de leur laboratoire.

Je remercie également le président ainsi que tous les

membres du jury d'avoir bien voulu me faire l'honneur

d'examiner ce travail.

SOMMAIRE

INTRODUCTION

RAPPEL THEORIQUE

I-LES VOIES DE BIOTRANSFORMATIONS DES XENOBIOTIQUES 04

A-LES REACTIONS DE LA PHASE I 04

B- LES REACTIONS DE LA PHASE II 07

II-LES GLUTHATION -S-TRANSFERASES 08

A- GSTM1, gène et enzyme 10

1- Structure du gène GSTM1 10

2- polymorphisme 11

3- Varia tion de la fréquence du génotype GSTM1*0/0 12

4- Structure, substra ts et expression de l'enzyme GSTM1 12

B-GSTT, gène et enzyme

5- Varia tion de la fréquence du génotype GSTT1*0/0 16

6- structure, substrats et expression de l'enzyme GSTT1 16

III-LES N-ACETYL-TRANSFERASES 17

A- HISTORIQUE 17

B-PRINCIPALE FONCTION DES NAT 18

C- DETERMINISME GENETIQUE 21

D- STRUCTURE DES ENZYMES N-Acétyltransferases 22

E- POLYMORPHISME GENETIQUE 23

1-méthode de détermination phénotypique 24

2-polymorphisme du gène NAT1 25

3-polymorphisme du gène NAT2 27

IV- LES ENZYMES DU CYTOCHROMES P450 29

A- HISTORIQUE 30

B- CLASSIFICATION ET NOMENCLATURE 30

C- STRUCTURE 33

D-CYCLE REACTIONNEL 34

E- FONCTION BIOLOGIQUES DES CYTOCHROMES P 450 37 1- Métabolisme des substances endogènes 37 2- Métabolisme des xénobiotiques 37 V- REGULATION DE L'EXPRESSION DES ENZYMES 40

DE DETOXIFICATION 1 – origine non génétique 40 a1- facteurs endogènes 40 a2- facteurs exogènes 41 2- Origine génétique 44 VI- ASSOCIATION DES POLYMORPHISMES DE DETOXIFICATION 45 AU CANCER. A - ROLE DES ENZYMES DE DETOXICATION DANS 45

L’ACTIVATION DE S CARCINOGE NES CHIMIQUES. B- ASSOCIATION DU POLYMORPHISME GST AVEC LES CANCERS 46

1- Association de la délétion du gène GSTM1 et le cancer 47

2- Association du gène GSTT1 et le cancer 48

C- ASSOCIATION DU POLYMORPHISME NAT2 AVEC QUELQUES 48

P ATHOLOGIES D - ASSOCIATION DU POLYMORP HISME CYP 450 AVEC 50 LES CANCERS VII- LE CARCINOME DU NASOPHARYNX 51 A-RAPPEL ANATOMIQUE ET HISTOLOGIQUE DU NASOPHARYNX 51 B-ASPECTS ANATOMOPATHOLOGIQUES DES 53

CARCINOMES DU NASOPHARYNX C-EPIDEMIOLOGIE DU CARCINOME DU NASOPHARYNX 54

D-FACTEURS ETIOLOGIQUES DU CARCINOME DU NASOPHARYNX 55

1-Facteurs environnementaux 56 2- Facteurs génétiques 57 3-Fa cteur viral : le virus d’Epstein Barr (EBV) 57

MATERIELS ET METHODES

1-ETUDE DES DELETIONS DANS LES GENES GST P AR P CR MULTIPLEX 61

2-ETUDE DU POLYMORPHISME NAT PAR RFLP 63

3-NESTED PCR 64

4-D IGESTION PAR LES ENZYMES DE RESTRICTION 64

II I- AN AL YS E STATISTIQUE 66

A - CALCUL DES FRÉQUENCES ALLÉLIQUES 67

B- TEST χ2 67

C- ODDS RATIO 67

D- INTERVALLE DE CONFIANCE POUR LE OR 68

RESULTATS

I- CARACTERISTIQUES DES P OPULATIONS ETUDIEES 69 II - AN ALYSE DU POLYMORPHISME DES GENES GSTM1

ET GSTT1 70

II I- ANALYSE DU POLYMORPHISME NAT2 74

a-l’a lléle NAT2 *5 74

b -l’a lléle NAT2*6 75 c -l’a llèle NAT2*7 80 d -l’a lléle NAT2*14 81

IV -ANALYSE DES OR POUR LES ALLELES, LES GENOTYPES NAT*2

ET LE PHENOTYPE ACETYLEUR LENT AJUSTES SELON LE STATUT 83

FUMEURS/NON FUMEURS

V-ANALYSE DES ASSOCIATIONS ENTRE LES DIFFERENTS

GENOTYPES 85

DISCUSSION

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

ANNEXES

BIBLIOGRAPHIE

RESUME EN LANGUE ANGLAISE (ABSTRACT)

RESUME EN LANGUE FRANCAISE

RESUME EN LANGUE ARABE

De part notre en vironnement, l'homme est quotidiennement exposé à une gra nde variété de substances exogènes d'origines dive rses, rassemblées sous le te rme de xénobiotiques (du grec xenos , étranger). Il peut s 'a gir de produits naturels , des médica ments, des polluan ts de l'en vironnement: tox ines végétales et animales, additifs a limenta ires, herb icides, pe sticides , dérivés des combustibles domestiques et industrie ls , solvant et colorant.

Ces xénobiotiques sont généralement des substances hyd rophobes, peu volatiles et peu préc ipitables. Ces p ropriétés rendent diffic iles leur élimination urina ire. Ils ont une tendance n ature lle à s ’accumuler dans les phases lipidiques des me mbranes cellulaire s engendrant ainsi une toxicité , voire une mo rt cellu la ire inéluctable. Pour éviter cette accumulation, tous les org anismes vivants ont développé, au cours de l'évolution, des systèmes enzymatiques de biotrans formation et de détoxication. Le processus de détoxication représente l'ensemble des réactions biochimiques que subissent les substances endogènes et exogènes (xénobiotiques) dans le but de faciliter leur bio trans formation et leur exc rétion hors de l'org anisme.

La conception class ique de ce mé tabolisme vo it un ca rac tè re bi phasique compo rtant une ph ase I de "fo nctionnalisation " qu i a pour but d'aug menter la polarité de ces substances et les préparées à subir d'au tres transforma tions au cou rs des réactions de la phase II dites de "c onjugaison ". En ef fe t, cette dernière permet l'ajout d'un radical ch imique hydrophile tel que le g lutathion ou le groupement acéty le, soit directemen t sur le xénobio tiques inchangé , soit sur les métabolites "fo nctionnalisés" généré s par la phase I. L 'élimination de ces conjugués hyd rophiles s'effe ctue p ar des glycoprotéines memb ran aires permettant le transport ac tif des produits de la phase I I hors de la cellule .

Néanmoins, le métabolisme des xénobiotiques ne conduit pas toujours à la détoxication de ces composés. Dans certains cas, le p roduit oxydé ou métabolites in te rmédiaires p résentent l'inconvénient d'être forte ment réactifs et peuvent manifester des attaques électrophiles ou nucléophiles des macromolécules environnantes tel que l'A DN. Ainsi la formation d'addu its sur

l'ADN peut entra îne r l'apparition d'éventuelles mutations ponctuelles e t initier des processus de cancérogenèse .

La tolérance de l ’o rganis me aux xénobiotiques présente une importante hétérogénéité inte rindividuelle . Celle ci résulte en grande partie d ’une variabilité dans l’activité des enz ymes de biotransfo rmation et ce, en raison de 2 ty pes de facteurs :*De s fac teurs exte rnes environnemen taux

*De s fac teu rs intrinsèques en particulier les polymorphismes génétiques, qui traduisen t les varia tions de la structure primaire d'un gène au sein d'une même e spèce. Ces v ariations stab les et transmises de manière mendélienne, cons tituent l ’origine molécula ire de la dive rsité phénotypique in tra-spécifique des individus.

Les po lymo rphismes génétiques sont accompagnés d ’effets fonctionnels et concernent de nombreuses enzy mes de pha se I comme de phase I I. Les enz ymes poly morphes majeurs en pharma cogénétiques sont les enzymes du cytoch rome P450 pou r la phase I, e t les NAT et GST pour la phase I I. Les variants enzymatiques connus sont présents à des fréquences variab les au sein des différentes populations humaines. Les différences phénotyp iques peuvent cependant être disc rètes et dépourvues d ’impact clin ique important.

Le cancer constitue l'un des problèmes de s anté à l'échelle mondiale et l'une des préoccupations ma jeu rs en matière de recherches scientifiques et médicales dans toutes les régions du globe. L'ampleur de cette morbidité n'a fa it que croître ces dern ières années . L ’Af rique du No rd n'a p as échappé à cette tendance.

Le c arcinome du nasopharynx (CNP) représente en Tunisie, le p remier cancer des voies aérodigestives supérieures chez la femme (42.3 %) et le deuxième, après le cancer du larynx chez l'homme (31 .29%) [1].

En Algé rie, les données épidémiologiques donnent un chiffre de 26347 nouveaux c as de cancer chaque année. Le cance r du nasopharynx représente la pre mière tumeur ORL avec 8 % des c ancers. [2 ]

La répartition géo graphique particuliè re du CNP , laisse pense r que des fa cteurs génétiques associés ou non à des fa cteurs en vironnementaux sont à l’origine de cette observation. Parmi les f acteurs environnementaux suspectés, les subs tances chimiques ca rcinogènes du tabac, les nitros amines proven ant de la fu mée du charbon et les e xpositions professionnelles au c aoutchouc et aux matières plastiques semblent de plus en p lus incriminées.

Les études faites en Afrique e t en Af rique du no rd dont le sujet est l'établissement d'une relation entre les enz ymes du métabolisme des xénobiotiques e t le cancer, sont peu nombreuses et parfois mê me qua siment absente en ce qui concerne le cancer du n asopharynx [3].

Objectif du travail

Notre trav ail v ise à établir une étude sur 66 pa tients ayant un cancer du nasopha ryn x e t 100 témo ins . Dans cette étude nous nous sommes inté ressé aux polymorphismes génétiques des enzymes de la phase II de déto xific ation, à trave rs l’étude des gènes de la g lutathion -S- transfé rases de classe thêta et mu (GSTM1, GSTT1) ainsi que le gène de la N-acé tyltrans fé rase de type I I (NAT2 ), et ce la afin d'explorer les facteurs génétiques potentiellemen t liés au cancer du nasopha ryn x e t définir ainsi l’implica tion de ces gènes de dé tox ic ation dans ce cancer, qui semble de plus en plus fo rtement associé à des fac teurs env ironnementaux.

I- LES VOIES DE BI OTRANSFORMATIONS DES XENOBIOTIQUES.

Un xénobiotique subit donc plusieurs étapes de b iotransformations simultanées ou successives dont les principaux sites sont les tissus situés à l’in terfa ce entre l’org anisme et le milieu e xté rieur, à s avoir : le tube digestif, l’appareil respira toire, le re in et le foie. Ce dernie r é tant fonctionnellement le plus impo rtant.

Les deux ph ases ré actionnelles p rincipales constituant les étapes de détoxification, phase I et ph ase II n e sont pos sibles que par l'intervention de sys tème s enzymatiques spécifiques. Etant donné la grande dive rsité des xénobiotiques au quel l'o rganis me est e xposé, il existe une mu ltitude d'enz ymes présen tant des spécificités variées.

Il doit ê tre rappelé que le s réactions de biotransforma tion des xénobiotiques s 'encha înent ra rement de façon linéaire , car deux voies ou plus prennent sou vent naissance à pa rtir d'un métabolite donné. On comp rend dès lors que l'existence d'un v ariant enz ymatique dé fectif pour l'une de ces voies ré actionnelles pourra orienter le métabolisme d'une substance cancérogène ve rs une autre voie. Cette derniè re, généralement mineure, prendra dè s lors une gra nde importance et les poly morphis mes qui la concernent pourront orienter le devenir des métabolites a insi fo rmés .

Les réac tions de cette phase ou métabolisme du pre mier passa ge, sont des ré actions de dégra dation et de fonctionnalisa tion représentées essentie llement, pa r des ox ydations mic rosomales hép atiques.

D’une façon générale , les réactions de la phase I aboutissent à un substrat plus hydrophile qu'au départ en ajoutant au substrat hyd rophobe une fonction

ABSORPTION Circu lation sa nguine METABOLI SME (xénobiotiques) ( foie, poumons , Peau ,

reins,intestins )

Exc rétion Métabo lite polaire Phase I

B i li ai r e o u u r in ai re

Mé tabo lites con jug ués Phase II

Combinaison avec les mac romolécules Mutation

Cancé risation

Figu re 1: sc héma récapitulatif du métabolisme des xénobiotiq ues

Tablea u 1 : principales réactions de biotrans forma tions

Réactions Enzymes Localisation Substrats

Réaction de la phase I

Oxydations Alcool déshydrogénases Cytosol Alcools Aldéhyde déshydrogénases Cytosol Aldéhydes Monoamine oxidases Mitochondrie Amines

Flavine monooxygénases Microsomes Amines tertiaires Cytochromes P450 Microsomes nombreux

Réductions Cytochrome P450 Microsomes nombreux

Carbonyl réductases Aldéhydes, Cétones Alcool déshydrogénases Cytosol Aldéhydes, Cétones Hydrolyses estérases Cytosol Esters

Microsomes, mitochondrie Peptidases microsomes

Réactions phase II

Epoxide hydrolase Microsomes, Cytosol Epoxide

UDP Glucuronyl-transférases Microsomes Phénols, thiols, amine, Acides carboxyliques

Gluthation-S-transférases microsomes électrophiles

Sulfotransferases cytosol phénols, thiols, amines O-, N-, S-méthyl-transférases cytosol, microsomes phénol, amines

N-acétyl transférases cytosol amines

Aminoacyl-transférases microsomes acides carboxyliques

chimique d ’ancra ge perme ttant, lo rs de la pha se II, la fixation d’un groupe le plus souvent polaire (R).

Il s 'a git de mono-oxyg ena tion essentielle ment catalysée pour plus de 95% des oxy dations par les enzymes de la supe rfamille des cytoch romes P450 et aboutiss ant à un subs trat plus h ydrophile en induisant un groupement polaire grâce à l'oxy gène atmosphérique.

O2

XH + NADP H, H+ XOH + NADP+ + H2O

Enzymes de la super fa mille

Du cytochr omes P 450

X H : x én ob i o t iq u e h y d r op h obe

XO H : co mp o s é in t e rm éd ia ir e h y d r o p h il e

Fig ure 2: la réac tion de mo noxygénatio n d e la phase I

A la suite du processus métabolique de la phase I ce rtains substra ts seront e xcrétés car ils ont atteint leur s tade fin al de biotrans fo rmation . D'a utres substrats peu vent être conjugués avec des composés endogènes et subir a insi une ré action de la phase I I. Les réactions de la pha se I I se définissent par la conjugaison du xénobiotique ou de son métabolite a vec des constituan ts endogènes, succédant aux oxyda tions si celles -ci n ’ont p as suffi à éliminer le xénobiotique. Elles sont ca ta lysées par des transférases mic rosomales ou cytoso liques selon la réaction suivante :

XOH + Y-R XOR + YH

(NAT, GST,..)

Les trans férases augmentent le plus souvent l ’hyd ro solubilité du

substrat et abo utissent en général à de s composés biologiquement inactifs. Il ex is te diffé rents types de trans fé rases, classées selon le type de

composé endogène utilisé et le type de substrat conjugué. Pa r exemple, la glutathion S-transféra se utilise le gluta thion comme composé endogène pour conjuguer principalement les époxydes et le s dé rivés nitrés. Alors que la N-acétyl transférase utilise l'Acé tyle CoA pour conjugue r des arylamines.

II - LES GLUTHATION -S-TRANSFERASES

Les gluthation-S-trans férases (GST) constituent une famille d ’enzymes jouant un rôle clé dans la détoxification d ’un grand nombre de composés hydrophobes e t électrophiles endogènes et exogènes tels que les époxydes et les hydroca rbu res a roma tiques po lyc ycliques (composants cancérigènes de la fumée de tabac , benzo[a]pyrène ).

R – X + GSH R- SG + X- H (GST A, GSTM, GSTT, GSTP)

( x én ob io t iq u e s et p ro d u i ts D e s tr es s o x y d a n t )

Tous les euca ryo tes expriment plusieurs isoenzymes cytosoliques et membranaires. Elles constituent des enzy mes métaboliques de phase I I, puisqu ’elle s catalysent la conju gaison de leurs substrats, et pa rticulièrement les hydroca rbu res aromatiques polycyc liques (HAP), à un groupement glutath ion réduit menant à la fo rmation de mé tabolites hydrophiles excré tables .

Chez l ’homme les GST sont p référentiellement s ynthétisés dans le foie, mais on les trouve égale ment dans les reins , l ’estomac et faible ment dans les muscles squelettiques e t c ardiaques . Elles sont caractérisées par leur présence aussi bien dans la frac tion cytosolique que microsoma le.

Les GST assurent leur fonc tion de conjugaison grâce à l ’existence de deux sites enzy ma tiques de liaison [ 4] : un s ite de liaison pour le gluthation appelé G-site et un s ite de liaison pour le substra t appelé H-site .

Actuelle ment, les GST humaines sont répa rties en 6 groupes selon leurs propriétés structu rales (s imila rité des séquences nucléotidiques, loca lisations et nature du substra t) biochimiques (point isoélectrique ) et immunologiques. On distinguera ainsi les classes : alpha (α), mu (μ), kapp a (κ), theta (τ), p i (π) , sigma (σ) [5 ]

Chaque classe est rep résentée par un nombre p récis de gènes .

La classe alpha (GSTA) est rep résentée par 5gènes (GSTA1, A2, A3, A4 et

A5). La classe thêta par 2 gènes GSTT1 et GSTT2 .

La classe mu comprend 5 gènes: GSTM1 , M2, M3, M4 et M5 .

Enfin , un seul gène a été décrit dans chacune des classes kappa ( GSTK) et pi ( GSTP ) nommés respectivement, GSTK1 et GSTP 1 . La c lasse sigma reste mal connue . [5]

Les gènes GSTM1 et GSTT1 qui fon t l ’obje t de ce tra vail, sont deux gènes appa rtenant respectivement aux classes mu et thêta. Il s'agit des gènes de la famille des glu tathion S-transféra ses les plus étudiés . GSTM1 est localisé sur le ch romosome 1 et GSTT1 , su r le chromosome 22.

A-GSTM1, gè ne e t e nzyme

1-Structure du gène GSTM1

Le gène GSTM1 appartient à la classe µ qui ren ferme 4 autres gènes nommé GSTM2 , GSTM3, GSTM4 et GSTM5 localisé sur le ch romosome 1 au niveau de la région1p13.3 [6]. La ca rte physique déta illée montre que le gène

GSTM1 est situé en av al des gènes GSTM4 et GSTM2 et en amont des gènes GSTM5 et GSTM3 .

Le gène GSTM1 est constitué de 8exons et 7 introns. Sa taille est de 5.92kb.

Des études ont montré que ce gène peut être dupliqué [7]. En effet, il peut présen te r une autre copie sur le même chromosome, expliquant ainsi l'a ctivité ultrarapide de l'enz yme GSTM1 observée dans certa ins c as. Cette duplic ation du gène est due à un c rossing ove r inéga l entre les deux brins des deux chromosomes 1, ce qui permet l'introduction d 'un deuxième gène GSTM1 au voisinage du p remier. Chromosome :1. position: 1p13.3 5’ 3’ G S TM 4 G S TM1 G S T M3 G S TM2 G STM5 5’ 3’ is o f o rm e 1 is o f o r m e 2

R ég i o n co da n t e R ég i o n n on tr an sc r i t e L’ i s of or m e 1 es t c on s t it u é d e 8 e xo n s. l’ i s o fo r m e 2 e st c on st i tu é d 7 ex on s et d o n ne n a i ss an c e à un e pr ot é i n e p l u s co u r te d e 37 a ci de s am i n é s

F igure3: Pos ition et s tr uctu re du gène GSTM1

Selon certa ins auteurs [7 -8], il e xiste une au tre classe mu, constituée de gènes ou de pseudo gènes, loca lisée au niveau du chromosome 3, probable ment dans la rég ion 3p24-3pte r. Cette observation n 'a pas été con firmée pa r d 'autres auteurs.

2- polymorphisme

Deux poly mo rphismes ont été déc rit au niveau de GSTM1 :

- une délétion homoz ygote complè te du gène, représenté par l'allèle GSTM1*0/0. Cette fo rme allélique résulte d ’un cross ing ove r inégal entre deux rég ions répétées de 4.2kb, qui flanquent le gène GSTM1 et qui pro voque une délétion de 15kb incluant le gène entier [9 ], conduisant au niveau phénotypique à un déficit enzy matique total. l’enz yme GSTµ est donc in active chez plus de 50% des individus allant de 45 à 58% selon diverses études menées su r des popula tions européennes.

M4 M2 M1 M5

M4 M2 C.O iné gal M5

F igure4: Mécanisme d’ap parition de la dé létio n GSTM1

ainsi les allèles GSTM1*A et GSTM1*B [10 ] qui diffèrent seule ment par 1 seul acide aminé K172N. les deux ve rs ions resten t parfaitement fonctionnels, et sans expression phénotypique pa rticulière . Ces deux allèles sont considérés comme les représentants du phénotype de conjugateur pos itif.

Il e xis te une relation de codominance entre ces deux allè les (GSTM1*A et GSTM1*B). Par contre, il existe une relation de dominance entre ces a llèles et l'allèle nul.

L'activité ca ta lytique de l'enzy me est norma le chez les individus ay ant l'un des génotypes suivant GSTM1*0/*A, GS TM1 *0/*B, GSTM1*A/*A, GSTM1*A/*B et GSTM1*B/*B. Cependant, l'a ctivité est complète ment nulle chez les individus ay ant le génotype GSTM1 *0/*0.

Tableau2 : Différe ntes formes a llélique s du gène GSTM1 humain

Polymorp hisme Position nucleotidiques polymorphes Acides aminés c hangés Activité En zy mat iq u e GSTM1 *A GSTM1* B GSTM1*0

alléle sau vage C534 G -exo n 7- Dé létion de 15 kb du gène K 172N Norma le Norma le Nulle

3- Variation de la fréquence du gén otype GSTM1*0/0

La fréquence du génotype nul présente une variation à plus ieurs nive au: in terethnique, intra -ethnique et selon le sexe.

Une différence s ignifica tive du génotype nul a été observée en tre les 3 gra nds groupes ethniques c auc asien, asiatique et africain. Les résultats de diffé rentes études montrent que la popula tion asiatique pré sente la fréquence la plus élevé du génotype GSTM1*0/0 ( [11-12] , alors que la fréquence la plus fa ible a été enregis tré chez la popula tion afric aine.

D'autre part il e xis te une va riation au sein d'un même g roupe e thnique, cette va riation résulte de dif fé ren ts fa cteurs tels que la taille de l'échantillon étudié, la tranche d 'â ge et la source de leur sélection .

La différence se lon le sexe es t signific ative seulement dans le groupe af ricain [11]

4- Struc tu re, su bstrats et expression de l 'en zyme GSTM1

L'enzyme GSTM1 na tive est un d imère de 217 acides aminés . Ch aque monomère présente deux domaines [4]:

*le premier domaine est appelé G-site. Il a pour rôle p rincipale d'é tablir la liaison et l'activ ation du glutathion .

*le deuxième domaine est appelé H-site. Ce site est indispensable pour la liaison et l'orientation du substrat électrophile .

Cette enzyme cata lyse la conjugaison du gluta thion a vec plus ieurs substances électrophiles et carcinogènes tel que : les époxydes , le s dérivés nitrés, les h ydroxylamines, le sty rène, l'oxyde de sty rène, le benzène e t le benzo (a) pyrène , composé carcinogène de la fumé du tab ac. Cette enzy me interv ient aussi dans la détoxication de quelques médicaments e t des produits du stress oxyd ative

Le spectre d'express ion de l'enzyme GSTM1 est relativement la rge puisqu 'elle s'exprime dans d ifférents tissus p rincipalement dans le foie , mais aussi dans le poumon, le rein, la peau et dans les lymphocytes .

B-

Chez l'homme , la classe thêta renfe rme deux gènes GSTT1 et GSTT2. Ces deux gènes sont situés sur le chromosome 22 et sont séparé s par app roximativement 50kb. Ils ont une structu re similaire avec 5 exons et 4 in trons. Les p rotéines issues de ces gènes sont identiques pour 55% de leurs séquences en acides aminés [ 13]

1 -structure du gène GSTT2

Le gène GSTT2 a une taille de 3.7kb . Il es t situé tête à tê te avec un gène codant pour la dopach rome tautomerase (DDCT). La séquence qui se s itue entre les deux gènes contient un pro moteur bidirectionnel.

Le gène GSTT2 peut être dupliqué. Les études montren t que ces duplications peuvent porte r soit une mutation au n ive au du site de la jonction entre l'e xon2 et l'inton2 ou alo rs un codon s top prématuré au nive au du codon 196. Ces changements font de ces dupliquas des pseudogènes appelé: GSTTP1 et GSTTP2 [13]. Chromosome:22; position: 22q11.2 5 ’ 3’ D DCT G S T TP1 G S TT2 5 ’ 3’ R ég i o n co da n t e R ég i o n n on tr an sc r i t e

Figure5: Position et s tr uctu re du gène GSTT1

2 -structure du gène GSTT1

Le gène GSTT1 es t p réc isément loca lisé à la position 22q11.23. Il a une ta ille 8.1kb .

Chromosome :22 ; pos ition : 22q11.23

5’ 3’

G S TTP 1 G S TTP 2 G S T T1

5 ’ 3’ R ég i o n co da n t e R ég i o n n on tr an sc r i t e

Figure6: Position et s tr uctu re du gène GSTT1

3- Découverte du polymorphisme GSTT1

En 1989, une différence inter indiv iduelle dans le métabolisme du méth yle chloride a été observée , montrant l ’e xistence de trois groupes d ’individus différents p ar le degré d ’élimin ation métabolique du p roduit. Cette élimination peut être absente pour les individus n ’a yant pas une activité enz ymatique corre spondante, moyenne pour les individus ayant une faible activ ité enzyma tique ou une élimination normale pour les individus ayant une activ ité enzy matique normale [14 ]

4-polymorph isme GSTT1

On a pu établir une variabilité dans le mé tabolisme du chlo rure de méth ylène dans le sang humain. Cette d if férence était attribu able à un polymorphisme génétique au sein de GSTT1 correspondant à une délétion partielle de 54 251 paires de bases du gène GSTT1 et confère trois phénotypes distincts (" nonconjuga tor s , lo w conjuga tor s et high conjug a tor s " ) selon que deux, un seul ou aucun des deux allè les soit délété.

Le phénotype de non conjuguant es t donc dû à une délétion homozygote de l’allèle fonc tionnel de GSTT1 et co rrespond p ar conséquent, au génotype GSTT1*0/0 [15 ]. Le phénotype de moyen conjuguant e st dû à une délétion

hétérozyg ote de l ’allèle fonctionnel de GSTT1 et le phénotype très conjuguant est dû à la présence homozygo te de l ’allèle fonctionnel de GSTT1.

En ce qui concerne la fréquence de ce poly morphis me , on rapporte qu ’entre 15 à 20 % des Caucasiens de descendance européenne sont GSTT1* 0 (donc homoz ygotes délé tés s ans activité de l ’enzyme). [15]

Une étude récente a permis l'identific ation de deux autres allé les, l'allé le GSTT1* A et l'alléle GSTT1*B, qui sont le résultat d'une substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) au niveau du nucléotide 310 (A310G) [16 ].

L'apparition de l'alléle GSTT1 *B sous la forme homoz ygote cause l'inactiv ation de l'enzyme GSTT1.

Le phénotype non conjuguant peut donc être due aux génotypes GSTT1 0*/0*, GSTT1 B*/B* ou GSTT1 B*/0* . Alors que le phénotype conjuguant moyen es t du à la p résence du génotype hé térozy gote GSTT1 *A/* 0 ou le génotype GSTT1*A/*B.

Le phénotype de fort conjuguant es t du à la présence homozy gote de l’allèle GSTT1* A/* A.

Tablea u 3 : différentes fo rmes allè liques du gè ne GSTT1 Polymorp hisme Position nucleotidiques polymorphes Acides aminés c hangés Activité En zy mat iq u e GSTT1 * A GSTT1 *B GSTT1 *0 Alle le sa uvag e A 310 G Dé létion de 54251pb du gèn e Norma le Nulle Nulle

5- Variation de la fréquence du génotype GSTT1*0/0

La fréquence de ce génotype présente des variations interethnique, in traethnique et se lon les sexes .

population c aucasienne, asiatique et la population africaine. La fréquence la plus élevé du génotype GSTT1*0/* 0 a été enre gistré dans la population asiatique (52%) ( [11 -17] . Peu d’études ont concerné la popula tion afric aine [ 3-18] .

Les études montrent aussi que la v ariation au sein d'un même groupe ethnique es t sta tistiquement non significative , sau f dans quelques groupes de la population caucasienne et d'autres dans la population asiatique [11 - 17]

6-Structure, substrats e t expression de l'en zyme GSTT1

Glutathione S-tran sfe ra se thêta 1 (GSTT1) es t un me mbre de la superfamille des protéines c ataly sant la conjugaison du glutathion réduit à diffé rents composés électrophiles .

Selon les études fonctionnelles, GSTT1 catalyse rait la conjuga ison de substances toxiques environnementale s et de composés électrophile s mutagènes comme l ’ox yde d’éthylène , le bro mure de méth ylène, dif fé ren ts a lc anes halogénés e t époxydes. Par a illeurs , on a initialement observé dans la population caucasienne que 60% des individus seulement conjuguaient les halométhanes (un des subs trats spécifique à GSTT1) alors que 40% ne le fa isa ient pas ([19- 11].

De point de vue structural, l'enzy me GSTT1 est aussi de s tructure dimè rique, avec la présence des même s domaines (G-site e t H-site) que l'enzyme GSTM1.

Chez l ’homme, son spectre d 'expression es t pre sque identique à celui de l'enzyme GSTM1 sauf pour les lymphocytes, puisque l’enzy me glutathion S-trans férase thêta se trouve en majeure partie dans les globules rou ges , et pas dans les lymphoc ytes. Cependant, elle pourrait aussi être induite dans les autres tissus.

La fa mille des N-acétyl Transfé ra ses fa it pa rtie des enzymes assurant principalement la réaction de conjug aison de la phase II de dé tox ifica tion.

A- HISTORIQUE

Le polymorphisme des N-acétyl transférases rep résente l'un des e xemples de varia tion pha rmacogénétique décrit, et de l'un des plus documentés, depuis sa découve rte au début des années 50 [20], en même temps que la découverte de la gra nde efficac ité de l’isoniazide (INH) dans le traitement de la tuberculose.

L’a dministra tion de l ’isoniazide a permis d ’observer initialement que , si de nombreux patients exc rétaient rapidement une dose d ’INH sous forme de dérivés conjugués inactifs, d ’autre s conserv aient plus longtemps une concentra tion plasmatique plus élevée d ’INH non trans fo rmé, en re la tion a vec l’élimination moins e ffica ce du médic ament. Des études quantita tives , par le calcul du rapport entre métabolites conjugués et métabolites non conjugués , ont vite montré que les popula tions étudiées se divisaien t en 2 groupes d ’individus en ce qui concerne la vites se d ’é limina tion de l ’INH : les uns dits métaboliseurs ra pides, les autres métaboliseurs lents de l’INH.

Ce n ’est que 30 ans plus ta rd, qu ’on a pu a ttribuer ces différences , à des varia tions de niveau d ’ac tivité d ’une enz yme qui inte rvient dans le métabolisme de l’INH : la N- Acé ty l trans férase [21].

En ef fet, les métaboliseurs rapides ont une a ctivité enzymatique normale et les métaboliseu rs len ts pré sentent une activité enz ymatique diminuée, en ra pport avec une quantité réduite d ’enzyme au niveau du fo ie. Plus ta rd, on a montré que les acétyleurs lents présentent au nive au de la région codante du gène NAT, des va riations a lléliques dues à une substitution

B-PRINCIPALE FONCTION DES NAT

Les N-acé tyl transféra ses (NAT) constituent une famille d’enzymes , qui comme leur nom l ’indique , catalysent le trans fe rt d ’un g roupement acétyl issu de l’acé tyl coenz yme A, sur l’azote du groupement amine prima ire (-NH2) ou

hydrazine (-NH-NH2) d’une molécule a roma tique ou a rylamine receveuse. Le produit formé est une aryla mide . [22 ]

En plus des réactions de N-a cétyla tion, les NAT peuvent catalyser la O-acétylation de substrats a romatiques N-hydroxy lés , ainsi que la N,O trans acétylation intramolécula ire de composés N-hydroxylés et N-acéty lés.

La N-acétylation des a rylamines es t considérée de fa çon généra le co mme exe rçant une détoxification rela tive puisque cette ré action les rend en effet moins actives, a lors que la O-acéty lation serait plu tôt activa trice.

Cependant, les N-Acétyl transfera ses agis sent aussi su r d’autres substra ts repré sentés par des médicaments de ty pe isoniaz ide, dapsone, sulfamides…, mais aussi des polluants p résents dans l ’environnement et dans l ’alimentation. Les substra ts endogènes des NAT sont encore ma l connus.

Chez l'homme, ces molécules peuvent être transformées plus ou moins sélectivemen t p ar l'une ou l'autre des deux formes distincte s d 'a rylamine N-acétyltransfé rases, en l’occu rrence la N-acé ty l transférases de type I (N AT1) et la N-acétyl-transféra ses de type I I (N AT2).

Les deux a rylamines NAT humaines connues sont des enzymes cytoso lique . L'expression de NAT2 est essentiellement hépatique et substantiellement g astro -inte stinal (colon, panc réas et l ’œsophage). Alo rs que l’enz yme NAT1 est bien plus exp rimée et a été détectée dans de nombreux tissus extra hépatiques [23- 24] .

Chez les individus de type acétyleur rapide, NAT2 est e xprimée dans le foie en quantité supérieu re à NAT1 (12 fois environ ), alors que le rapport des deux activ ités sera it en faveu r de NAT1 dans le c ytosol colo-rectal et l'uroépithélium. Chez les acéty leurs lents, les contenus hépatiques en enzymes NAT1et NAT2 se raient p ar contre comparable (ac tivité NAT2 jusqu'à deux fo is plus forte seulement) [25]

Le phénotype acétyleur lent e st dû à un contenu hépa tique diminué en enz yme NAT2 fonc tionnellement active , atteign ant un nive au résiduel.

Les études ont montré que le tissu hépatique montré toujours les mêmes taux d'ARNm que pour l'allèle de référence . Le phénotype acétyleur lent a dés lo rs été attribué à des dé fauts d'ord re traductionnel (ef ficacité de traduction diminuée) ou post traductionnel (dégradation accélérée de la protéine) [26-21]

CoASAc CoASH acétyl

H R N R NH – CO–CH3

H N-acétyltransférase

Arylamine (NAT) Arylamide

Figure 07a : La Réaction de N-acétylation

O H R N H O-acétyltransférase (OAT) N-hydroxyarylamine O - CO - CH3

R N H N-acétoxyarylamine N-O-transacétylase OH R N CO CH3 N-hydroxy-N-acétylarylamine

Fig ure 07b : Autr es réactions de trans fe rt d’acétyl ca talysées par les NAT.

C-DETERMINI SME GENETIQUE

Les récentes avancées acquises dans la connaissance de la génétique des NAT on t permis d'élucider ce rta ines des bases moléculaires du polymo rphisme phénotypique de la N-acé tylation obse rvé chez l'homme .

Les deux fo rmes enzymatiques des N-acéty l transférases sont codées par deux gènes différents : NAT1 e t NAT2 isolé pou r la pre mière fois p ar Grant et collaborateurs en 1981[ 27].

Ces deux gènes sont séparés par 25 kb et localisés sur le b ras court du chromosome 8 , plus précisémen t dans la région 8p22 [28].

Un trois ième gène, NATP1 , a été identifié sur le même chromosome et constitue très probablement un pseudogène. Il présente 79 et 80% d'identité nucléotidique avec NAT1et NAT2, respectivement. Il renferme p lusieurs muta tions expliquant le defaut d ’exp ression. [28]

Les deux séquences codantes des gènes NAT1 et NAT2 constituées de 870pb sont dépourvues de d'in terruption intronique (intron less p roteine cod ing exon), et partagent 87 % d ’homolog ie nucléotidique dans la rég ion codante qui se traduit p ar 81% d ’homologie au niveau de la séquence des acides a minés.

5' NAT1 N AT2 3'

870pb 25kb 8kb 5 kb

Exon non intron pa rtie codante de l'exon pa rtie non

co dan t

cod ante

-107 -7 -6 +1 870 1170

Figure08: Rep résenta tion schématique du lo cus NAT h umain

Le gène NAT1 produit son transc rit à partir d ’une seule séquence nucléotidique, alo rs que le gène NAT2 produit son ARNm grâce à la transcription du gène constitutif et d'une deuxième séquence exonique de 100pb sans aucune partie traduite et s itués à environs 8kb en 5' du site du début de la transcription [28- 29 ]

Les gènes NAT1 et NAT2 semblen t s'exprime r de façon indépendante et aucune donnée n'existe encore quant à leur contrôle pa r des facteurs de ré gulation en trans . L ’express ion de ses gènes donne naissance à deux p rotéines fonctionnelles de 290 acides a minés qui ne différent que par 55 acides aminés au niveau de la région C-te rmin ale [21-30] 33KD pour NAT1 et 31 KD pou r NAT2.

Malgré le hau t degré de ressemblance entre les deux pro téines, leurs propriétés cinétique et éléctrophorétiques sont quelque peu différentes, leur permettant d ’a voir des af finités e t des fonctionna lité s dis tinctes. [30]

D- STRUCTURE DES ENZYMES N-ACETYL TRANSFERASES La premiè re structu re sp atiale d ’une N-acétyl trans fé rase a é té publiée en 2000 pa r Sinclare et collabora teurs . En dépit du fa it que la NAT éta it, dans cette recherche , d ’origine b actérienne, elle a fou rni des nouvelles informations struc turales et fonctionnelles su r l ’enzyme humaine. Cette étude a, en effe t, montré que ce tte pro téine présente dans l ’espèce humaine une triade catalytique située au niveau de la pa rtie N-Te rminale. Elle es t composée de la c ystéine 68, de l’histidine et de l ’aspa rtate (Cys-His -As p)

Des analy ses structurales ont permis de distingue r tro is domaines au niveau de la protéine NAT [31 ].

* Le p remier domaine s’étend du premier acide aminé jusqu ’à l’acide aminé 90. Il forme une partie de la crevasse ou de la fente composé par la triade c ata ly tique et constitue le lieu ou la cys téine 68 va se combiner aux substrats . Ce doma ine es t le p lus conse rvé entre les espèces .

* Le deuxième domaine s ’étend de l ’a cide a miné 90 jusqu ’à l’ac ide aminé 210. il forme l’autre p artie de la crevasse e t se présente essen tiellement sous forme de bâtonnets bêtas. Cette zone présente des pa rticu larités selon qu 'il s'agisse de l'enzyme NAT1 ou NAT2, puisque au niveau de la position 93 et 125 les ac ides aminés sont dif fé ren ts pe rmettant à l'enzyme NAT2 d'établir plus ieurs liaisons interac tives (F93et S125 pou r NAT2 e t V93 et F125 pour NAT1).

*le dern ier domaine intéresse particulièrement le groupement ca rboxyle. Il est formé d’une combin aison entre des hé lices alfa et des bâtonnets bêtas. C’est le domaine le plus diversifié entre les espèces .

La réaction d’acé tylation se produit en deux étapes séparées [32] : *d’abord l ’acéty l coenzyme A se lie à l’enzyme . Sa mo itié es t trans fé rée su r la cy stéine 68 de la protéine, le reste es t libéré dans le cytoplas me .

*Durant la seconde étape, il s ’établit une lia ison entre le substrat et l’enzyme acé tylée , la moitié du coenzy me A va donc être trans fé rée au substra t. Après se transfert, le produit acé tylé se détache de l’enz yme.

E- POLYMORP HI SME GENETIQUE

Il est maintenan t bien connu que les gènes codant aux formes NAT1 et NAT2 sont poly mo rphes. Le séquençage de la région du bras court du chromosome 8 , montre plusieurs niveaux de mutations ponctuelles pour ch acun des gènes, donnant naissance aux différente s formes a lléliques cons tituant le polymorphisme génétique [30-33] (table au 4 e t 4’).

L’allèle de référence ou allè le sauv age est rep résenté pa r l ’allè le NAT1*4 et NAT2*4. Toutes les autre s formes dif fè rent de l’a llèle de référence par une, deux ou même trois substitu tions nucléotidiques .

Les conséquences sur la séquence en acides aminés sont différentes, puisque certaines de ces mutations sont silencieuses, alors que d ’autre s a ltèrent la séquence. Ceci peut ch ange r le niveau d ’activité de l ’enzyme , pa r une varia tion quantitative ou qua litative (va riation d ’affinité au substrat).

1-mé thode de détermin ation phén otyp ique :

La déte rmination phénotypique in vivo consiste à quantifier les métabolites plasmatiques ou urina ires produits ap rès l'ad ministration d'une sonde mé tabolique . Ces composés-test ont initiale ment été e xclusivement des médicaments , avant que la caféine ne s'avère utilis able.

Actuelle ment, la c aféine est le substrat le plus communément utilisé comme sonde métabolique pour la détermination du s tatut d 'acétyla tion. Elle est exempte de toxicité su r une large g amme de doses et permet de déte rminer fa cilement, a vec précision, et en toute sécurité le phénotype d'indiv idus s ains et malades .

Le test consiste à faire in gérer par le sujet 200 à 300mg de c aféine sous forme purifiée ou alimentaire (café, thé ou boisson à base de cola ). Les u rines

sont collectées pend ant les 24 heures (test c lassique) ou les 2 à 6heures (test simplifié) suivant l'in gestion. Les métabolites de la caféine sont quantifié s à partir de petits échantillons d'urine (200µl) pa r HPLC.

Le phénotype d'acétylation (lent ou rapide) es t mis en évidence p ar la détermination de la vitesse de formation des métabolites conjugués éliminés dans les urines.

Ce test est préfé rentiellement utilisé pour la déte rmination phénotypique de NAT2, alors que l'acide amino -s alicylique est le plus utilisé pour la détermination du phénotype de NAT1, en utilisant le même princ ipe.

Les études cinétiques montrent que les acétyleurs lents sont c aractérisé par une vite sse maximale inférieurs à 50% de la vitesse ma xima le enregistré pour les acé tyleu rs rapides et cela sans a ucune altéra tion de la constante de Michaelis (km) pra tiquement similaire pour les deux phénotypes.

Les dif férentes comb inaisons d'allè les NAT pourra ien t réa liser d ans leur ensemble un spectre de ré activ ités chevauch antes envers certains substrats. Ains i des génotypes considérés comme lents pourraient s 'a vérer rapides vis-à-v is d'autres substra ts . Au tota l, ce tte va riabilité métabolique pourra it moduler de maniére trè s complexe les réponses à des thérapies concomitantes multiples.

2-polymorph isme du gè ne NAT1

Lon gte mps considé ré comme monomorphe, le gène NAT1 présente en ré alité une vingtaine de v ariations nucléotidiques. Les données fonc tionnelles obtenues i n vitr o et in vivo indiquent que certains allè les sont associés à des enz ymes à activ ité d iminuée pa r rapport au type de réfé rence (ca s des enzymes associées aux a llèles NAT1* 11, NAT1* 14 comp arées à l'enz yme de type

NAT1* 4), et que d'autres allèles sont a ssociés à des activ ités nulles ( NAT1* 15, NAT1* 17).

Cependant d ’autres fo rmes alléliques au raient une activité aug mentées (NAT1* 10) pour les substrats testés (acide pa r a -amino benzoïque en particulie r) [23].

Les sites poly mo rphes NAT1 aya nt été identifié s sont situés dans la ré gion codante ainsi que dans les régions 5' et 3' flanqu antes.

La plus remarquable de ces va riations est la trans version T1088 en A située au niveau d'une séquence consensus d'un s ignal de poly adén yla tion.

On retrou ve également une délétion po rtant sur un nonanucléotide à pro ximité du s ignal de polya dény lation.

Cependant, La caractéris ation des phénoty pes associés aux diffé ren ts génotypes NAT1 n'est p as achevée.

Tableau 4 : Différentes fo rmes allé liques du gè ne NAT1 h umain

P o lym o rph i sm e _{Position nucléotid iques polymorphes Acides} aminés changés

Ac tivité E n zy matiqu e

NAT1*4 NAT1*3 NAT1*5 NAT1*10 NAT1*11 NAT1*14 NAT1*15 NAT1*16 NAT1*17 -344 -40 445 459 559 560 640 1075 1088 1091 1095 C A G G C G T * T C A Plusie urs substitutions

A A T T A A G Δ 9 A A A A T

+[AAA] A plusie urs sub stitution s

Au cun Plusie urs Au cun Va l149Ile Arg187gln Arg187stop Au cun plusie urs No rmale Inc onnu e Inc onnu e Rapide d iminué Dimin uée n ulle Inc onnu e Nu lle

3-polymorph isme du gène NAT2

Neu f subs titutions nucléotidiques ponctuelles ont été identifiées dans la séquence codante NAT2. Sept d 'entre elles sont des transitions entra in ant chacune une substitution d'acide a miné et huit altèrent au moins un site de re stric tion.

Quinze allèles sont actuellement connus (tableau 4'), pa rmi lesquels treize a llèles ma jeu rs , c 'est-à-dire rencontrés à des fréquences significa tives dans plus ieurs populations [ 33] . Chacun de ces treize allèles a é té corré lé à une activ ité de N-acétyla tion, deux variant rares res tent à activ ité inconnues.

Les variant ma jeu rs NAT2 se divisent en qua tre c até gories, chacune étant ca rac té risée pa r la présence d'une seule substitution nucléo tidique qui se traduit au nive au protéique par un changement non conse rva tif d'acide aminé.

Ces chan gements donnent naiss ance a ux qua tre allèles suiv ants : NAT2*5, NAT*6, NAT2*7 et l’allèle NAT2 *14. L'activ ité enzymatique du produit NAT dans chacun de ces allèles est diminuée . Il s'agit des acéty leurs lents dont les fré quences va rient considérablement entre les groupes ethniques [34- 31]

Dans les popula tions a fric aines e t caucas iennes , la fréquence des acétyleu rs lents varie de 40 à 70% [34]. En Europe, presque la moitié de la population sont des acétyleu rs lents , alors que d ans les pay s asiatiques tels que le japon et la chine, la fréquence des acétyleurs lent se situe en tre 10 et 30% [35].

Ces fréquences allé liques présentent même des va riations au sein même du groupe. En Afrique , pa r e xemple pou r l'a llèle NAT2*14 , on suggère l’hypo thèse de l ’existence d ’un gradient Est-Oues t avec 19% en Guinée -Bissau, 3 % au soudan e t l’absence totale de cet allèle en somalie [36].

Polymorphisme Positions nuc léotidique s polymorphes Acides aminé s changés Activité enzymatiqu e NAT2*4 NAT2*5A NAT2*5B NAT2*5C NAT2*6A NAT2*6B NAT2*6C NAT2*7A NAT2*7B NAT2*12 A NAT2*12B NAT2*13 NAT2*14 A NAT2*14B NAT2*17 NAT2*18 191 282 341 434 481 590 803 845 857 G C T A C G A A G C T C T G C G T A A T A G A T A G T G T A A T C C Il e114 Thr Lys268Arg Arg197Gln Gly283Glu Lys268Arg Arg84Gln Gln145Pro Lys 282Thr Rapide Diminué e Diminué e Diminué e Diminué e Diminué e Diminué e Diminué e Diminué e Rapide RAPIDE rapid e Diminué e Diminué e In conn ue In conn ue

Les cy tochro mes P450 (CYP) forment une supe rfamille multigénique d'enz ymes hépa tiques clé de la fonc tion de détoxic ation. Ils sont impliquées dans le métabolis me o xyda tif de molécules très diverses , comprenant aussi b ien des xénobiotiques (médica ments, pesticides polluan ts, toxiques, cancé rigènes..) que des substances endogènes (ho rmones sté roïdiennes, acides gras, vitamines …).

Il s 'agit de monooxy génases localisées sur le réticulum endopla smique, et ay ant acquis au cou rs de l'évolution des espèces un degré de diversité leur permettant de métaboliser un grand nomb re de co rps chimiques .

Une des caractéristiques de ces enzymes est leur inductibilité , en particulie r pa r certaines hormones, médic aments ou polluan ts chimiques. Paradox alement, ces enz ymes ont ég alement un grand potentiel d'activation chimique de certains composés pouv ant produire des mé tabolites toxiques, muta gènes voire cancérogènes. Cette ambivalence e t les conséquences majeures qui en découlent ont conduit à s 'intéresse r aux cy tochromes P450 .

Chez l'homme, les fa milles les p lus prépondérantes de CYP450 sont repré sentées par les fa milles CYP1A1, CYP2C et CYP3 A.[37]

1A 12% 2A 8% 2C 19% 2D 6 4% 2E 6% 3A 34% Autres 17% 17%

A- HISTORIQUE

La présence d'un pigment capable de lier le monoxyde de c arbone a été observé pour la p remière fois pa r GR Williams en 1955, mais ce n 'est que plus ta rd que l'ex istence de ce pigment dans des microsomes hépatiques de ra t et de porc a é té confirmé .

Ce pig ment présentant une absorp tion à 450nm fut caractérisé co mme une hémoproté ine . Ces p rotéines furent rapidement imp liquées dans le métabolis me ox ydatif des sté roïdes au niveau des glandes corticosurrénales et des xénobiotiques dans le foie .

Il fut ensuite établi que l'oxyd ation des xénobiotiques par les microsomes hépa tiques e t l'éléva tion de l'activité métabolique après traitement des animau x par différents médica ments et autres xénobiotiques, pouv aient être attribuées au c ytochrome P450 et à son inductibilité

Au milieu des années 70, les premières formes protéiques furent isolées, puis au début des années 80 , les p remières séquences primaires furent établies, ainsi que la séquence en acides nucléiques co rrespondan t, ce qui permit de démontrer clairement que ces différente s forme s de c ytochromes P450 étaient des produits de gènes différents .

B- CLASSIFICATION ET NOMENCLATURE

Nelson et a l recens aient en 1995, 481 gènes codan t pour les CYPs et 22 pseudogénes . Ces gènes été décrits chez 85 eucary otes, incluant vertébrés, in vertéb rés , plantes et algues e t 20 proca ryo tes . De nombreux autres cytoch romes P450 ont été isolés depuis e t p lus de 1000 sont aujourd'hui clairement identifiés .

Depuis 1987, ces protéines sont répe rtoriées et désignées selon une nomencla tu re basée uniquement et strictement sur le pourcentage d'homologies entre les séquences en ac ides aminés , les s imilitudes en terme d 'a ctivité enz ymatique et de ré gulation ne sont pas prises en compte.

Ainsi, si deux cy tochromes P450 présentent p lus de 40% d 'homolo gie dans la séquence d 'acides aminés, ils seront considérés comme app artenant à la même famille. Si l'homologie est supérieure à 55% les protéines font parties de la même sous fa mille. Les protéines aya nt moins de 3% de divergence sont classées comme v ariants allé liques .

On dénombre actuellement chez l'homme, aux moins 17 fa milles diffé rentes de cy tochrome s P450 incluant 26 sous familles org anisées en 49 gènes hautemen t simila ires et à loc alisa tion chro mosomique différentes, et 15 pseudogènes (table au 5 ). Pou r désigne r un gène chez l'homme on utilise ra la forme italique CYP pour c ytochrome P450, suivi du nombre a rabe désignant la fa mille, puis une lettre dés ignant le sous famille e t enfin d 'un chif fre arabe dés ign ant le gène . La lettre P après un gène désigne un pseudogène. Les ADNc, ARNm et protéines de toutes les espèces doivent être désigné en lettre capitale.

En se basant sur cette similitude entre les séquences en acides aminés , et dans certains cas en tenant compte des activités ca talytiques, il a été pos sib le de détermine r s i deux gènes é ta ient issus ou non d'une duplication de gènes et d'établir des a rbres phy logénétiques (figure 10). En 1999, le nombre de famille est de 150 et la c lassification requie rt un n iveau supplémentaire de re groupemen t.

Les clans font a lors leur apparition et rassemblen t les familles qui appartiennent à un même g roupe (is su d'un même gène ancestral) d'a près les nombreux arbres ph ylo génétiques étab lis auparavant. Ces clans sont désignés par le chiffre le plus petit des familles qu'ils reg roupent ou de celu i comportant la famille majorita ire. Ain si, le clan 2 regroupe la famille CYP2 de même que les familles CYP1, 17, 18 et 21

Un certain nombre de c ytochromes P450 sont maintenant connus pour leur polymorphisme d 'e xpression ou de fonction, et pour ce rtains d 'entre eux les bases moléculaire s de ces va riations sont décrites.

La famille CYP1 comporte deux sous famille 1 A et 1B. La sous famille 1 A est composée de deux membres 1A1 et 1A2 dont les séquences nucléiques sont très proches (92% de similitude ).

Figu re 10:Arbre ph ylogéné tique in cluant des famille s de CYPs

La forme 1A1 est présen te à un taux très bas d ans le foie: ce tte enzy me e st essentie llement extra hépatique. La forme 1A2 est impliquée dans le métabolis me de proca rcinogénes (a mines aromatiques), ainsi que dans la survenue d'hép atites auto-immunes. Cette fa mille est inductible par les hydroca rbu res a romatiques .

La famille CYP2 est divisée en un très grand nombre de sous -famille: 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2 F et 2J.

La sous -famille 2C compo rte p lus ieurs membres (2C8 , 2C9 e t 2C19) qui sont impliqués dans le po lymo rphisme oxyd atif d e la méphénytoine e t du to lbutamide. La sous - famille 2D es t respons able du polymorphis me de la déb risoquine hydro xylase . La sous famille 2E a un seul memb re 2E1 inductible par l'a lcool, l'isoniazide, l'acétone e t les dérivés du pyra zole. Cette sous -famille est inductible, à des degrés va riables, par le phénobarbital.

La famille CYP3 comporte une seule sous famille 3A. Trois memb res de cette sous famille (3A4, 3 A5 et 3A7 ) ont des séquences ex trêmemen t p roches (<5% de divergence). Ils sont inductibles p ar les g lucoco rticoïdes de s ynthèse, le phénobarbital et p ar deux types d'antibiotiques, les macrolides et la rifa mp icine .

Le table au 5 résume les familles et sous fa milles du CYP 450 et montre que presque toutes les isoformes des familles 1 à 3 présen tent un polymo rphisme d'expres sion ou d'ac tivité. Toute fois, la fréquence e t le nombre des muta tions déc rites v arient beaucoup d'une enzy me à l'a utre.

Des e ffo rts ont été faits a fin de trouver un poly morphis me importan t des CYP3A4 et 1A2, s ans sucées. Des sites poly morphes ont é té identifiés dans la ré gion régulatrice de ces gènes mais leu r impact re ste ma l défin i.

La notion de polymorphisme géné tique s 'est étendue aux monooxygénases de la phase I a vec la mise en évidence du poly mo rphisme de l'hyd rox ylation de la débrisoquine et de la sparté ine et d 'environ soixante autres agents thérapeutiques.

D'autres parts de nombreuses études actuelles mettent en cause les cytoch romes P450 dans la susceptibilité ind ividuelle au c ance r induit pa r les xénobiotiques tel que la fumée du tabac. Ces études montrent une prédisposition génétique dans la capacité à métaboliser les substances cancérigènes présente s. Les familles les plus impliquées dans se genre d'études sont les CYP1A1, CYP2E1 et CYP2D6.[38]

Les c ytochromes P450 constituent un sys tème enzymatique complexe de struc ture globulaire, forte ment ancrée dans la membrane du réticulum endoplasmique ou les microso mes. Ce tte configuration leu r permet d'avoir accès autant au substrat lipophiles qu'aux co mposés hydrophiles [37 ].

Ce système est fo rmé au minimum de trois composants : une pa rtie pro téique, l'apoproté ine et d 'un groupement pros thétique liée à un atome de fer par qu atre liaison cova lentes. La cinquième liaison de coordination du fe r est ré alisée avec le groupemen t thiola te d'une cystéine conservée et pos itionnée dans le site catalytique. Enfin la sixième liaison permet la fix ation de diverses molécules comme l'eau et l'oxygène moléculaire . Les cy tochro mes P450 sont donc des p rotéines à hè me –thio lates .

D-CYCLE REACTIONNEL :

L'in sertion d'un atome d'oxygène dans un substrat est l'aboutissemen t de la réac tion d'hydroxylation c ata ly sée pa r le cy tochro me P450. La séquence d'événements qui conduit à cette réac tion peut s'écrire suivant le bilan global:

RH + NADPH + H+ + O2 ROH + NADP + + H2 O

Les P450 sont associés à des chaînes de transfe rt d'électrons dis tinctes suivan t leu rs localis ations microsomales ou mitochondriales mais qui utilisent toutes les deux la NADPH comme source d'é lec trons .

NADPH Flavoprotéine Fe2+ R H H+ oxydée substrat

O2

H2O NADP+ Flavoprotéine Fe3+ R OH

Figure 11: Chaîne de transfert d'élec trons utilisa nt un cytochrome P450 dans les mic rosomes.

Les CYPs du réticu lum endoplasmique sont réduits par une pro té ine membranaire , la NADPH cy tochrome P450 réductase. Cette protéine comporte deux domaines contenant chacun une flav ine .

Deux électrons sont ainsi transmis du FAD au FMN puis à l'ion ferrique (Fe3+) de l'hème du cytoch rome . Pour les cytoch romes mitochondriaux, la chaîne de trans fe rt des élec trons comporte, outre une réductase à fla vine, une composante supplé mentaire (proté ine Fe r-Soufre), la fe rrédoxine (adénodoxine dans les glandes su rrénales ) qui joue le rôle de donneur d'électrons.

Les événements du c ycle catalytique des cytochromes P450 peuvent être schématises comme suit (Figure 12 ):

1- Fixa tion du substrat sur le s ite actif de l'enzy me dont le fer hémique est sous la forme ferrique avec expulsion des molécules d'eau p résentes dans le site actif et rupture de la liaison fer-H2O.

2- Réduction du fer ferrique (3+) en fe r ferreux (2+) par transfe rt d 'un électron de la NADPH-P450 réductase sur le fer fe rrique.

3- fix ation de l'ox ygène moléculaire sur la sixiè me liaison du fe r hémique.

4- incorpo ration d'un électron supplémentaire p rovenant soit du cytoch rome b5 soit direc tement de la NADPH-P450 réductase , e t réduction du dioxygéne ferreux en complexe ac tivé capable de réagir avec le subs trat. A ce stade , on peut avoir production de pe roxyde d'hydrogène suivant la réac tion: (Fe2+ -O2-) (RH) + 2 H+ (Fe3+) (RH) +H2O2 in vivo, la signification de cette é tape non productive n'est p as claire.