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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Tajoui, M. (1995). Contribution à l'étude de la contamination de fromages par listeria spp: recherche de souches bactériennes capables d'inhiber la croissance de listeria monocytogènes et caractérisation des fractions antagonistes (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Pharmacie, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/212455/2/91779de3-3d4c-4f84-9eb8-2181abd8f6f8.txt
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TU. c^r 000^1
_________________________________________
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE
Institut de Pharmacie
Laboratoire de Microbiologie et d’Hygiène Ecole de Santé Publique
Laboratoire de Santé et Environnement, Unité des Biocontaminants et Nuisances Physico-Chimiques du Milieu.
Professeur M. DEVLEESCHOUWER
CONTRIBUTION A L’ETUDE DE LA CONTAMINATION DE FROMAGES PAR LISTERIA spp
RECHERCHE DE SOUCHES BACTERIENNES CAPABLES D’INHIBER LA CROISSANCE DE LISTERIA MONOCYTOGENES ET CARACTERISATION DES
FRACTIONS ANTAGONISTES.
TAJOUIMOSTAFA
UNiVEHSiTE LIBRE DE SiiliXELLfcS.
BIBLIOTHEQUE DE MLDECI.^iE - CAMPUS ERAS?/:;;
Route dû Lennik, 808 (Bât. E - G? 607) 1070 BRUXELLES
tr 555-61-70
Thèse présentée pour l’obtention du grade de Docteur en Applications Pharmaceutiques
1995
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE
Institut de Phannacie
Laboratoire de Microbiologie et d’Hygiène Ecole de Santé Publique
Laboratoire de Santé et Environnement, Unité des Biocontaminants et Nuisances Physico-Chimiques du Milieu.
Professeur M. DEVLEESCHOUWER
CONTRIBUTION A L’ETUDE DE LA CONTAMINATION DE FROMAGES PAR USTERIA spp
RECHERCHE DE SOUCHES BACTERIENNES CAPABLES D’INHIBER LA CROISSANCE DE USTERIA MONOCYTOGENES ET CARACTERISATION DES
FRACTIONS ANTAGONISTES.
TAJOUIMOSTAFA
Thèse présentée pour l’obtention du grade de Docteur en Applications Pharmaceutiques
1995
REMERCIMHNTS.
Cette thèse a été réalisée dans le Laboratoire de Microbiologie et d'Hygiène, Institut de Pharmacie, et dans le Laboratoire de Santé et Environnement, Unité des Biocontaminants et Nuisances Physico-Chimigues du Milieu, Ecole de Santé publique, à l'Université Libre de Bruxelles, sous la direction du Professeur M. Devleeschouwer. Je lui exprime toute ma gratitude pour avoir suivi ce travail et contribué à sa réalisation.
Toute ma reconnaissance va aussi à Madame le Professeur J. Dony qui m'a permis d'entamer ces recherches, qui a toujours encouragé mes initiatives et m'a fait profiter de sa grande expérience et de ses connaissances scientifiques.
Je remercie également le Docteur P. André, chef de service du Centre National de Référence des Listeria, Ministère de la Santé Publique, Institut d'Hygiène et d'Epidémiologie, qui a toujours répondu à nos demandes de collaboration. Qu'il soit remercié pour avoir réalisé aimablement le sérotypage de nos souches de Listeria monocytogenes et avoir mis à notre disposition les souches d'origine humaine.
Que soient aussi remerciés, pour m'avoir cordialement accueilli dans leur laboratoire afin de réaliser le ribotypage, le Professeur Kaeckenbeek de l'université de Liège, Faculté de Médecine Vétérinaire, Service de Bactériologie et des Maladies Bactériennes et le Docteur G. Daube, Laboratoire d'Hygiène des Denrées Alimentaires d'origine animale.
Un sincère merci aussi au Professeur P. Debusschere qui m'a fait profiter de son expérience de bactériologiste et de statisticien. J'associe dans ce même sentiment le Professeur J.P.
Dehaye pour les conseils théoriques ou pratiques qu'il m'a prodigués.
Merci ensuite à toutes les personnes qui m'ont aidé à réaliser ce travail, que se soit par un apport matériel ou par un conseil technique ou pratique. Je tiens à remercier tout particulièrement toutes les personnes du laboratoire de Biochimie médicale ou appliquée.
Mes remerciements s'adressent, enfin à tous mes collègues des deux laboratoires pour leur esprit de solidarité et pour la bonne humeur dont ils ont fait preuve.
L'essentiel de ce travail a été réalisé grâce au contrat N°
HH/11/012 des Services du Premier Ministre, Services fédéraux des affaires scientifiques, techniques et culturelles.
TARI F DES MATIERES.
INTRODUCTION
CHAPITRE I
I LISTERIA MONOCYTOGENES ET LISTERIOSE
1.1 Historique... 1
1.2 Caractères bactériologiques...3
1.2.1 Classification du genre Listeria... 3
1.2.2 Les espèces du genre Listeria...3
1.2.3 Listeria monocytogenes... 5
1.2.3.1 Caractères morphologiques... 5
1.2.3.2 Caractères biochimiques... 5
1.2.3.3 Culture et croissance...6
1.2.3.4 Les toxines...7
1.3 Niche écologique et résistance...9
1.3.1 Niche écologique...9
1.3.2 Résistance aux agents physico-chimiques... 9
1.3.2.1 Thermorésistance... 9
1.3.2.2 Réfrigératioa... 10
1.3.2.3 pH et agents chimiques... 11
1.4 Listériose... 12
1.4.1 Manifestations cliniques... 12
1.4.1.1 Forme clinique chez la femme enceinte...12
1.4.1.2 Formes cliniques du nouveau-né...12
1.4.1.3 Formes cliniques chez l’adulte...14
1.4.2 Physiopathologie et immunité... 15
1.4.3 Traitement...17
1.5 Transmission de la listériose... 18
1.5.1 Présence de L. monocytogenes dans les aliments... 19
1.5.1.1 Produits laitiers...19
1.5.1.2 Produits camés et volailles... 20
1.5.1.3 Produits végétaux... 21
1.5.1.4 Poissons et crustacés... 21
1.5.2 Dose infectante... 22
1.6 Epidémiologie...23
1.6.1 Les épidémies de listériose ... 23
1.6.2 Les cas isolés...25
1.6.3 Système de surveillance...25
CHAPITRE II
METHODES DE DETECTION ET MARQUEURS EPIDEMIOLOGIQUES
II. 1 Méthodes de détection... 26
II. 1.1 Procédures d’enrichissement sélectif... 26
II. 1.2 Techniques immunologiques... 28
II. 1.3 Technique d’hybridation... 28
11.1.4 La "PCR"... 29
11.2 Marqueurs épidémiologiques... 29
11.2.1 Marqueurs épidémiologiques classiques... 30
11.2.1.1 Sérotypie...30
11.2.1.2 Lysotypie... 32
11.2.1.3 Bactériocinotypie...32
11.2.2 Profils de sensibilité aux antibiotiques... 33
11.2.3 Typages moléculaires... 33
11.2.3.1 Profils de restriction enzymatique...33
11.2.3.2 Ribotypage...34
11.2.3.3 Typage électrophorétique des isoenzymes... 35
11.2.3.4 Profils plasmidiques...36
CHAPITRE 111
LUTTE CONTRE
LISTERIA MONOCYTOGENES III. 1 Lutte contre la contamination originelle...37111.2 Lutte contre la contamination croisée...38
111.3 Phénomènes d’antagonisme... 40
111.3.1 Les acides organiques... 40
111.3.2 Les métabolites de l’oxygène...41
111.3.3 Le diacétyle...42
111.3.4 Les bactériocines... 42
111.3.4.1 La nisine... 44
111.3.4.2 Lapédiocine...45
II 1.3.5 Application des bactériocines... 46
BUTS DI) TRAVAIL
MATERIEL ET METHODES CHAPITRE I
ETUDE DE LA CONTAMINATION DES FROMAGES PAR
LISTERIA MONOCYTOGENESI Projet de surveillance... 50
1.1 Echantillonnage... 50
1.2 Méthodes de détection de L. monocytogenes... 52
1.2.1 Généralités... 52
1.2.2 Procédures utilisées... 52
1.2.2.1 Homogénéisatioa... 33
1.2.2.2 Méthode directe... 53
1.2.2.3 Procédure du double enrichissement... 53
1.2.2.4 Procédure d’enrichissement à froid... 54
1.2.3 Détection...54
1.3 Identifrcation et sérotypage... 55
1.3.1 Identification... 35
1.3.1.1 Caractères morphologiques...55
1.3.1.2 Caractères biochimiques... 55
1.3.1.2.1 Recherche de la catalase...55
1.3.1.2.2 Etude du métabolisme glucidique... 56
1.3.1.2.3 Recherche de l’hémolyse...56
1.3.1.2.4 Recherche de la mobilité... 57
1.3.1.2.5 Mise en évidence de la nitrate réductase... 57
1.3.2 Sérotypage...58
1.4 Localisation de la contamination... 58
1.5 Quantification des Listeria spp...59
1.6 Recherche et quantification des coliformes... 60
1.7 Sensibilité des Listeria spp aux antibiotiques...61
1.7.1 Description des souches utilisées... 61
1.7.2 Méthode utilisée...61
1.7.3 Interprétation...61
CHAPITRE II
TYPAGE MOLECULAIRE
DE LISTERIA MONOCYTOGENES II. 1 Description des souches...6211.2 Extraction de l’ADN total... 62
11.3 Analyse des profils de restriction enzymatique...64
11.3.1 Restriction enzymatique...64
11.3.1.1 Electrophorèse...64
11.3.1.2 Interprétation des résultats...64
11.4 Hybridation sur profils de restriction...65
11.4.1 Dénaturation et transfert de l’ADN...65
11.4.2 Préparation et marquage de sondes génétiques... 65
11.4.3 Hybridation sur profils de restriction... 66
11.4.3.1 Hybridation...66
11.4.3.2 Réhybridatioa...67
11.4.3.3 Interprétation des résultats...67
CHAPITRE 111
RECHERCHE DES SOUCHES INHIBITRICES DE LISTERIA
MONOCYTOGENES III. 1 Introduction...69111.2 Première étape : recherche des souches antagonistes
111.2.1 Isolement des souches bactériennes... 71111.2.2 Méthode de détection des souches inhibitrices... 71
111.2.2.1 Méthode directe en double couche... 72
111.2.2.1.1 Principe...72
111.2.2.1.2 Procédure utilisée... 72
111.3 Deuxième étape : sélection des souches dont le mécanisme d’inhibition est différent des métabolites acides et du peroxyde d’hydrogène
111.3.1 Méthode des puits...73111.3.1.1 Principe...73
111.3.1.2 Préparation des fractions antagonistes... 73
111.3.1.3 Procédure utilisée... 74
111.3.1.4 Titrage des fractions antagonistes... 75
111.3.1.5 Identification des souches inhibitrices... 75
111.3.1.6 Conservation des souches inhibitrices... 76
111.4 Troisième étape : comparaison de certaines propriétés des fractions antagonistes élaborées par dix souches d’E. faecalis
111.4.1 Comparaison du pouvoir inhibiteur... 77111.4.2 Sensibilité à l’action des enzymes... 78
111.4.3 Sensibilité à l’action de la chaleur... 78
111.5 Quatrième étape : étude de l’inhibition de L. monocytogenes par la souche Enterococcus faecalis B57
111.5.1 Préparation de la fraction antagoniste B57... 79111.5.1.1 Production dans le bouillon MRS et le lait écrémé...79
111.5.1.2 Influence du glucose et du lactose... 80
111.5.1.3 Influence du pH... 81
III.5.2 Caractérisation de la fraction antagoniste B57... 81
111.5.2.1 Effet des métabolites acides et du peroxyde d’hydrogène...82
111.5.2.2 Sensibilité à l’action des enzymes et de la chaleur...82
111.5.2.3 Spectre d’inhibition... 82
111.5.2.4 Mode d’action...83
111.5.2.5 Effet de différentes doses de la fraction antagoniste B57... 84
111.5.2.6 Influence du pH sur la manifestation de l’effet antagoniste...84
111.5.2.7 Inhibition de L. monocytogenes dans le lait écrémé...85
111.5.2.8 Influence de la caséine... 85
111.6
Cinquième étape
:purification partielle la fraction antagoniste B57
111.6.1 Précipitation par le sulfate d’ammonium... 86111.6.2 Dialyse... 87
111.6.3 Chromatographie de filtration sur Sephadex G75... 87
111.6.3.1 Principe...87
111.6.3.2 Chromatographie... 87
111.6.4 Electrophorèse des protéines...88
111.6.4.1 Préparation du gel...88
111.6.4.2 Electrophorèse... .88
111.6.4.3 Traitement du gel...89
111.6.4.4 Révélation de l’action inhibitrice sur le gel de polyacrylamide... 89
111.7 Sixième étape : étude relative à la mise en évidence du support génétique impliqué dans la production de la fraction antagoniste B57
111.7.1 Sélection des souches transformées... 91111.7.2 Extraction des plasmidique... 91
111.7.4 Profil biochimique et antibiorésistance... 92
111.8 Septième étape : étude de l’inhibition de L. monocytogenes par la souche Pediococcus pentosaceus PC55
111.8.1 Résumé des caractéristiques étudiées... 93111.9 Huitième étape : étude de l’inhibition de L. monocytogenes par la nisine.
111.9.1 Préparation de la nisine...95111.9.2 Spectre d’inhibition... 95
111.9.3 Mode d’action...96
111.9.4 Influence du pH sur la manifestation de l’effet antagoniste...97
RESULTATS CHAPITRE 1
ETUDE DE LA CONTAMINATION DES FROMAGES PAR LES
LISTERIAspp
I l PREMIERE PARTIE DE L’ETUDE
1.1.1 Evaluation de la contamination... 98
1.1.2 Répartition de la contamination selon la nature du fromage... 99
1.1.3 Répartition des espèce du genre Listeria... 102
1.1.4 Répartition des sérotypes de L. monocytogenes... 103
1.1.5 Répartitiongéographique... 104
1.2 Etude de la contamination de huit marques de fromages...105
1.2.1 Evolution de la contamination au cours d’une année...105
1.2.2 Localisation de la contantination... 106
1.3 DEUXIEME PARTIE DE L’ETUDE
1.3.1 Evaluation de la contamination... 1081.3.2 Répartition de la contamination selon la nature du fromage... 109
1.3.3 Répartition des espèces du genre Listeria...111
1.3.4 Répartition des sérotypes de L. monocytogenes... 112
1.3.5 Méthode de détection des Listeria ...113
1.3.6 Quantification de L. monocytogenes... 114
1.3.7 Association de la présence de Listenû spp et de la pollution fécale... 115
1.3.8 Répartition géographique... 116
1.4 TROISIEME PARTIE DE L’ETUDE
1.4.1 Evaluation de la contamination...1181.4.2 Influence du mode de commercialisation... 119
1.5 Sensibilité des Listeria aux antibiotiques...120
1.5.1 Résultats ... 120
1.5.2 Conclusions ... 121
1.6
Discussion
... 124CHAPITRE II
TYPAGE MOLECULAIRE DE
LISTERIA MONOCYTOGENES II. 1 Profils de restriction... 13911.2 Hybridations sur profils de restriction... 141
11.2.1 Sonde pour le gène de l’ARNr 16S (endonucléase Hindllf)...141
11.2.1.1 Répartition des souches de L. monocytogenes... 143
11.2.1.1.1 Distribution en fonction du ribotype... 143
11.2.1.1.2 Distribution en fonction du ribotype et du sérotype... 143
11.2.1.1.2.1 Souches isolées de fromages... 143
11.2.1.1.2.2 Souches d’origine clinique... 144
11.2.2 Sonde pour le gène de l’ARNr 16S (endonucléaseÆ^co/Î/)...145
11.2.3 Sonde pour le gène de l’ARNr 23S (endonucléase EcoRT)... 146
11.2.3.1 Répartition des souches de L. monocytogenes... 147
11.2.3.1.1 Distribution en fonction du ribotype... 147
11.2.3.1.2 Distribution en fonction du sérotype et du ribotype... 147
11.2.3.1.2.1 Souches isolées de fromages... 147
11.2.3.1.2.2 Souches d’origine clinique... 148
11.2.4 Sonde pour le gène de l’ARNr 23S (endonucléase HindlII)... 149
II.3 Combinaisons de la sérotypie et de la ribotypie... 151
11.3.1 Répartition des souches de L. monocytogenes... 152
11.3.1.1 Souches isolées de fromages...152
11.3.1.2 Souches d’origine clinique... 153
II .4 Discussions et conclusions...155
CHAPITRE III
RECHERCHE DE BACTERIES INHIBITRICES DE
L.MONOCYTOGENES ET CARACTERISATION DES FRACTIONSANTAGONISTES.
III. 1 Sélection de souches capables d’inhiber la croissance de Listeria monocytogenes ... 165III.2 Inhibition de L. monocytogenes par des souches d’E. 166 111.2.1 Pouvoir inhibiteur sur différentes souches de Lwrma spp...166
111.2.2 Sensibilité à l’action des enzymes... 167
111.2.3 Effet du pH et du peroxyde d’hydrogène... 167
111.2.4 Sensibilité à l’action de la chaleur...168
111.2.5 Conclusions ... 168
III.3 Etude de l’inhibition de L. monocytogenes par la souche E. faecalis B57 ... 169
111.3.1 Production de la fraction antagoniste B57...169
111.3.1.1 Production dans le bouillon MRS... 170
111.3.1.2 Production dans le lait écrémé... 170
111.3.1.3 Influence du glucose et du lactose... 172
111.3.1.4 Influence du pH du milieu...174
111.3.2 Caractérisation des propriétés de la fraction antagoniste B57...176
111.3.2.1 Spécificité antagoniste ... 176
111.3.2.2 Mode d’action... 177
111.3.2.3 Influence du pH sur la manifestation de l’antagonisme... 179
111.3.2.4 Inhibition de L. monocytogenes dans le lait écrémé... 180
III.3.3 Purification partielle de la fraction antagoniste B57...183
111.3.3.1 Précipitation par le sulfate d’ammonium... 183
111.3.3.2 Fractionnement sm gel de filtration... 184
111.3.3.3 Electrophorèse ... 184
111.3.4 Etude relative à la mise en évidence du support génétique impliqué
dans la production de l’entérocine B57... 186
111.3.4.1 Transformation de la souche E.fàecalis B57... 186
111.3.4.2 Profilplasmidique...187
111.3.4.3 Profil biochimique et de l’antibiorésistance...187
111.4
Etude de l’inhibition de L. monocytogenes par la souche
Pediococcus pentosaceus PC55... 188111.4.1 Production de la fraction antagoniste PC55... 188
111.4.2 Caractérisation de la fraction antagoniste PC55...189
111.4.2.1 Effet des métabolites acides et du peroxyde d’hydrogène... 189
111.4.2.2 Sensibilité à l’action des enzymes et de la chaleur... 189
111.4.2.3 Spectre d’inhibition ... 190
111.4.2.4 Mode d’action... 191
111.4.2.5 Influence du pH sur la manifestation de l’antagonisme... 192
III.4.3 Détermination du poids moléculaire de la pédiocine PC55... 192
111.5
Etude de l’inhibition de L. monocytogenes par la nisine
... 194111.5.1 Spectre d’inhibition de la nisine... 194
111.5.2 Mode d’action de la nisine... 196
111.5.3 Influence du pH du milieu sur la manifestation de l’antagonisme.... 197
111.5.4 Comparaison de quelques propriétés des trois bactériocines... 198
Il 1.5.3 Discussions et conclusions... 200
IV
. Conclusions générales...
211BIBLIOGRAPHIE ET LES ANNEXES 220
LISTE DES TABLEAUX.
Tableau 1.
Tableau 2.
Tableau 3.
Tableau 4.
Tableau 5.
Différenciation des espèces du genre Listeria.
Principales épidémies de listériose survenues en Europe et aux Etats- Unis.
Comparaison de différents protocoles d’isolement des Listeria spp à partir des aliments.
Les sérotypes du genre Listeria.
Les espèces et les sérotypes du genre Listeria.
Tableau Ml.
Tableau M2.
Tableau M3.
Tableau M4.
Tableau M5.
Liste des fromages belges et de leurs fabricants.
Liste des arrondissements et chiffres de la population.
Liste des communes tirées au sort dans chaque arrondissement.
Liste des antibiotiques utilisés.
Description des souches utilisées pour le typage moléculaire.
Tableau Tableau Tableau Tableau Tableau Tableau Tableau Tableau Tableau Tableau Tableau Tableau Tableau
RI. Evaluation de la contamination des fromages par Listeria spp (première partie de l’étude, 1988-1990).
R2. Répartition de la contamination selon la nature du fromage.
R3. Répartition du nombre d’échantillons positifs selon la marque et la nature du fromage.
R4. Répartition des espèces du genre Listeria dans les fromages.
R5. Répartition des sérotypes de L. monocytogenes dans les fromages.
R6. Evolution de la contamination par les Listeria spp de huit marques de fromages au cours d’une année.
R6 bis. Evolution de la contamination par les Listeria spp de huit marques de fromages au cours d’une aimée.
R7. Localisation de la contamination des fromages par les Listeria spp.
R8. Evaluation de la contamination des fromages par les Usteria spp (deuxième partie de l’étude, 1991-1992).
R9. Répartition de la contamination en fonction de la nature du fromage.
RIO. Répartition du nombre d’échantillons positifs selon la marque et la nature du fromage.
Rll. Distribution des espèces du genre Listeria dans les fromages.
R12. Distribution des sérotypes de L. monocytogenes dans les fromages.
Tableau R13. Comparaison de trois méthodes de détection des Listeria spp dans les fromages.
Tableau R14. Quantification de L. monocytogenes dans les fromages.
Tableau R15. Association de la présence des Listeria spp et de la pollution fécale.
Tableau R16. Evaluation de la contamination des fromages par Listeria spp (troisième partie de l’étude, 1992-1993).
Tableau R17. Répartition de la contamination par les Listeria spp selon le mode de commercialisation des fromages.
Tableau R18. Profils d’antibiorésistance des souches de Listeria spp d’origine alimentaire et clinique.
Tableau R19. Bilan des résultats.
Tableau R 19a. Evaluation de la contamination des fromages par Listeria monocytogenes.
Tableau R19b. Evaluation de la contamination des fromages par les Listeria spp autres que Listeria monocytogenes.
Tableau R20. Codification et estimation de la taille des firagments détectés (sonde codant pour le gène de l’ARNr 16S, endonucléase HindlII).
Tableau R21. Distribution des souches de L. monocytogenes en fonction du ribotype.
(sonde codant pour le gène de l’ARNr 16S, endonucléase HindlII).
Tableau R22. Distribution des souches de L. monocytogenes en fonction du sérotype et du ribotype (sonde codant pour le gène de l’ARNr 16S, endonucléase HindlII).
Tableau R23. Codification et estimation de la taille des fragments détectés (sonde codant pour le gène de l’ARNr 23S, endonucléase EcoRI).
Tableau R24. Distribution des souches de L. monocytogenes en fonction du ribotype.
(sonde codant pour le gène de l’ARNr 23S, endonucléase EcoRI).
Tableau R25. Répartition des souches de L. monocytogenes en fonction du sérotype et du ribotype (sonde codant pour le gène de l’ARNr 23S, endonucléase EcoRI).
Tableau R26. Comparaison du pouvoir discriminant des méthodes de typage et de leurs combinaisons.
Tableau R27. Classification des souches de L. monocytogenes d’origine alimentaire et clinique par sérotypie, ribotypie et combinaisons.
Tableau R28. Distribution des souches de L. monocytogenes en fonction du type, (combinaison sérotypage - ribotypage I - ribotypage II).
Tableau R29. Souches inhibitrices de L. monocytogenes et leur origine.
Tableau R30. Comparison du pouvoir inhibiteur de dix fractions antagonistes élaborées par dix souches d’£. faecalis.
Tableau R31. Effet des enzymes sur les fractions antagonistes produites par dix souches d’E. faecalis vis-à-vis de L. monocytogenes FA2.
Tableau R32. Spectre d’inhibition de la fraction antagoniste B57.
Tableau R33. Profils biochimiques d’une souche d’£, faecalis B57 productrice de la fraction antagoniste B57 et d’une souche d’£. faecalis B57, transformée, non
productrice de la fraction antagoniste B57.
Tableau R34. Profils d’antibiorésistance d’une souche d’E, faecalis B57 productrice de la fraction antagoniste B57 et d’une souche d’E. faecalis, B57 transformée, non productrice de la fraction antagoniste B57.
Tableau R35. Sensibilité de la fraction antagoniste PC55 à l’action des enzymes et de la chaleur.
Tableau R36. Spectre d’inhibition de la fraction antagoniste PC55.
Tableau R37. Spectre d’inhibition de la nisine.
Tableau R38. Comparaison de queleques caractéristiques de l’entérocine B57 de la pédiocine PC55 et de la nisine.
USTR DFS FIGURES
Figure 1.
Figure 2.
Figure 3.
Figure 4.
Figure 5.
Figure 6.
Figure 7.
Figure 8.
Morphologie de Listeria monocytogenes.
Détection des Listeria spp par la technique de Henry.
Représentation schématique des opérons régulés par prfA.
Mécanisme d’infection des cellules épithéliales de l’intestin pds L.monocytogenes.
Un système modèle d’infection des macrophages par L. monocytogenes.
Evolution des cas déclarés de listériose en Belgique (1985-1991).
Structure chimique de la nisine.
Mécanisme d’altération de la membrane cytoplasmique des bactéries à Gram positif sensibles par la pédiocine AcH.
Figure Ml. Méthodes d’isolement des Listeria spp dans les fromages.
Figure M2. Méthodes de dénombrement des Listeria spp.
Figure M3. Protocole d’hybridation sim profils de restriction.
Figure M4. Protocole de la recherche des souches inhibitrices de L. monocytogenes et caractérisation des fractions antagonistes.
Figure M5. Protocole de purification des fractions antagonistes.
Figure RI.
Figure R2.
Figure R3.
Figure R4.
Figure R5.
Figure R6.
Répartition géographique des fromages contaminés par Listeria monocytogenes (1988-1990).
Répartition géographique des fromages contaminés par Listeria monocytogenes (1991-1992).
Répartition de la contamination par les Listeria spp et par L. monocytogenes selon la nature du firomage.
Répartition de la contamination par les Listeria spp et par L. monocytogenes selon la marque et la nature du fromage.
Distribution des espèces du genre Listeria dans les fromages de 1988 à 1993.
Distribution des sérotypes de Listeria monocytogenes dans les firomages de 1988 à 1993.
Figure R7. Profils de restriction de l’ADN de L. monocytogenes par les endonucléases HindLLL et EcoRL.
Figure R8. Hybridation avec la sonde codant pour le gène de l’ARNr 16S sur profils de restriction générés par l’endonucléase HindLLL.
Figure R9. Représentation schématique des différents profils d’hybridation (sonde pour le gène de l’ARNr 16S, endonucléase Hindlll)
Figure RIO. Hybridation avec la sonde codant pour le gène de l’ARNr 16S sur profils de restriction générés par l’endonucléase EcoRl.
Figure Rll. Hybridation avec la sonde codant pour le gène de l’ARNr 23S sur profils de restriction générés par l’endonucléase EcoRI.
Figure R12. Représentation schématique des différents profils d’hybridation (sonde pour le gène de l’ARNr 23S, endonucléase EcoRI).
Figure R13. Hybridation avec la sonde codant pour le gène de l’ARNr 23S sur profils de restriction générés par l’endonucléase HindlII.
Figure R14. Distribution des souches de L. monocytogenes isolées de fromages et de patients atteints de listériose en fonction du type.
Figure RI 5. Evolution de la production fraction antagoniste B57 au cours du temps et de la croissance de la souche E. faecalis B57 dans le bouillon MRS.
Figure R16. Evolution de la production de la fraction antagoniste B57 au cours du temps et de la croissance de la souche E. faecalis B57 dans le lait écrémé.
Figure R17. Evolution de la croissance de la souche E. faecalis B57 dans le bouillon TP.
Effet du glucose et du lactose.
Figure RI8. Evolution du pH au cours du temps lors de la croissance de la souche E. faecalis B57 dans le bouillon TP. Effet du glucose et du lactose.
Figure R19. Evolution de la biosynthèse de la fraction antagoniste B57 par la souche E.
faecalis B57 dans le milieu TP. Effet du glucose et du lactose.
Figure R20. Evolution de la croissance de la souche E. faecalis B57 dans le bouillon TPG.
Effet du pH du milieu.
Figure R21. Evolution du pH au cours de la croissance de la souche E. faecalis B57 dans le bouillon TPG.
Figure R22. Evolution de la biosynthèse de la fraction antagoniste B57 dans le bouillon TPG.
Effet du pH du milieu.
Figure R23. Mode d’action de la fraction antagoniste B57 sur la croissance de L. monocytogenes FA2.
Figure R24. Effet de différentes doses de la fraction antagoniste B57 sur la croissance de L. monocytogenes FA2.
Figure R25.
Figure R26.
Figure R27.
Figure R28.
Figure R29.
Figure R30.
Figure R31.
Figure R32.
Figure R33.
Figure R34.
Figure R35.
Figure R36.
Figure R37.
Figure R38.
Effet inhibiteur indirect de la fraction antagoniste B57 sur la croissance de L. monocytogenes FA2.
Influence du pH du milieu sur l’nhibition de L. monocytogenes FA2 par la fraction antagoniste B57.
Inhibition de L. monocytogenes par la fraction antagoniste B57 dans le lait écrémé.
Inhibition de L. monocytogenes FA2 par la fraction antagoniste B57 dans le bouillon TP.
Influence de la caséine sur l’inhibition de L. monocytogenes par la fraction antagoniste B57.
Profil d’élution sur gel de Sephadex G75.
Détermination du poids moléculaire de la fraction antagoniste B57.
Evolution de la biosynthèse de la fraction antagoniste PC55 au cours du temps et de la croissance de la souche P. pentosaceus PC55 dans le bouillon MRS.
Mode d’action de la fraction antagoniste PC55 sur la croissance de L. monocytogenes FA2.
Influence du pH du milieu sur l’inhibition de L, monocytogenes par la fraction antagoniste PC55.
Détermination du poids moléculaire de la fraction antagoniste PC55.
Mode d’action de la nisine sur la croissance de L. monocytogenes FA2.
Influence du pH du milieu sur l’inhibition de L. monocytogenes FA2 par la nisine.
Relation phylogénétique entre les Listeria et d’autres bactéries à Gram positif.
INTRODUCTION
CHAPITRE I.
LISTERIA MONOCYTOGENES ET LISTERIOSE.
I.1 Historique.
La première description de la listériose semble remonter à 1911, époque à laquelle HULPHERS, en Suède, a découvert un nouveau germe dans le foie d'un lapin mort de septicémie. Le bacille isolé avait entraîné la formation de larges zones de nécrose hépatique. En conséquence, HULPHERS l'a appelé "Bacillus hepatis”.
Le premier cas décrit de listériose humaine date de 1918.
DUMON et COTONI rapportent le cas d'une méningite mortelle chez un soldat italien. À partir de 1926, plusieurs auteurs isolent le germe et le décrivent sous des noms différents; Listerella hepatolytica, Listerella ovis et Bacterium monocytogenes hominis, et, c'est en 1940, au congrès de bactériologie de New-York que le nom "Listeria monocytogenes" fut admis officiellement
[WELSHIMER, 1981].
L. monocytogenes fut relativement peu étudiée jusqu'aux découvertes d'épidémies d'origine alimentaire en 1983 [SCHLECH et coll., 1983]. Depuis cette date, de nouvelles épidémies de listériose ont été observées surtout en Europe et aux Etats-Unis.
Elles impliquaient divers aliments contaminés (lait, fromage, pâté...) [FLEMING et coll., 1985; LINNAN et coll., 1988; SCHWARTZ et coll. 1989].
1
La découverte de ces épidémies d'origine alimentaire, avec mortalité élevée, a stimulé la recherche sur les Listeria spp.
Depuis, des progrès considérables ont été réalisés dans des domaines variés relatifs au mécanisme de la pathogénicité, au mode de contamination et de transmission, aux voies de propagation et de dissémination ainsi qu'aux méthodes de détection, d'identification et d'inhibition. L'évolution de nos connaissances devrait donc nous permettre de réduire voire d'éliminer le risque de contamination des aliments par ce germe pathogène.
2
1.2 Caractères bactériologiques.
1.2.1 Classification du genre Listeria.
Le genre Listeria est classé parmi les bacilles à Gram positif non sporulés [SEELIGER et JONES, 1986].
Par le passé, le genre Listeria a été inclus dans la famille des Corynebacteriaceae en raison de similitudes morphologiques et physiologiques. À partir de 1974, les bactéries du genre Listeria ont été distinguées des germes voisins : Corynebacterium, Erysipelothrix et Brochothrix par des travaux de séquençage de
l'ARN ribosomique [BUCHANAN et GIBBONS, 1974].
Dans la huitième édition du Bergey's Manual of Déterminâtive Bacteriology, le genre Listeria a été placé comme genre à affiliation incertaine [BUCHANAN et GIBBONS, 1974].
En 1986, SEELIGER et JONES ont montré que le genre Listeria est plus proche des lactobacilles ou des streptocoques que des bactéries corynéformes.
1.2.2 Les espèces du genre Listeria.
Par le passé, le genre Listeria ne comportait qu'une seule espèce, L. monocytogenes. Aujourd'hui, on distingue sept espèces:
L. monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri, L. innocua, L. grayi et L. murrayi.
L'espèce L. denitrificans a été exclue du genre Listeria et transférée dans un nouveau genre Jonesia. J. denitrificans est actuellement la seule espèce appartenant à ce genre [ROCOURT et
COll., 1987].
Les sept espèces du genre Listeria sont réparties en deux branches phylogénétiques composées d'espèces génomiquement proches. L'une est constituée par L. monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri, et L. innocua tandis que l'autre réunit L. grayi et L. murrayi.
3
Tableau 1. Différenciation des espèces du genre Listeria d’après SEELIGER et JONES (1986).
r.iipbcc!i Puthogtnc Itdmolystc l’riHJuclion d'xcidc It pnMir de Réduction du
nitrate D-xylosc T.-rhmnnosc D-mannosidc Mannitol
I.. monocyiogenes 1 1 - 1 1 - -
L. ivanovii 1 1 1 - - - -
!.. innacua - - - V 1 - -
L. welshimeri - - 1 V 1 - -
!.. sreligeri - 1 - - - -
grap - - - - 1 1 -
murrayi - - - V
V 1 1 1
V: Carucltrc
VHrinblc.
Les sept espèces du genre Listeria sont phénotypiquement très semblables et seul un petit nombre de caractères biochimiques permet de les identifier, à savoir : la production d'acide à partir du D-xylose, du L-rhamnose, de 1'a-méthyl-D- mannoside, du mannitol, l'hémolyse spontanée, le test CAMP et l'absence de nitrate réductase (tcibleau 1).
L. grayi et L. murrayi diffèrent des cinq autres espèces par leur aptitude à fermenter le mannitol. La réduction du nitrate permet de différencier ces deux espèces [JONES, 1990; SLADE, 1992] .
Il existe actuellement un système commercial, l'API Listeria, qui permet une identification rapide de toutes les espèces du genre Listeria [BILLE et coll., 1992, KERR et coll., 1993] .
Toutes les bactéries du genre Listeria possèdent un peptidoglycane similaire et la même structure d'acide lipotéichoïque. Elles ont une composition identique en acides gras et en protéines de la paroi [SLADE, 1992]. Cependant, la structure des acides téichoïques diffère en fonction des groupes sérologiques des souches de L. monocytogenes [FIEDLER et RUHLAND, 1987].
4
Figure 1. Morphologie de Listeria monocytogenes d’après GUTKIND et coll. (1989).
Barre = 1 /xm
1.2.3
Listeria monocytogenes.1.2.3.1 Caractères morphologiques.
L. monocytogenes est un petit bacille à Gram positif, non sporulé, non capsulé de 0,5 à 2 /xm sur 0,4 à 0,5 /xm, à extrémités arrondies (figure 1). Le milieu de croissance de la bactérie influence largement l'aspect morphologique. Dans les cultures jeunes, en bouillon, on observe des formes coccoïdes tandis que, dans les cultures plus âgées, des formes filamenteuses se développent et la coloration de Gram peut être variable. La disposition des germes n'est pas caractéristique. Ils peuvent être isolés, par paires, groupés en amas, en palissades ou orientés en forme de V ou Y [SEELIGER et JONES, 1986].
Ce germe est toujours mobile lorsqu'on le cultive entre 20 et 25° C. Par contre il est peu ou pas mobile à 37 °C. Cette particularité constitue un caractère important dans le diagnostic bactériologique du germe. Cette mobilité est due à la présence d'un à quatre flagelles d'implantation péritriche [SEELIGER et JONES, 1986]. Dans une gélose semi solide le germe a une mobilité à proximité de la surface, ce qui lui donne un aspect caractéristique, dite en parapluie.
1.2.3.2 Caractères biochimiques.
L. monocytogenes possède une catalase et est dépourvue d'oxydase. Cette bactérie fermente sans production de gaz de nombreux glucides ; glucose, rhamnose, fructose, mannose, maltose, tréhalose, cellobiose, salicine. Par contre, le xylose, le mannitol, le raffinose, l'inositol, le dulcitol et l'adonitol ne sont pas fermentés. L. monocytogenes hydrolyse l'esculine et donne des réactions de Voges-Proskauer et de rouge de méthyle positives. Elle réduit en 24 heures le lait tournesolé en profondeur sans attaque de la caséine ni coagulation du lait.
Elle ne possède ni gélatinase, ni uréase. L'indole et^ l'hydrogène sulfuré ne sont pas produits.
5
Figure 2. Détection des Listeria par la technique de Henry d’après WOOD (1969).
Microscop* Concav*
Mirror
Light Sourct
1.2.3.3 Culture et croissance.
L. monocytogenes est un germe aérobie anaérobie facultatif, qui pousse bien sur les milieux usuels. Toutefois la culture est favorisée par l'adjonction de 5 % de glucose ou par l'utilisation de milieux à base de tryptone. La température optimale de croissance est de 30 à 37°C, mais L. monocytogenes se développe de 3 à 45“C. Le pH optimal de croissance est compris entre 7,2 et 7,6 mais la croissance est possible entre 5,6 et 9,6. Sur gélose nutritive de type tryptone-agar on obtient en 24 heures de petites colonies de 0,5 à 1,5 mm de diamètre, lisses, transparentes, légèrement convexes avec une fine texture et des bords réguliers. Examinées en transillumination oblique de Henry (figure 2), elles ont une coloration bleu-gris très caractéristique.
Sur gélose au sang, on observe une zone étroite d'hémolyse de type bêta. Cette hémolyse est due à une bêta hémolysine, la listériolysine 0, active sur les hématies de mouton, de cheval, de lapin et sur les hématies humaines.
Trois espèces du genre Listeria sont hémolytiques à savoir:
L. monocytogenes, L. ivanovii et L. seeligeri. L. monocytogenes est pathogène autant pour l'homme que pour l'animal, L. ivanovii est essentiellement responsable d'avortements chez les ovins et bovins, tandis que L. seeligeri n'est pas considérée comme virulente [BOERLIN et coll. 1993; LAMMEROING et coll., 1992].
6
1.2.3.4 Les toxines.
La listériolysine O est le principal facteur de virulence de L. monocytogenes [GORMLEY et coll., 1989]. Cette toxine entraîne chez l'animal des troubles de la conduction cardiaque, et une lyse des macrophages et des hépatocytes. La listériolysine 0 est une protéine de 58 kDaltons, de 529 acides aminés. Cette toxine se fixe sur le cholestérol des membranes, puis forme des pores, notamment dans les membranes érythrocytaires.
La listériolysine O est antigéniquement apparentée aux cytolysines thiol-activées de certaines bactéries à Gram positif.
Ces bactéries sont toutes exclusivement extracellulaires alors que L. monocytogenes est un germe pathogène intracellulaire facultatif [COSSART et COll., 1989; DATTA et KOTHARY, 1993].
La listériolysine O n'est pas le seul élément responsable de la virulence de L. monocytogenes. D'autres facteurs, secrétés ou liés à la structure de la paroi agissent en synergie avec cette toxine. Il s'agit de la phospholipase C, de la métalloprotéase, de l'actine et de l'internaline.
Lors de l'étape initiale d'infection, L. monocytogenes se met en contact avec la cellule par l'intermédiaire de l'internaline. Après fixation, la bactérie est immédiatement phagocytée. La listériolysine O et la phospholipase C détruisent la membrane du phagosome et libèrent la bactérie dans le cytosol.
Le mouvement intra et intercellulaire est facilité par la polymérisation de l'actine intracellulaire [CZUPRYNSKI, 1994].
7
Par l'étude de mutants non hémolytiques, dénués de tout pouvoir pathogène, le gène hly codant pour la listériolysine 0 a été identifié et séquencé [GORMLEY et coll., 1989; DàTTà et coll., 1990].
Le nombre de gènes nécessaires pour l'expression de la pathogénicité de L. monocytogenes n'est pas encore clairement établi. Par l'étude de mutants, des informations partielles ont été obtenues uniquement pour cinq gènes (figure 3). Il s'agit du gène hly, codant pour la listériolysine O, du gène plcÀ, codant pour la phospholipase C, du gène mpl, codant pour la métalloprotéase, du gène actÀ, induisant la polymérisation de l'actine, et le gène inlÀ, codant pour l'internaiine. Tous ces gènes sont situés à proximité du gène hly et sont contrôlés par un gène régulateur, appelé prfÀ [DÀTTÀ et coll., 1993].
Figure 3. Représentation schématique des opérons régulés par prfA.
D’après COSSART, 1992
prfA plcA
PI-PLC
+ + AA
hly Listeriolysin
mpl Mecalloprocease
A
+
A
actA plcB ORFX ORFZ
ActA LcciUlinase ORFY
PRF
1 kb
\K
+ MA
Intenulin
inlB inIB gcne product
1
8
1.3 Niche écologique et résistance.
1.3.1 Niche écologique.
L. monocytogenes est un germe largement répandu dans la nature. Sa niche écologique est très difficile à définir. Ce germe a été isolé dans le sol, la végétation, le fourrage, l'eau des rivières et des égoûts, les matières fécales, dans les aérosols et dans de nombreux produits alimentaires d'origine animale ou végétale [COLBURN et coll. 1990; FÀRBER, 1991;
SPÜRLOCK et ZOTTOLÀ, 1991; VÀRÀBIOFF, 1992; DILLON et PATEL, 1992; MAcGOWAN et coll., 1994]. L'environnement constitue donc un réservoir et une source très importante de contamination.
La capacité qu'a ce germe de survivre pendant de longues périodes dans le sol et sa résistance aux conditions très hostiles permettent une existence de type saprophytique.
1.3.2 Résistance aux agents physico-chimiques.
1.3.2.1 Thermorésistance.
Les études à propos de l'inactivation de L. monocytogenes par la chaleur ont donné des résultats contradictoires. En effet, pour certains auteurs, L. monocytogenes peut supporter une pasteurisation [BEARNS et GIRAUD, 1958] ou est détruit [DONNELLY, et coll., 1987].
Différents temps et températures ont été testés pour évaluer la thermorésistance de L. monocytogenes dans le lait.
DOYLE (1987) a retrouvé des germes survivants après 16,4 secondes à 73,9°C. Ces auteurs ont montré que la thermorésistance de L. monocytogenes est liée à sa présence intraleucocytaire. Par contre, l'étude de BUNNING et coll. (1986)
9
montre que la position intraleucocytaire ne permet pas de protéger ce germe après une exposition de 1,9 secondes à 71,7°C.
BUNNING et coll., (1992) ont cependant observé une augmentation de la thermorésistance de L. monocytogenes à 71,5°C après avoir été exposé à un premier choc thermique de 15 minutes à 48°C avant la pasteurisation.
L'étude de la thermorésistance de L. monocytogenes s'est étendue à d'autres produits alimentaires [SCHOENI et coll., 1991; BUDU- AMOAKO et coll., 1992; HARDIN et coll., 1993].
BUDU-AMOÀKO et coll. utilisant un modèle de chair de homard artificiellement contaminée, ont pu calculer des valeurs de réduction décimale à divers temps et températures. Celles-ci allant de 97 minutes à 51,6°C à 1,06 minutes à 62,7°C.
SCHOENI et coll. ont étudié différents temps et températures allant de 22,4 minutes à 54,4°C à 2,56 minutes à 62,8°C. Les valeurs de réduction décimale calculées dans cette étude montrent que L. monocytogenes est plus résistante que Salmonella dans la viande de boeuf.
1.3.2.2 Réfrigération.
L. monocytogenes est un germe mésophile (croissance optimale à 37°C) qui peut toutefois survivre et se multiplier à 4°C [MASSA et coll., 1990, 1991]. Le temps de génération de L. monocytogenes à 4°C est de 29 heures [ROSENOW et MARTH, 1987]. La conservation prolongée des aliments contaminés à basse température (4°C) favorise la prolifération de ce germe psychrotrophe et augmente le risque de transmission de L. monocytogenes à l'homme.
10
1.3.2.3 pH et agents chimiques.
L'acidification est un moyen très efficace pour préserver les produits alimentaires fermentés des germes pathogènes.
Cependant, L. monocytogenes, contrairement à d'autres pathogènes, est capable de survivre dans des milieux acides dont le pH est compris entre 3,9 et 4,1 [SCHÀACK et MARTH, 1988]. La tolérance de L. monocytogenes à des pH bas dépend toutefois de la nature de l'acide présent [AHAMAD et MARTH, 1990].
Cette bactérie résiste également dans les milieux basiques à pH 9,6 [CONNER et coll. 1986], survit dans des milieux très hostiles contenant 16 % de NaCl [HUDSON, 1992], 30 ppm de nitrite de sodium [SCHLYTER et coll., 1993], 40 % de bile ou 0,5 % de tellurite de potassium [LOWRY et TIONG, 1989; VARABIOFF, 1992].
En plus de la résistance aux agents physico-chimiques, ce germe est capable de s'attacher à la surface de divers supports solides formant ainsi des biofilms. La formation de biofilms permet non seulement la survie de ce germe dans des milieux très hostiles [REN et FRANK, 1993] mais aussi le protège contre l'action de certains désinfectants [MOSTELLER et BISHOP, 1993].
11
1.4 LISTERIOSE.
La listériose est une infection bactérienne dont l'évolution peut être fatale. Elle se manifeste sous forme de méningites, méningo-encéphalites, septicémies et avortements. Les sujets à risques sont les femmes enceintes, les foetus ou les nouveaux- nés, les immunodéprimés et les personnes âgées. La listériose peut aussi se développer en l'absence de cause prédisposante
[JONES, 1990; JENSEN et coll., 1994].
1.4.1 Manifestations cliniques.
1.4.1.1 Forme clinique chez la femme enceinte.
La listériose chez la femme enceinte est une infection bénigne pour la mère mais sévère pour le foetus et le nouveau-né [POYÀRT-SÀLMERON et coll., 1990]. Les signes infectieux chez la femme enceinte sont en général discrets ; syndrome pseudo-grippal avec une fièvre élevée, toux, infection urinaire, troubles digestifs et angines. L'évolution de l'infection maternelle peut aussi avoir pour conséquence la mort foetale ou une naissance prématurée [SCHUCHAT et coll., 1991]. Les septicémies néonatales et les pneumonies sont très fréquentes et le taux de mortalité est très élevé chez les enfants infectés [BURETTE et coll., 1992].
1.4.1.2 Formes cliniques du nouveau-né.
La listériose néonatale était la forme la plus souvent diagnostiquée. L'infection du nouveau-né est le plus souvent due à une transmission foeto-maternelle. Beaucoup plus rarement elle est d'origine nosocomiale [LARSSON, 1978; CAMPBELL et coll., 1981].
12
Les enquêtes épidémiologiques réalisées en France ont montré que les formes néonatales représentaient 60 % des cas de listériose avec un taux de létalité avoisinant 21 % [HUMBERT et coll., 1976].
Le nombre de cas de listériose non néonatale tend augmenter ces dernières années. C'est ce que rapportent BURETTE et coll. (1992) et JONES et coll. (1994). L'étude épidémiologique réalisée par JONES et coll. montre que 62,5 % des cas de listériose recensés ces dix dernières années en Angleterre étaient non néonataux.
La listériose néonatale se traduit par des signes cliniques non spécifiques de souffrance néonatale. On distingue des formes néonatales précoces et tardives.
La forme néonatale précoce survient souvent quelques jours avant l'accouchement, le foetus est infecté par voie transplacentaire et cette infection peut mener à la mort foetale.
Le traitement de la femme peut éviter l'infection foetale.
La listériose néonatale tardive se contracte pendant le passage de la filière génitale. Les signes d'infection du nouveau-né débutent 7 à 8 jours après l'accouchement.
L'infection peut également être asymptomatique.
L. monocytogenes peut dans ces cas être isolée entre autres à partir du liquide gastrique, du méconium ou du placenta.
13
1.4.1.3 Formes cliniques chez l’adulte.
La listériose chez l'adulte et le grand enfant se manifeste essentiellement par des formes neurologiques ou septicémiques.
Les formes neurologiques sont les plus fréquentes (54 % des cas) et les plus graves (taux de létalité: 66,6 %) [BURETTE et coll., 1992] .
Les formes neurologiques apparaissent sous divers aspects à savoir : méningites, méningo-encéphalites et encéphalites pures.
La méningite est souvent d'apparition brutale. La fièvre peut être élevée. Le diagnostic est fait par prélèvement de liquide céphalo-rachidien.
Le syndrome méningé est parfois précédé d'un épisode infectieux fébrile pour lequel le patient est traité, ce qui a comme inconvénient de négativer les cultures et de retarder le traitement adéquat.
Les méningo-encéphalites sont souvent précédées ou accompagnées de symptômes tels que des vomissements répétés, des céphalées violentes et des troubles physiques variés.
Les formes septicémiques sont moins fréquentes, elles s'observent habituellement chez des malades soumis à des thérapeutiques immunodépressives et des personnes atteintes de cancers ou d'hémopathies malignes [SCHUCHAT et coll-, 1993]. La létalité des formes septicémiques est plus importante que celle des formes neuro-méningées.
Les atteintes localisées semblent relativement rares : conjonctivites, adénites, péricardites, abcès et arthrite rhumatoïde [GALLÀGHER et WATANAKUNAKORN, 1988; BOOTH et coll., 1990].
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Figure 4. Mécanisme d’infection des cellules épithéliales de l’intestin par L. monocytogenes proposé par CZUPRYNSKI (1994).
Macrophage Macrophage
1, adhésion de L. monocytogenes aux cellules épithéliales de l'intestin; 2 multiplication du germe dans le cytoplasme; 3, migration et colonisation des cellules adjacentes; 4, infection des macrophages.
1.4.2 Physiopathologie et immunité.
La porte d'entrée de l'infection chez l'homme est localisée aux voies aériennes supérieures et au tube digestif. L'homme peut se contaminer par l'intermédiaire du milieu extérieur, mais la principale source d'infection est la consommation de produits alimentaires contaminés [FLEMING, 1985; HOetcoll., 1986; DILLON et PARTEL, 1992; SCHLECH et coll., 1993]. Le portage intestinal chez l'homme est très variable, de 1 % à 26 %. Ces variations dépendent des individus et de leurs occupations [SCHUCHAT et coll., 1991].
L'étude de CZUPRYNSKI (1994) montre que le portage intestinal de du germe peut entraîner une infection à L. monocytogenes.
L. monocytogenes est un germe opportuniste capable d'infecter in vivo et in vitro non seulement les macrophages mais aussi d'autres cellules non phagocytaires [CZUPRYNSKI 1994; CHASTELLIER et BERCHE, 1994].
Le mécanisme d'infection suggéré par CZUPRYNSKI est schématisé dans la figure 4. L. monocytogenes est une bactérie invasive. En contact des cellules épithéliales de l'intestin, ce germe induit sa propre phagocytose. Une fois à l'intérieur du cytoplame, il détruit la membrane vacuolaire, se multiplie, infecte les cellules adjacentes et atteint les macrophages.
D'après l'étude de TILNEY et TILNEY (1993), l'entrée de L. monocytogenes dans les macrophages se fait par fixation de la bactérie à un récepteur de la membrane cellulaire par l'intermédiaire d'une protéine pariétale, 1'internaiine.
Immédiatement après ce contact, la bactérie est phagocytée par le macrophage (figure 5a).
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Figure 5. Un système modèle d’infection des macrophages par L. monocytogenes d’après TILNEY et TILNEY (1993).
A l'intérieur du phagosome, L. monocytogenes détruit la membrane vacuolaire par la listériolysine O et la phospholipase C et atteint le cytosol.
La bactérie induit rapidement une polymérisation de l'actine cellulaire sous la forme d'une queue de comète que la bactérie laisse derrière elle alors qu'elle se meut à l'intérieur du cytosol (figure 5b). Certaines bactéries atteignent la membrane du macrophage adjacent et la déforment au point de former des pseudopodes très longs (jusqu'à 50 /im) . Lorsque les cellules sont jointives, ces pseudopodes s'invaginent dans la cellule adjacente et donnent naissance à une vacuole à deux membranes contenant la bactérie. L. monocytogenes est capable de lyser cette vacuole et de réinitier un nouveau cycle d'infection (figure 5c).
L'assemblage des fragments de l'actine n'est pas distribué de manière uniforme à la surface de la bactérie mais elle se trouve polarisée à une extrémité (figure 5d). Après deux heures et demie d'infection la bactérie est capable de se déplacer dans le cytoplasme à une vitesse d'environ 1 /im par seconde. Cette vitesse est corrélée à la vitesse de polymérisation de l'actine
[TILNEY et TILNEY., 1993].
À partir du foyer infectieux localisé, les germes passent dans le sang. Ils sont rapidement retenus par les cellules phagocytaires du système réticulo-endothélial, en particulier dans le foie et la rate. Après un stade initial de destruction lié probablement aux macrophages, les bactéries survivantes se multiplient dans les macrophages et envahissent le parenchyme adjacent, créant des foyers de nécrose sur le bord des capillaires sanguins. Les bactéries, à nouveau se disséminent dans le sang. Cette dissémination expose le système nerveux central à une atteinte infectieuse.
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La survie de L. monocytogenes dans les macrophages est une composante majeure du pouvoir pathogène de ce germe. La localisation de la bactérie dans ce type de cellule induit une réponse immunitaire de type cellulaire, les anticorps ne jouant aucun rôle dans l'élimination lors d'une infection primaire ou dans la protection lors d'une réinfection [MITSUYÀMA et coll., 1990].
1.4.3 Traitement.
Introduits en médecine humaine dans les années 1940, les antibiotiques ont indiscutablement permis de traiter un grand nombre de maladies infectieuses. Leur utilisation massive a entraîné la sélection rapide de souches résistantes. Cette évolution s'est traduite par l'émergence de nouveaux caractères de résistance ainsi que par la dissémination de gènes de résistance chez la quasi-totalité des germes bactériens pathogènes pour l'homme. La sensibilité de L. monocytogenes a peu évolué depuis plusieurs décennies. In vitro, cette bactérie est très sensible aux antibiotiques efficaces sur les germes à Gram positif [ROHNER et coll., 1992]. Les antibiotiques actifs sont la pénicilline G, l'ampicilline, l'amoxicilline, les aminosides, l'érythromycine, la tétracycline, le chloramphénicol, la rifampicine, et l'association triméthoprime-sulfaméthoxazole [BOISIVON et coll., 1990]. Parmi les aminosides, la gentamicine et la tobramycine ont une meilleure activité que la kanamycine ou la streptomycine [WIGGINS et coll., 1978].
Malgré la sensibilité de L. monocytogenes à de nombreux antibiotiques, la listériose humaine reste fatale dans 30 à 51,6%
des cas [NOLLA-SALAS et coll., 1993; HUDSON, 1994]. La mortalité élevée de la listériose s'explique en partie par la difficulté de poser rapidement le diagnostic ou par les sites d'infections difficilement accessibles aux traitements.
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En effet, L. monocytogenes est un microorganisme intracellulaire facultatif capable de se développer dans les macrophages dans lesguels le germe peut être protégé des antibiotiques grâce à la membrane du phagosome [DREVETS et coll., 1992], Récemment, DREVETS et coll. (1994) ont montré que la gentamicine est capable de détruire L. monocytogenes à 1^intérieur des macrophages.
La première souche clinique de L. monocytogenes multirésistante, BM4210, a été isolée par POYÀRT-SALMERON et coll.(1990). Cette souche était résistante à la streptomycine, à l'érythromycine, à la tétracycline, à la minocycline et au chloramphénicol. Les expériences de conjugaison de POYÀRT- SALMERON et coll. ont montré que l'ensemble des caractères de résistance était porté par un seul plasmide transférable de 37 Kb, appelé pIPSll.
1.5 Transmission de la listériose.
Chez l'homme, deux modes de transmission de la listériose sont possibles, à savoir : la transmission directe et indirecte.
La transmission directe est peu fréquente. Des cas très rares ont été signalés, notamment dans des maternités [CAMPBELL et coll., 1981; PEJÀVER et coll., 1993], chez des vétérinaires, chez certains éleveurs et chez du personnel de laboratoire [JONES, 1990]. Par contre, la transmission indirecte par l'intermédiaire d'aliments contaminés est la source d'infection la plus souvent évoquée [FLEMING et coll., 1985; HO et coll., 1986; DILLON et PATEL, 1992].
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1.5.1 Présence de L. monocytogenes dans les aliments.
si les fromages à pâte molle ont été fréquemment incriminés dans les récentes épidémies de listériose humaine, Listeria monocytogenes peut être isolé de nombreux autres aliments d'origine animale ou végétale ; lait, crème glacée, légumes, poissons, crustacés, viandes et volailles [DILLON et PATEL, 1992;
DORSÀ et coll., 1993; HARMÀYÀNI et coll., 1993; HELKE et coll., 1993]. La consommation de ces produits implique un risque de transmission de la listériose à l'homme.
1.5.1.1 Produits laitiers.
Le lait cru peut être contaminé par L. monocytogenes [HARVEY et GILHOUR, 1992]. DOMINGUEZ-RODRIGÜEZ et coll. (1985) ont trouvé que 45,3 % des échantillons de lait cru analysés étaient contaminés par ce germe alors que HOURA et coll. (1993) n'en trouvent que 12,7 %. L'environnement de la collecte et de la conservation est la cause la plus souvent évoquée pour expliquer la présence de L. monocytogenes dans le lait [FEDIO et JACKSON, 1992]. La mammite listérienne pose également un problème particulier car elle peut être atypique et le lait de bovins atteints a un aspect normal.
L. monocytogenes a également été isolé dans 16 % des échantillons de fromages à pâte molle analysés en Italie, dans 14 % en France, dans 12,2 % en Allemagne et dans 6,6 % en Suisse [FINI et GILBERT, 1988; BREER et SCHOPFER, 1988].
Les autres types de fromages ne sont pas toujours indemnes de contamination. Dans une étude réalisée par TERPLAN (1988) sur des fromages à pâte dure et demi dure, L. monocytogenes a été isolé respectivement dans 8,9 % et 7,1 % des échantillons.
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La présence de L. monocytogenes dans les fromages peut résulter de la contamination du lait. Elle peut également se faire pendant la fabrication des fromages, leur maturation ou leur distribution. De nombreuses études ont montré que les fromages fabriqués avec du lait pasteurisé peuvent également être contaminés par ce germe [FERNANDEZ-GàRÀYZàBÀL et coll., 1985;
BILLE et GLAUSER, 1988; MOURA et coll., 1993]. L. monocytogenes est un germe capable de persister ou même de se multiplier au cours des différentes étapes de la production [PEARSON et MARTH, 1990; BUAZZI et MARTH, 1992]
1.5.1.2 Produits carnés et volailles.
L'industrie de la viande et des volailles représente un des principaux secteurs de l'industrie alimentaire en raison de la valeur nutritive de ces aliments. Cependant, en raison même de ces qualités nutritionnelles, ces produits constituent un terrain très favorable à la contamination microbienne. Les germes susceptibles d'être rencontrés dans la viande proviennent soit de l'animal lui-même soit de l'environnement pendant les opérations de découpage, de transformation et de conditionnement.
JOHNSON et coll. (1986) ont démontré que l'environnement des abattoirs est la principale cause de contamination.
Les produits carnés n'ont été que rarement impliqués dans la transmission de la listériose humaine bien que le pourcentage de contamination soit relativement élevé [KERR et coll., 1988;
GIRARD et BOUVET, 1993]. En effet, L. monocytogenes a été retrouvé dans 36 % des échantillons de viandes analysés dont 30%
des produits étaient destinés à être consommés crus [PINNER et coll. , 1992]. WONG et coll (1990) retrouvent L.monocytogenes dans plus de 50 % de volailles vendues au détail.
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1.5.1.3 Produits végétaux.
Actuellement on ne dispose que de peu de données concernant la contamination des végétaux par L. monocytogenes malgré leur incrimination dans la transmission de la listériose humaine.
L'épidémie de Boston fut principalement causée par la consommation de céleri, de tomates et de laitue [HO et coll., 1986]; alors que pour l'épidémie survenue au Canada, c'est la consommation d'une salade de choux crus qui a été impliquée, preuves bactériologiques à l'appui [SCHLECH et coll., 1983].
LAINE et MICHARD (1988), ont isolé L. monocytogenes dans des produits de la quatrième gamme, c'est-à-dire les légumes frais, prédécoupés et prêts à l'emploi. PINNER et coll. (1992) ont trouvé lors d'une investigation épidémiologique aux Etats-Unis que 11 % des végétaux et 3 % des fruits prélevés dans les réfrigérateurs de patients étaient contaminés par L. monocytogenes.
1.5.1.4 Poissons et crustacés.
La qualité bactériologique du poisson et des crustacés est étroitement liée, d'une part à leur environnement naturel, et, d'autre part aux conditions d'hygiène lors de la transformation et du conditionnement [DILLON et PATEL, 1992; DORSA et coll., 1993]. L. monocytogenes a été isolé de 9 à 50 % de différents produits de pêche [WEA6ANT et coll., 1988; FARBER, 1991]. La consommation de poissons a été incriminée dans la transmission de cas de listériose humaine en Nouvelle Zélande [DILLON et PATEL, 1992].
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1.5.2 Dose infectante.
On ne dispose pratiquement pas d'informations sur la dose minimale infectante de L. monocytogenes et il n'y a pas non plus d'études quantitatives fiables sur la corrélation entre la quantité de nourriture contaminée consommée et le risque d'infection. SCHLECH et coll. (1993) considèrent que plus de 100 unités formant des colonies (UFC) de L. monocytogenes par gramme constitue un danger potentiel. Le fromage à pâte molle de Californie contenait par exemple 10^ à 10^ UFC de L.monocytogenes par gramme [LINNAN et coll., 1988]. SWAMINATHAN et coll. (1988) ont trouvé 10® UFC par gramme dans un Brie suspecté d'avoir provoqué des cas de listériose.
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