Marqueurs épidémiologiques

Ce sont des techniques de typage mises en oeuvre afin d'établir la ressemblance ou la différence entre des souches bactériennes d'une même espèce. Le typage permet ainsi de déterminer les sources et les voies de dissémination des souches infectieuses. Pour L. monocytogenes deux marqueurs sont couramment utilisés. Il s'agit de la sérotypie et la lysotypie.

Le développement de la biologie moléculaire a permis d'établir de nouvelles approches d'identification et de typage. Ces techniques peuvent être utilisées également comme moyen très efficace pour déterminer les origines de la contamination des produits alimentaires.

11.2.1 Marqueurs épidémiologiques classiques.

11.2.1.1 Sérotypie.

Le sérotypage permet de classer les souches selon leurs caractéristiques de surface. Certains éléments de la paroi bactérienne ont en effet des propriétés antigéniques. L'injection de ces éléments à l'animal déclenche l'apparition d'anticorps. Les sérums sont utilisés pour agglutiner les bactéries porteuses des antigènes correspondants. On regroupe ainsi les bactéries qui ont la même composition antigénique de la paroi.

Les premiers travaux effectués par SEASTONE sur la structure antigénique de L. monocytogenes datent de 1935. PATERSON en 1940 a réussi à reconnaître différents antigènes somatiques (AgO) et flagellaires (AgH). DONKER-VOET (1957) et ensuite SEELIGER et HOHNE (1979) ont complété le schéma de PATERSON en introduisant de nouveaux sérotypes.

Tableau 4. Les sérotypes du genre Listeria d’après SEELIGER et JONES (1986).

Sérotype ^{Andgbae 0 Andgène H}

I/2a r, n, (in) AB

l/2b I, II, (lU) _ABC

l/2c n. (III) _BO

3a II, (ni), rv AB

3b (m), rv, (3ni, xni) _ABC

3c _{(III). rv. (XII. 3nn) BO}

«a (III). (V). vn. DC _ABC

4ab (m). v. VI. VII, K, X _ABC

4b (m), V. VI _ABC

4c (m). V, VI _ABC

4d _{(m). V, VI, vin ABC}

4« _{(in), V, VI. (vm). (DC) ABC}

5 _{(ni). (V), VI. (vni). X ABC}

7 (in). xn, xin _ABC

6a (4f) _{(in). V. (VI). (vm. (DO. XV ABC}

»(^8) (ni), (V), (VI). (VU). DC, x, xi

I~ grayi (iio. XII. xrv E

U murrayi (in), XII, XIV E ( ); Les-andgines ne sont pas toujoun présenc.

Tableau 5. Les espèces et les sérotypes du genre Listeria d’après SEELIGER et JONES (1986).

nspècc _Sdrotype

TJsteria monocytogenes l/2a, l/2b, l/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4c, 7.

IJsteria irmocua 6a, 6b, 4ab

Tûsteria wehhimeri 6a, 6b *

Listeria seeligeri t/2b, 4c, 4d, 6b

Dans la classification sérologique actuelle, on distingue 15 antigènes somatiques notés de I à XV et 5 antigènes flagellaires notés de À à E. La combinaison de ces différents facteurs dans une même bactérie permet de reconnaître à présent 16 sérotypes différents (tableau 4). La répartition des sérotypes pour chaque espèce de Listeria est présentée dans le tableau 5.

Les facteurs antigéniques des Listeria spp ne sont pas tous spécifiques, il existe en effet de nombreuses réactions croisées avec d'autres antigènes bactériens, en particulier avec certains antigènes de staphylocoques et d'entérocoques [ÀUDURIER et MARTIN, 1989].

La distribution des sérotypes dans les sources pathologiques à travers le monde n'est pas uniforme. Les épidémies survenues en France, en Allemagne et Suisse font apparaître une nette dominance du sérotype 4b. En revanche, le sérotype l/2a était dominant dans l'épidémie d'Angleterre et d'Autriche. En Belgique,

le sérotype 4b est largement dominant depuis 1985, mais en 1992 c'est plutôt le sérotype l/2a qui a été le fréquemment isolé

[ANDRE, 1993].

La répartition des sérotypes dans les denrées alimentaires fait apparaître une nette dominance du sérotype l/2a [HARVEY et GILMOUR, 1992]. Par contre, en Italie, COMI et coll. (1992) ont isolé dans la viande et les produits carnés une fréquence élevée

(56,9 % des souches) du sérotype l/2c.

La sérologie a permis d'augmenter les connaissances épidémiologiques. Toutefois, le faible nombre de sérotypes et en particulier la fréquence élevée de certains sérotypes fait que la sérologie n'est pas suffisante pour l'identification des clones de L. monocytogenes.

11.2.1.2 Lysotypie.

La lysotypie est basée sur l'action spécifique des bactériophages. La fixation des phages sur la bactérie sensible exige au niveau de sa surface la présence de récepteurs phagiques. Chaque phage reconnaît un type de site qui lui est spécifique. La différence de sensibilité aux bactériophages permet de répartir les souches en plusieurs classes appelées lysotypes et de discriminer ainsi différents lysotypes.

Une étude multicentrique menée en 1981 afin de standardiser la lysotypie a montré les limites de ce système car le pourcentage de souches typables varie en fonction de l'origine géographique des souches. Avec la même batterie de phages, 78,4 % des souches françaises, 59 % des souches anglaises et seulement 39,6 % des souches isolées en Hongrie ont été typées [AUDURIER et MARTIN, 1989]. Récemment, deux nouveaux systèmes ont été développés par GERNER-SMIDT et coll., (1993) et ESTELA et SOFOS,

(1993) .

Le système danois, développé par GERNER-SMIDT et coll., a permis de typer 87 à 92 % des souches de L. monocytogenes avec 26 phages.

Le système Américain de ESTELA et SOFOS a permis de typer 90,7 à 97,6 % des souches testées avec 14 phages.

11.2.1.3 Bactériocinotypie.

Ce système de typage constitue un domaine relativement peu exploré pour l'instant chez L. monocytogenes.

Les premiers travaux effectués sur le pouvoir bactériocinogène

de L. monocytogenes ont été décrits par SWORD et PICKETT (1961).

ORTEL (1989) a examiné la production de monocines chez 162 souches de L. monocyotogenes. Ce système de typage est très peu

discriminatoire. Les 162 souches ont été classées en seulement six groupes différents. Récemment CURTIS et MITCHELL (1992) ont confirmé que ce système de typage offre trop peu d'informations pour discriminer les souches de L. monocytogenes.

11.2.2 Profils de sensibilité aux antibiotiques.

Généralement les souches de L. monocytogenes sont sensibles à de nombreux antibiotiques, de ce fait, la caractérisation des souches de L. monocytogenes par cette technique est limitée

[SLM>E et COLLINS-THOMPSON, 1990; SLADE, 1992].

11.2.3 Typages moléculaires.

11.2.3.1 Profils de restriction enzymatique.

L'identification et la différenciation des bactéries par l'analyse des profils de restriction enzymatique (REÀ,Restriction Endonucléase Analysis) repose sur la comparaison du polymorphisme des fragments de restriction de l'ADN. Les endonucléases sont des enzymes de restriction qui reconnaissent des séquences très précises au niveau de l'ADN. Le clivage de l'ADN par ces endonucléases permet d'obtenir différents fragments. La taille et le nombre des fragments déterminent le profil de restriction. Le nombre de fragments obtenus par les endonucléases dépend de la longueur des séquences reconnues et de leur constitution respective en bases [MCCLELLAND et coll., 1987].

Certaines endonucléases comme EcoRI (G-AATTC) et HindlII (A- ÀGCTT) coupent l'ADN en plusieurs sites et engendrent ainsi un nombre très important de fragments. Les informations obtenues laissent souvent des ambiguïtés compte tenu du nombre élevé de fragments et des difficultés (^^appréciation des variations.

autres endonucléases comme Nael, Smal, SacII, Apal et Notl

reconnaissent peu de sites sur l'ADN de L. monocytogenes et engendre un faible nombre de fragment. CARRIERE et coll. (1991) ont obtenu 3 à 6 fragments avec l'endonucléase Notl et 15 à 17 fragments avec Apal.

De nombreuses études ont montré que l'analyse des profils de restriction est un marqueur épidémiologique utile pour la discrimination des souches de L. monocytogenes [WESLEY et coll., 1990; SZABO et DESNARCHELIER, 1990; HOWARD et coll. 1992].

NOCERA et coll. (1990) ont utilisé l'endonucléase EcoRI pour typer les 120 souches de L. monocytogenes isolées lors de l'épidémie de Suisse : 10 profils REA ont été obtenus.

SZABO et DESNARCHELIER (1990) ont utilisé 1'endonucléase HindlII

pour typer 96 souches de Listeria spp., 10 profils REA ont été obtenus et ils ont démontré que cette méthode est stable et reproductible.

11.2.3.2 Ribotypage

La spécificité avec laquelle les molécules d'ADN et d'ARN forment des structures en duplex stables a mené à l'application de cette propriété dans la technique appelée hybridation des acides nucléiques. Hybridation signifie appariement de bases. On utilise cette technique pour identifier et localiser des séquences spécifiques au sein d'une longue séquence d'ADN ou d'un mélange de molécules d'ARN. La stabilité du duplex est en rapport direct avec la complémentarité des deux brins d'acide nucléique. On peut faire varier les conditions physiques dans lesquelles s'opère l'hybridation de façon à ce qu'un brin d'acide nucléique puisse servir de sonde pour son partenaire complémentaire.

Dans le ribotypage l'identification et la caractérisation des souches sont basées sur la comparaison des polymorphismes des fragments d'hybridation. Le nombre et la taille des fragments hybridés permettent d'établir le degré d'homologie et de différencier ainsi les souches bactériennes.

L'intérêt de la méthode de ribotypage réside dans la facilité d'interprétation des résultats et la possibilité d'hybrider successivement l'échantillon avec plusieurs sondes différentes ce qui permet d'augmenter le pouvoir de discrimination des souches.

De nombreuses études ont montré que le ribotypage est une méthode de typage très utile lors des investigations épidémiologiques. BALOGA et HARLANDER (1991) ont obtenu 6 ribotypes parmi 28 souches de L. monocytogenes. L'étude réalisée par NOCERA et coll. (1993) a permis de distinguer 13 ribotypes différents parmi les 96 souches de L. monocytogenes testées. Enfin, NORRUNG et GERNER-SMIDT (1993) ont distingué 14 ribotypes différents parmi les 99 souches de L. monocytogenes testées.