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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Tajoui, M. (1995). Contribution à l'étude de la contamination de fromages par listeria spp: recherche de souches bactériennes capables d'inhiber la croissance de listeria monocytogènes et caractérisation des fractions antagonistes (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Pharmacie, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/212455/1/6ff610b4-c0f2-4122-8815-9da4a1e0f589.txt
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I
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE
Institut de Pharmacie
Laboratoire de Microbiologie et d’Hygiène Ecole de Santé Publique
Laboratoire de Santé et Environnement, Unité des Biocontaminants et Nuisances Physico-Chimiques du Milieu.
Professeur M. DEVLEESCHOUWER
CONTRIBUTION A L’ETUDE DE LA CONTAMINATION DE FROMAGES PAR USTERIA spp
RECHERCHE DE SOUCHES BACTERIENNES CAPABLES D’INHIBER LA CROISSANCE DE USTERIA MONOCYTOGENES ET CARACTERISATION DES
FRACTIONS ANTAGONISTES.
TAJOUIMOSTAFA
V
Université Libre de Bruxelles
0031BG153
tu grade de
aceutiques
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE
Institut de Pharmacie
Laboratoire de Microbiologie et d’Hygiène Ecole de Santé Publique
Laboratoire de Santé et Environnement, Unité des Biocontaminants et Nuisances Physico-Chimiques du Milieu.
Professeur M. DEVLEESCHOUWER
CONTRIBUTION A L’ETUDE DE LA CONTAMINATION DE FROMAGES PAR LISTERIA spp
RECHERCHE DE SOUCHES BACTERIENNES CAPABLES D’INHIBER LA CROISSANCE DE USTERIA MONOCYTOGENES ET CARACTERISATION DES
FRACTIONS ANTAGONISTES.
TAJOUIMOSTAFA
Thèse présentée pour l’obtention du grade de Docteur en Applications Pharmaceutiques
1995
REMFRCÏMHNTS.
Cette thèse a été réalisée dans le Laboratoire de Microbiologie et d'Hygiène, Institut de Pharmacie, et dans le Laboratoire de Santé et Environnement, Unité des Biocontaminants et Nuisances Physico-Chimiques du Milieu, Ecole de Santé publique, à l'Université Libre de Bruxelles, sous la direction du Professeur M. Devleeschouwer. Je lui exprime toute ma gratitude pour avoir suivi ce travail et contribué à sa réalisation.
Toute ma reconnaissance va aussi à Madame le Professeur J. Dony qui m'a permis d'entamer ces recherches, qui a toujours encouragé mes initiatives et m'a fait profiter de sa grande expérience et de ses connaissances scientifiques.
Je remercie également le Docteur P. André, chef de service du Centre National de Référence des Listeria, Ministère de la Santé Publique, Institut d'Hygiène et d'Epidémiologie, qui a toujours répondu à nos demandes de collaboration. Qu'il soit remercié pour avoir réalisé aimablement le sérotypage de nos souches de Listeria monocytogenes et avoir mis à notre disposition les souches d'origine humaine.
Que soient aussi remerciés, pour m'avoir cordialement
accueilli dans leur laboratoire afin de réaliser le ribotypage,
le Professeur Kaeckenbeek de l'université de Liège, Faculté de
Médecine Vétérinaire, Service de Bactériologie et des Maladies
Bactériennes et le Docteur G. Daube, Laboratoire d'Hygiène des
Denrées Alimentaires d'origine animale.
Un sincère merci aussi au Professeur P. Debusschere qui m'a fait profiter de son expérience de bactériologiste et de statisticien. J'associe dans ce même sentiment le Professeur J.P.
Dehaye pour les conseils théoriques ou pratiques qu'il m'a prodigués.
Merci ensuite à toutes les personnes qui m'ont aidé à réaliser ce travail, que se soit par un apport matériel ou par un conseil technique ou pratique. Je tiens à remercier tout particulièrement toutes les personnes du laboratoire de Biochimie médicale ou appliquée.
Mes remerciements s'adressent, enfin à tous mes collègues des deux laboratoires pour leur esprit de solidarité et pour la bonne humeur dont ils ont fait preuve.
L'essentiel de ce travail a été réalisé grâce au contrat N°
HH/11/012 des Services du Premier Ministre, Services fédéraux des
affaires scientifiques, techniques et culturelles.
TARI F DHS MATIERES.
INTRODUCTION
CHAPITRE I
I LISTERIA MONOCYTOGENES ET LISTERIOSE
1.1 Historique... 1
1.2 Caractères bactériologiques...3
1.2.1 Classification du genre Listeria... 3
1.2.2 Les espèces du genre Listeria...3
1.2.3 Listeria monocytogenes... 5
1.2.3.1 Caractères morphologiques... 5
1.2.3.2 Caractères biochimiques... 5
1.2.3.3 Culture et croissance...6
1.2.3.4 Les toxines... 7
1.3 Niche écologique et résistance... 9
1.3.1 Niche écologique...9
1.3.2 Résistance aux agents physico-chimiques... 9
1.3.2.1 Thermorésistance... 9
1.3.2.2 Réfrigération... 10
1.3.2.3 pH et agents chimiques... 11
1.4 ListérioscL... 12
1.4.1 Manifestations cliniques... 12
1.4.1.1 Forme clinique chez la femme enceinte... 12
1.4.1.2 Formes cliniques du nouveau-né... 12
1.4.1.3 Formes cliniques chez l’adulte... 14
1.4.2 Physiopathologie et immunité... 15
1.4.3 Traitement... .17
1.5 Transmission de la listériose... 18
1.5.1 Présence de L. monocytogenes dans les aliments... 19
1.5.1.1 Produits laitiers... 19
1.5.1.2 Produits camés et volailles...20
1.5.1.3 Produits végétaux... 21
1.5.1.4 Poissons et cmstacés...21
1.5.2 Dose infectante...22
1.6 Epidémiologie... 23
1.6.1 Les épidémies de listériose ...23
1.6.2 Les cas isolés...25
1.6.3 Système de surveillance... 25
CHAPITRE 11
METHODES DE DETECTION ET MARQUEURS EPIDEMIOLOGIQUES
II. 1 Méthodes de détection...26
II. 1.1 Procédures d’enrichissement sélectif... 26
11.1.2 Techniques immunologiques... 28
II. 1.3 Technique d’hybridation...28
II. 1.4 La "PCR"... 29
11.2 Marqueurs épidémiologiques... 29
11.2.1 Marqueurs épidémiologiques classiques... 30
11.2.1.1 Sérotypie... 30
11.2.1.2 Lysotypie...32
11.2.1.3 Bactériocinotypie...32
11.2.2 Profils de sensibilité aux antibiotiques... 33
11.2.3 Typages moléculaires... 33
11.2.3.1 Profils de restriction enzymatique... 33
11.2.3.2 Ribotypage...34
11.2.3.3 Typage électrophorétique des isoenzymes... 35
11.2.3.4 Profils plasmidiques...36
CHAPITRE III LUTTE CONTRE LISTERIA MONOCYTOGENES III. 1 Lutte contre la contamination originelle... 37
111.2 Lutte contre la contamination croisée...38
111.3 Phénomènes d’antagonisme...40
111.3.1 Les acides organiques...40
111.3.2 Les métabolites de l’oxygène...41
111.3.3 Le diacétyle...42
111.3.4 Les bactériocines... 42
111.3.4.1 La nisine... 44
111.3.4.2 Lapédiocine... 45
111.3.5 Application des bactériocines... 46
RUTS DU TRAVAll.
MATERIEL ET METHODES CHAPITRE I
ETUDE DE LA CONTAMINATION DES FROMAGES PAR LISTERIA MONOCYTOGENES
I Projet de surveillance...50
1.1 Echantillonnage...50
1.2 Méthodes de détection de L. monocytogenes... 52
1.2.1 Généralités... 52
1.2.2 Procédures utilisées... 52
1.2.2.1 Homogénéisatioa...53
1.2.2.2 Méthode directe...53
1.2.2.3 Procédure du double enrichissement...53
1.2.2.4 Procédure d’enrichissement à froid... 54
1.2.3 Détectioa...54
1.3 Identification et sérotypage... 55
1.3.1 Identificatioa...35
1.3.1.1 Caractères morphologiques... 55
1.3.1.2 Caractères biochimiques... 55
1.3.1.2.1 Recherche de la catalase... 55
1.3.1.2.2 Etude du métabolisme glucidique...56
1.3.1.2.3 Recherche de l’hémolyse... 56
1.3.1.2.4 Recherche de la mobilité...57
1.3.1.2.5 Mise en évidence de la nitrate réductase...57
1.3.2 Sérotypage... 58
1.4 Localisation de la contamination... 58
1.5 Quantification des Listeria spp...59
1.6 Recherche et quantification des coliformes... 60
1.7 Sensibilité des Listeria spp aux antibiotiques...61
1.7.1 Description des souches utilisées... 61
1.7.2 Méthode utilisée...61
1.7.3 Interprétation...61
CHAPITRE II TYPAGE MOLECULAIRE DE LISTERIA MONOCYTOGENES 11.1 Description des souches... 62
11.2 Extraction de l’ADN total... 62
11.3 Analyse des profils de restriction enzymatique...64
II .3.1 Restriction enzymatique... 64
11.3.1.1 Electrophorèse... .64
11.3.1.2 Interprétation des résultats... 64
11.4 Hybridation sur profils de restriction...65
11.4.1 Dénaturation et transfert de l’ADN...65
11.4.2 Préparation et marquage de sondes génétiques... 65
11.4.3 Hybridation sur profils de restriction... 66
11.4.3.1 Hybridation... 66
II .4.3.2 Réhybridatioa... .67
11.4.3.3 Interprétation des résultats...67
CHAPITRE III RECHERCHE DES SOUCHES INHIBITRICES DE LISTERIA MONOCYTOGENES III. 1 Introduction... 69
II 1.2 Première étape : recherche des souches antagonistes 111.2.1 Isolement des souches bactériennes... 71
111.2.2 Méthode de détection des souches inhibitrices...71
111.2.2.1 Méthode directe en double couche...72
111.2.2.1.1 Principe... 72
111.2.2.1.2 Procédure utilisée... 72
111.3 Deuxième étape : sélection des souches dont le mécanisme d’inhibition est différent des métabolites acides et du peroxyde d’hydrogène 111.3.1 Méthode des puits... 73
111.3.1.1 Principe...73
111.3.1.2 Préparation des fractions antagonistes...73
111.3.1.3 Procédure utilisée...74
111.3.1.4 Titrage des fractions antagonistes...75
111.3.1.5 Identification des souches inhibitrices...75
111.3.1.6 Conservation des souches inhibitrices...76
111.4 Troisième étape : comparaison de certaines propriétés des fractions antagonistes élaborées par dix souches d’E. faecalis 111.4.1 Comparaison du pouvoir inhibiteur... 77
111.4.2 Sensibilité à l’action des enzymes... 78
111.4.3 Sensibilité à l’action de la chaleur... 78
111.5 Quatrième étape : étude de l’inhibition de L. monocytogenes par la souche Enterococcus faecalis B57 111.5.1 Préparation de la fraction antagoniste B57... 79
111.5.1.1 Production dans le bouillon MRS et le lait écrémé... 79
111.5.1.2 Influence du glucose et du lactose... 80
111.5.1.3 Influence du pH...81
III.5.2 Caractérisation de la fraction antagoniste B57...81
111.5.2.1 Effet des métabolites acides et du peroxyde d’hydrogène... 82
111.5.2.2 Sensibilité à l’action des enzymes et de la chaleur... 82
111.5.2.3 Spectre d’inhibition...82
111.5.2.4 Mode d’action... 83
111.5.2.5 Effet de différentes doses de la fraction antagoniste B57... 84
111.5.2.6 Influence du pH sur la manifestation de l’effet antagoniste... 84
111.5.2.7 Inhibition de L. monocytogenes dans le lait écrémé...85
111.5.2.8 Influence de la caséine...85
111.6 Cinquième étape : purification partielle la fraction antagoniste B57 111.6.1 Précipitation par le sulfate d’ammonium...86
111.6.2 Dialyse... 87
111.6.3 Chromatographie de filtration sur Sephadex G75...87
111.6.3.1 Principe... 87
111.6.3.2 Chromatographie...87
111.6.4 Electrophorèse des protéines... 88
111.6.4.1 Préparation du gel... 88
111.6.4.2 Electrophorèse... .88
111.6.4.3 Traitement du gel... 89
111.6.4.4 Révélation de l’action inhibitrice sur le gel de polyacrylamide...89
Il 1.7 Sixième étape : étude relative à la mise en évidence du support génétique impliqué dans la production de la fraction antagoniste B57 111.7.1 Sélection des souches transformées... 91
111.7.2 Extraction des plasmidique...91
111.7.4 Profil biochimique et antibiorésistance...92
111.8 Septième étape : étude de l’inhibition de L. monocytogenes par la souche Pediococcus pentosaceus PC55 111.8.1 Résumé des caractéristiques étudiées...93
111.9 Huitième étape : étude de l’inhibition de L. monocytogenes par la nisine. 111.9.1 Préparation de la nisine... 95
111.9.2 Spectre d’inhibition...95
111.9.3 Mode d’action...96
111.9.4 Influence du pH sur la manifestation de l’effet antagoniste... 97
RESULTATS
CHAPITRE 1
ETUDE DE LA CONTAMINATION DES FROMAGES PAR LES LISTERIA spp
U PREMIERE PARTIE DE L’ETUDE
1.1.1 Evaluation de la contamination... 98
1.1.2 Répartition de la contamination selon la nature du fromage... 99
1.1.3 Répartition des espèce du genre Listeria... 102
1.1.4 Répartition des sérotypes de L. monocytogenes... 103
1.1.5 Répartitiongéographique...104
1.2 Etude de la contamination de huit marques de fromages... 105
1.2.1 Evolution de la contamination au cours d’une année... 105
1.2.2 Localisation de la contamination...106
1.3 DEUXIEME PARTIE DE L’ETUDE 1.3.1 Evaluation de la contamination... 108
1.3.2 Répartition de la contamination selon la nature du fromage... 109
1.3.3 Répartition des espèces du genre Listeria...111
1.3.4 Répartition des sérotypes de L. monocytogenes... 112
1.3.5 Méthode de détection des Listeria spp...113
1.3.6 Quantification de L. monocytogenes... 114
1.3.7 Association de la présence de spp et de la pollution fécale ... 115
1.3.8 Répartition géographique...116
1.4 TROISIEME PARTIE DE L’ETUDE 1.4.1 Evaluation de la contamination...118
1.4.2 Influence du mode de commercialisation... 119
1.5 Sensibilité des Listeria spp aux antibiotiques... 120
1.5.1 Résultats ... 120
1.5.2 Conclusions ... 121
1.6 Discussion ... 124
CHAPITRE 11 TYPAGE MOLECULAIRE DE LISTERIA MONOCYTOGENES II. 1 Profils de restriction... 139
11.2 Hybridations sur profils de restriction...141
11.2.1 Sonde pour le gène de l’ARNr 16S (endonucléase HindlII)...141
11.2.1.1 Répartition des souches de L. monocytogenes...143
11.2.1.1.1 Distribution en fonction du ribotype... 143
11.2.1.1.2 Distribution en fonction du ribotype et du sérotype... 143
11.2.1.1.2.1 Souches isolées de fromages... 143
11.2.1.1.2.2 Souches d’origine clinique... 144
11.2.2 Sonde pour le gène de l’ARNr 16S (endonucléase £^co/î/)... 145
11.2.3 Sonde pour le gène de l’ARNr 23S (endonucléase EcoRI)...146
11.2.3.1 Répartition des souches de L. monocytogenes... 147
11.2.3.1.1 Distribution en fonction du ribotype...147
11.2.3.1.2 Distribution en fonction du sérotype et du ribotype... 147
11.2.3.1.2.1 Souches isolées de fromages...147
11.2.3.1.2.2 Souches d’origine clinique...148
11.2.4 Sonde pour le gène de l’ARNr 23S (endonucléase HindllI)... 149
II.3 Combinaisons de la sérotypie et de la ribotypie... 151
11.3.1 Répartition des souches de L. monocytogenes... 152
11.3.1.1 Souches isolées de fromages... 152
11.3.1.2 Souches d’origine clinique... 153
II .4 Discussions et conclusions... 155
CHAPITRE 111 RECHERCHE DE BACTERIES INHIBITRICES DE L.MONOCYTOGENES ET CARACTERISATION DES FRACTIONS ANTAGONISTES. III. 1 Sélection de souches capables d’inhiber la croissance de Listeria monocytogenes ... 165
II 1.2 Inhibition de L. monocytogenes par des souches d’E. faecalis... 166
111.2.1 Pouvoir inhibiteur sur différentes souches de Usteriasçnç... 166
111.2.2 Sensibilité à l’action des enzymes... 167
111.2.3 Effet du pH et du peroxyde d’hydrogène...167
111.2.4 Sensibilité à l’action de la chaleur... 168
111.2.5 Conclusions ... 168
II 1.3 Etude de l’inhibition de L. monocytogenes par la souche E. faecalis B57 ... 169
111.3.1 Production de la fraction antagoniste B57... 169
111.3.1.1 Production dans le bouillon MRS... 170
111.3.1.2 Production dans le lait écrémé... 170
111.3.1.3 Influence du glucose et du lactose...172
111.3.1.4 Influence du pH du milieu...174
111.3.2 Caractérisation des propriétés de la fraction antagoniste B57... 176
111.3.2.1 Spécificité antagoniste ... 176
111.3.2.2 Moded’action... 177
111.3.2.3 Influence du pH sur la manifestation de l’antagonisme... 179
111.3.2.4 Inhibition de L. monocytogenes dans le lait écrémé... 180
111.3.3 Purification partielle de la fraction antagoniste B57... 183
111.3.3.1 Précipitation par le sulfate d’ammonium... 183
111.3.3.2 Fractionnement sur gel de filtration... 184
111.3.3.3 Electrophorèse ... 184
II 1.3.4 Etude relative à la mise en évidence du support génétique impliqué
dans la production de l’entérocine B57... 186
111.3.4.1 Transformation de la souche E.faecalis B57... 186
111.3.4.2 Profilplasmidique...187
111.3.4.3 Profil biochimique et de l’antibiorésistance... 187
II 1.4 Etude de l’inhibition de L. monocytogenes par la souche Pediococcus pentosaceus PC55... 188
111.4.1 Production de la fraction antagoniste PC55...188
111.4.2 Caractérisation de la fraction antagoniste PC55... 189
111.4.2.1 Effet des métabolites acides et du peroxyde d’hydrogène... 189
111.4.2.2 Sensibilité à l’action des enzymes et de la chaleur...189
111.4.2.3 Spectre d’inhibition ... 190
111.4.2.4 Moded’action...191
111.4.2.5 Influence du pH sur la manifestation de l’antagonisme... 192
II 1.4.3 Détermination du poids moléculaire de la pédiocine PC55...192
111.5 Etude de l’inhibition de L. monocytogenes par la nisine...194
111.5.1 Spectre d’inhibition de la nisine... 194
111.5.2 Mode d’action de la nisine... 196
111.5.3 Influence du pH du milieu sur la manifestation de l’antagonisme.... 197
111.5.4 Comparaison de quelques propriétés des trois bactériocines... 198
III. 5.3 Discussions et conclusions... 200
IV. Conclusions générales... 211
BIBLIOGRAPHIE ET LES ANNEXES 220
LISTE DES TABLEAUX.
Tableau 1.
Tableau 2.
Tableau 3.
Tableau 4.
Tableau 5.
Différenciation des espèces du genre Listeria.
Principales épidémies de listériose survenues en Europe et aux Etats- Unis.
Comparaison de différents protocoles d’isolement des Listeria spp à partir des aliments.
Les sérotypes du genre Listeria.
Les espèces et les sérotypes du genre Listeria.
Tableau Ml.
Tableau M2.
Tableau M3.
Tableau M4.
Tableau M5.
Liste des fromages belges et de leurs fabricants.
Liste des arrondissements et chiffres de la population.
Liste des communes tirées au sort dans chaque arrondissement.
Liste des antibiotiques utilisés.
Description des souches utilisées pour le typage moléculaire.
Tableau Tableau Tableau Tableau Tableau Tableau Tableau Tableau Tableau Tableau Tableau Tableau Tableau
RI. Evaluation de la contamination des fromages par L/^rena spp (première partie de l’étude, 1988-1990).
R2. Répartition de la contamination selon la nature du fromage.
R3. Répartition du nombre d’échantillons positifs selon la marque et la nature du fromage.
R4. Répartition des espèces du genre Listeria dans les fromages.
R5. Répartition des sérotypes de L. monocytogenes dans les fromages.
R6. Evolution de la contamination par les Listeria spp de huit marques de fromages au cours d’une année.
R6 bis. Evolution de la contamination par les Listeria spp de huit marques de fromages au cours d’une année.
R7. Localisation de la contamination des fromages par les Listeria spp.
R8. Evaluation de la contamination des fromages par les Listeria spp (deuxième partie de l’étude, 1991-1992).
R9. Répartition de la contamination en fonction de la nature du fromage.
RIO. Répartition du nombre d’échantillons positifs selon la marque et la nature du fromage.
Rll. Distribution des espèces du genre Listeria dans les fromages.
R12. Distribution des sérotypes de L. monocytogenes dans les fromages.
Tableau R13. Comparaison de trois méthodes de détection des Listeria spp dans les fromages.
Tableau RI4. Quantification de L. monocytogenes dans les fromages.
Tableau RI5. Association de la présence des Listeria spp et de la pollution fécale.
Tableau RI6. Evaluation de la contamination des fromages par Listeria spp (troisième partie de l’étude, 1992-1993).
Tableau R17. Répartition de la contamination par les Listeria spp selon le mode de commercialisation des fromages.
Tableau R18. Profils d’antibiorésistance des souches de Listeria spp d’origine alimentaire et clinique.
Tableau R19. Bilan des résultats.
Tableau R 19a. Evaluation de la contamination des fromages par Listeria monocytogenes.
Tableau R 19b. Evaluation de la contamination des fromages par les Listeria spp autres que Listeria monocytogenes.
Tableau R20. Codification et estimation de la taille des fragments détectés (sonde codant pour le gène de l’ARNr 16S, endonucléase Hindlll).
Tableau R21. Distribution des souches de L. monocytogenes en fonction du ribotype.
(sonde codant pour le gène de l’ARNr 16S, endonucléase HindlII).
Tableau R22. Distribution des souches de L. monocytogenes en fonction du sérotype et du ribotype (sonde codant pour le gène de l’ARNr 16S, endonucléase HindlII).
Tableau R23. Codification et estimation de la taille des fragments détectés (sonde codant pour le gène de l’ARNr 23S, endonucléase EcoRI).
Tableau R24. Distribution des souches de L. monocytogenes en fonction du ribotype.
(sonde codant pour le gène de l’ARNr 23S, endonucléase EcoRI).
Tableau R25. Répartition des souches de L. monocytogenes en fonction du sérotype et du ribotype (sonde codant pour le gène de l’ARNr 23S, endonucléase EcoRI).
Tableau R26. Comparaison du pouvoir discriminant des méthodes de typage et de leurs combinaisons.
Tableau R27. Classification des souches de L. monocytogenes d’origine alimentaire et clinique par sérotypie, ribotypie et combinaisons.
Tableau R28. Distribution des souches de L. monocytogenes en fonction du type,
(combinaison sérotypage - ribotypage I - ribotypage II).
Tableau R29. Souches inhibitrices de L. monocytogenes et leur origine.
Tableau R30. Comparison du pouvoir inhibiteur de dix fractions antagonistes élaborées par dix souches d’£. faecalis.
Tableau R31. Effet des enzymes sur les fractions antagonistes produites par dix souches d’£. faecalis vis-à-vis de L. monocytogenes FA2.
Tableau R32. Spectre d’inhibition de la fraction antagoniste B57.
Tableau R33. Profils biochimiques d’une souche d"E. faecalis B57 productrice de la fraction antagoniste B57 et d’une souche d’E. faecalis B57, transformée, non
productrice de la fraction antagoniste B57.
Tableau R34. Profils d’antibiorésistance d’une souche d’E. faecalis B57 productrice de la fraction antagoniste B57 et d’une souche d’E. faecalis, B57 transformée, non productrice de la fraction antagoniste B57.
Tableau R35. Sensibilité de la fraction antagoniste PC55 à l’action des enzymes et de la chaleur.
Tableau R36. Spectre d’inhibition de la fraction antagoniste PC55.
Tableau R37. Spectre d’inhibition de la nisine.
Tableau R38. Comparaison de queleques caractéristiques de l’entérocine B57 de la pédiocme
PC55 et de la nisine.
IJSTE PRS FIGURES.
Figure 1.
Figure 2.
Figure 3.
Figure 4.
Figure 5.
Figure 6.
Figure 7.
Figure 8.
Morphologie de Listeria monocytogenes.
Détection des Listeria spp par la technique de Henry.
Représentation schématique des opérons régulés par prfA.
Mécanisme d’infection des cellules épithéliales de l’intestin paxL.monocytogenes.
Un système modèle d’infection des macrophages par L. monocytogenes.
Evolution des cas déclarés de listériose en Belgique (1985-1991).
Structure chimique de la nisine.
Mécanisme d’altération de la membrane cytoplasmique des bactéries à Gram positif sensibles par la pédiocine AcH.
Figure Ml.
Figure M2.
Figure M3.
Figure M4.
Figure M5.
Méthodes d’isolement des Listeria spp dans les fromages.
Méthodes de dénombrement des Listeria spp.
Protocole d’hybridation sur profils de restriction.
Protocole de la recherche des souches inhibitrices de L. monocytogenes et caractérisation des fractions antagonistes.
Protocole de purification des fractions antagonistes.
Figure RI.
Figure R2.
Figure R3.
Figure R4.
Figure R5.
Figure R6.
Répartition géographique des fromages contaminés par Listeria monocytogenes (1988-1990).
Répartition géographique des fromages contaminés par Usteria monocytogenes (1991-1992).
Répartition de la contamination par les Listeria spp et par L. monocytogenes selon la nature du fromage.
Répartition de la contamination par les Listeria spp et par L. monocytogenes selon la marque et la nature du fromage.
Distribution des espèces du genre Listeria dans les fromages de 1988 à 1993.
Distribution des sérotypes de Listeria monocytogenes dans les fromages de 1988 à 1993.
Figure R7. Profils de restriction de l’ADN de L. monocytogenes par les endonucléases HindlII et EcoRL.
Figure R8. Hybridation avec la sonde codant pour le gène de l’ARNr 16S sur profils de
restriction générés par l’endonucléase HindlII.
Figure R9. Représentation schématique des différents profils d’hybridation (sonde pour le gène de l’ARNr 16S, endonucléase HindllI)
Figure RIO. Hybridation avec la sonde codant pour le gène de l’ARNr 16S sur profils de restriction générés par l’endonucléase EcoRI.
Figure RI 1. Hybridation avec la sonde codant pour le gène de l’ARNr 23S sm profils de restriction générés par l’endonucléase EcoRI.
Figure R12. Représentation schématique des différents profils d’hybridation (sonde pour le gène de l’ARNr 23S, endonucléase EcoRI).
Figure R13. Hybridation avec la sonde codant pour le gène de l’ARNr 23S sur profils de restriction générés par l’endonucléase HindlII.
Figure R14. Distribution des souches de L. monocytogenes isolées de fromages et de patients atteints de listériose en fonction du type.
Figure R15. Evolution de la production fraction antagoniste B57 au cours du temps et de la croissance de la souche E. faecalis B57 dans le bouillon MRS.
Figure R16. Evolution de la production de la fraction antagoniste B57 au cours du temps et de la croissance de la souche E. faecalis B57 dans le lait écrémé.
Figure R17. Evolution de la croissance de la souche E. faecalis B57 dans le bouillon TP.
Effet du glucose et du lactose.
Figure RI8. Evolution du pH au cours du temps lors de la croissance de la souche E. faecalis B57 dans le bouillon TP. Effet du glucose et du lactose.
Figure R19. Evolution de la biosynthèse de la fraction antagoniste B57 par la souche E.
faecalis B57 dans le milieu TP. Effet du glucose et du lactose.
Figure R20. Evolution de la croissance de la souche E. faecalis B57 dans le bouillon TPG.
Effet du pH du milieu.
Figure R21. Evolution du pH au cours de la croissance de la souche E. faecalis B57 dans le bouillon TPG.
Figure R22. Evolution de la biosynthèse de la fraction antagoniste B57 dans le bouillon TPG.
Effet du pH du milieu.
Figure R23. Mode d’action de la fraction antagoniste B57 sur la croissance de L. monocytogenes FA2.
Figure R24. Effet de différentes doses de la fraction antagoniste B57 sur la croissance de
L. monocytogenes FA2.
Figure R25.
Figure R26.
Figure R27.
Figure R28.
Figure R29.
Figure R30.
Figure R31.
Figure R32.
Figure R33.
Figure R34.
Figure R35.
Figure R36.
Figure R37.
Figure R38.
Effet inhibiteur indirect de la fraction antagoniste B57 sur la croissance de L. monocytogenes FA2.
Influence du pH du milieu sur l’nhibition de L. monocytogenes FA2 par la fraction antagoniste B57.
Inhibition de L. monocytogenes par la fraction antagoniste B57 dans le lait écrémé.
Inhibition de L. monocytogenes FA2 par la fraction antagoniste B57 dans le bouillon TP.
Influence de la caséine sur l’inhibition de L. monocytogenes par la fraction antagoniste B57.
Profil d’élution sur gel de Sephadex G75.
Détermination du poids moléculaire de la fraction antagoniste B57.
Evolution de la biosynthèse de la fraction antagoniste PC55 au cours du temps et de la croissance de la souche P. pentosaceus PC55 dans le bouillon MRS.
Mode d’action de la fraction antagoniste PC55 sur la croissance de L. monocytogenes FA2.
Influence du pH du milieu sur l’inhibition de L. monocytogenes par la fraction antagoniste PC55.
Détermination du poids moléculaire de la fraction antagoniste PC55.
Mode d’action de la nisine sur la croissance de L. monocytogenes FA2.
Influence du pH du milieu sur l’inhibition de L. monocytogenes FA2 par la nisine.
Relation phylogénétique entre les Listeria et d’autres bactéries à Gram positif.
INTRODUCTION
CHAPITRE I.
LISTERIA MONOCYTOGENES ET LISTERIOSE.
I.1 Historique.
La première description de la listériose semble remonter à 1911, époque à laquelle HULPHERS, en Suède, a découvert un nouveau germe dans le foie d'un lapin mort de septicémie. Le bacille isolé avait entraîné la formation de larges zones de nécrose hépatique. En conséquence, HULPHERS l'a appelé ”Bacillus hepatis ".
Le premier cas décrit de listériose humaine date de 1918.
DUMON et COTONI rapportent le cas d'une méningite mortelle chez un soldat italien. À partir de 1926, plusieurs auteurs isolent le germe et le décrivent sous des noms différents: Listerella hepatolytica, Listerella ovis et Bacterium monocytogenes hominis, et, c'est en 1940, au congrès de bactériologie de New-York que le nom "Listeria monocytogenes" fut admis officiellement
[WELSHIMER, 1981].
L. monocytogenes fut relativement peu étudiée jusqu'aux découvertes d'épidémies d'origine alimentaire en 1983 [SCHLECH et coll., 1983]. Depuis cette date, de nouvelles épidémies de listériose ont été observées surtout en Europe et aux Etats-Unis.
Elles impliquaient divers aliments contaminés (lait, fromage, pâté_ _ _) [FLEMING et coll., 1985; LINNAN et coll., 1988; SCHfiARTZ et coll. 1989].
1
La découverte de ces épidémies d'origine alimentaire, avec mortalité élevée, a stimulé la recherche sur les Listeria spp.
Depuis, des progrès considérables ont été réalisés dans des domaines variés relatifs au mécanisme de la pathogénicité, au mode de contamination et de transmission, aux voies de propagation et de dissémination ainsi qu'aux méthodes de détection, d'identification et d'inhibition. L'évolution de nos connaissances devrait donc nous permettre de réduire voire d'éliminer le risque de contamination des aliments par ce germe pathogène.
2
1.2 Caractères bactériologiques.
1.2.1 Classification du genre Listeria.
Le genre Listeria est classé parmi les bacilles à Gram positif non sporulés [SEELIGER et JONES, 1986].
Par le passé, le genre Listeria a été inclus dans la famille des Corynebacteriaceae en raison de similitudes morphologiques et physiologiques. À partir de 1974, les bactéries du genre Listeria ont été distinguées des germes voisins : Corynebacterium, Erysipelothrix et Brochothrix par des travaux de séquençage de
l'ÀRN ribosomique [BUCHANAN et GIBBONS, 1974].
Dans la huitième édition du Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, le genre Listeria a été placé comme genre à affiliation incertaine [BUCHANAN et GIBBONS, 1974].
En 1986, SEELIGER et JONES ont montré que le genre Listeria est plus proche des lactobacilles ou des streptocoques que des bactéries corynéformes.
1.2.2 Les espèces du genre Listeria.
Par le passé, le genre Listeria ne comportait qu'une seule espèce, L. monocytogenes. Aujourd'hui, on distingue sept espèces:
L. monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri, L. innocua, L. grayi et L. murrayi.
L'espèce L. denitrificans a été exclue du genre Listeria et transférée dans un nouveau genre Jonesia. J. denitrificans est actuellement la seule espèce appartenant à ce genre [ROCOURT et coll., 1987].
Les sept espèces du genre Listeria sont réparties en deux branches phylogénétiques composées d'espèces génomiquement proches. L'une est constituée par L. monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri, et L. innocua tandis que l'autre réunit L. grayi et L. murrayi.
3
Tableau 1. Différenciation des espèces du genre Listeria d’après SEELIGER et JONES (1986).
rtipfccc* Plithogfcnc Ildinolydc
D-xytosc
Production
1,-rhiimnosc
d'ncidc h pnrtir de
D-munnosidc Mannitol
Réduction du nitrate
h. monocjtogenes 1 1 - 1 1 - -
L. ivanovii 1 1 1 - - - -
f.. innocua - - - V 1 -
L. wehhimeri - - 1 V 1 - -
L. sfeligeri - 1 » - - - -
f- graji - - - - 1 1 -
U murrayi - - - V
f
1 1 1
V: Camcttrc vsrisbic.
Les sept espèces du genre Listeria sont phénotypiquement très semblables et seul un petit nombre de caractères biochimiques permet de les identifier, à savoir : la production d'acide à partir du D-xylose, du L-rhamnose, de l'a-méthyl-D- mannoside, du mannitol, l'hémolyse spontanée, le test CAMP et l'absence de nitrate réductase (tableau 1).
L. grayi et L. nurrayi diffèrent des cinq autres espèces par leur aptitude à fermenter le mannitol. La réduction du nitrate permet de différencier ces deux espèces [JONES, 1990; SLADE, 1992] .
Il existe actuellement un système commercial, l'API Listeria, qui permet une identification rapide de toutes les espèces du genre Listeria [BILLE et coll., 1992, KERR et coll., 1993] .
Toutes les bactéries du genre Listeria possèdent un peptidoglycane similaire et la même structure d'acide lipotéichoïque. Elles ont une composition identique en acides gras et en protéines de la paroi [SLADE, 1992]. Cependant, la structure des acides téichoïques diffère en fonction des groupes sérologiques des souches de L. monocytogenes [FIEDLER et RUHLAND, 1987] .
4
Figure 1. Morphologie de Listeria monocytogenes d’après GUTKIND et coll. (1989).
/
1.2.3 Listeria monocytogenes.
1.2.3.1 Caractères morphologiques.
L. monocytogenes est un petit bacille à Gram positif, non sporulé, non capsulé de 0,5 à 2 #xm sur 0,4 à 0,5 /im, à extrémités arrondies (figure 1). Le milieu de croissance de la bactérie influence largement l'aspect morphologique. Dans les cultures jeunes, en bouillon, on observe des formes coccoïdes tandis que, dans les cultures plus âgées, des formes filamenteuses se développent et la coloration de Gram peut être variable. La disposition des germes n'est pas caractéristique. Ils peuvent être isolés, par paires, groupés en amas, en palissades ou orientés en forme de V ou Y [SEELIGER et JONES, 1986].
Ce germe est toujours mobile lorsqu'on le cultive entre 20 et 25°C. Par contre il est peu ou pas mobile à 37° C. Cette particularité constitue un caractère important dans le diagnostic bactériologique du germe. Cette mobilité est due à la présence d'un à quatre flagelles d'implantation péritriche [SEELIGER et JONES, 1986]. Dans une gélose semi solide le germe a une mobilité à proximité de la surface, ce qui lui donne un aspect caractéristique, dite en parapluie.
1.2.3.2 Caractères biochimiques.
L. monocytogenes possède une catalase et est dépourvue d'oxydase. Cette bactérie fermente sans production de gaz de nombreux glucides : glucose, rhamnose, fructose, mannose, maltose, tréhalose, cellobiose, salicine. Par contre, le xylose, le mannitol, le raffinose, l'inositol, le dulcitol et l'adonitol ne sont pas fermentés. L. monocytogenes hydrolyse l'esculine et donne des réactions de Voges-Proskauer et de rouge de méthyle positives. Elle réduit en 24 heures le lait tournesolé en profondeur sans attaque de la caséine ni coagulation du lait.
Elle ne possède ni gélatinase, ni uréase. L'indole et^ l'hydrogène sulfuré ne sont pas produits.
5
Figure 2. Détection des Listeria par la technique de Henry
d’après WOOD (1969).
1.2.3.3 Culture et croissance.
L. monocytogenes est un germe aérobie anaérobie facultatif, qui pousse bien sur les milieux usuels. Toutefois la culture est favorisée par l'adjonction de 5 % de glucose ou par l'utilisation de milieux à base de tryptone. La température optimale de croissance est de 30 à 37°C, mais L. monocytogenes se développe de 3 à 45°C. Le pH optimal de croissance est compris entre 7,2 et 7,6 mais la croissance est possible entre 5,6 et 9,6. Sur gélose nutritive de type tryptone-agar on obtient en 24 heures de petites colonies de 0,5 à 1,5 mm de diamètre, lisses, transparentes, légèrement convexes avec une fine texture et des bords réguliers. Examinées en transillumination oblique de Henry (figure 2), elles ont une coloration bleu-gris très caractéristique.
Sur gélose au sang, on observe une zone étroite d'hémolyse de type bêta. Cette hémolyse est due à une bêta hémolysine, la listériolysine O, active sur les hématies de mouton, de cheval, de lapin et sur les hématies humaines.
Trois espèces du genre Listeria sont hémolytiques à savoir:
L. monocytogenes, L. ivanovii et L. seeligeri. L. monocytogenes est pathogène autant pour l'homme que pour l'animal, L. ivanovii est essentiellement responsable d'avortements chez les ovins et bovins, tandis que L. seeligeri n'est pas considérée ccMune virulente [BOERLIN et coll. 1993; LAMMERDING et coll., 1992].
6
1.2.3.4 Les toxines.
La listériolysine O est le principal facteur de virulence de L. monocytogenes [GORMLEY et coll., 1989]. Cette toxine entraîne chez l'animal des troubles de la conduction cardiaque, et une lyse des macrophages et des hépatocytes. La listériolysine O est une protéine de 58 kDaltons, de 529 acides aminés. Cette toxine se fixe sur le cholestérol des membranes, puis forme des pores, notamment dans les membranes érythrocytaires.
La listériolysine O est antigéniquement apparentée aux cytolysines thiol-activées de certaines bactéries à Gram positif.
Ces bactéries sont toutes exclusivement extracellulaires alors que L. monocytogenes est un germe pathogène intracellulaire facultatif [COSSÀRT et coll., 1989; DATTA et KOTHARY, 1993].
La listériolysine O n'est pas le seul élément responsable de la virulence de L. monocytogenes. D'autres facteurs, secrétés ou liés à la structure de la paroi agissent en synergie avec cette toxine. Il s'agit de la phospholipase C, de la métalloprotéase, de l'actine et de l'internaline.
Lors de l'étape initiale d'infection, L. monocytogenes se met en contact avec la cellule par l'intermédiaire de l'internaline. Après fixation, la bactérie est immédiatement phagocytée. La listériolysine 0 et la phospholipase C détruisent la membrane du phagosome et libèrent la bactérie dans le cytosol.
Le mouvement intra et intercellulaire est facilité par la polymérisation de l'actine intracellulaire [CZüPRYNSKI, 1994].
7
Par l'étude de mutants non hémolytiques, dénués de tout pouvoir pathogène, le gène hly codant pour la listériolysine O a été identifié et séquencé [GORMLEY et coll., 1989; DATTA et coll., 1990].
Le nombre de gènes nécessaires pour l'expression de la pathogénicité de L. monocytogenes n'est pas encore clairement établi. Par l'étude de mutants, des informations partielles ont été obtenues uniquement pour cinq gènes (figure 3). Il s'agit du gène hly, codant pour la listériolysine O, du gène plcA, codant pour la phospholipase C, du gène mpl, codant pour la métalloprotéase, du gène actA, induisant la polymérisation de l'actine, et le gène inlA, codant pour 1'internaiine. Tous ces gènes sont situés à proximité du gène hly et sont contrôlés par un gène régulateur, appelé prfA [DATTA et coir., 1993].
Figure 3. Représentation schématique des opérons régulés par prfA.
D’après COSSART, 1992
prfA plcA hly mpl actA plcB
ORFX OR5ZPRF
PI-PLC
+ + AA
Listeriolysin Métalloprotéase Lecithinase ORFY
MA
Intemalin 4- MB
inW c«nc product
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