L'INFORMATION GENETIQUE
à l'échelle
cellulaire
PLAN
I. Support et organisation de l'IG II. Mécanismes moléculaires de
conservation de l'IG
III. Mécanismes moléculaires de l'expression de l'IG
IV. Transmission de l'IG lors de la mitose
I. Support et organisation de l'I G
A. Support moléculaire de l'IG
B. Organisation fonctionnelle des génomes
C. Support cellulaire de l'IG
2 approches possibles :
A.
Support moléculaire de l'IG : les acides nucléiquesPartir de l'observation cellulaire : des chromosomes
à l'organisation moléculaire de la double hélice d'ADN
Partir de l'observation moléculaire : Récupération d'ADN
Hydrolyse
Etude des produits d'hydrolyse Reconstitution de l'organisation
moléculaire
Extraction d'ADN d'oignon
1- Les acides nucléiques : des polymères de nucléotides
a) Produit d'hydrolyse de l'ADN : les nucléotides
A. Support moléculaire de l'IG
5 bases azotées principales
Nucléoside = Base + sucre (pentose) Nucléotide = Base +
sucre +
phosphate(s)
Formes tautomériques des bases azotés : Par transfert de liaisons doubles dans les cycles
"céto" (=O) à pH physiologique ou forme "énol (-OH) pour T et U
"amino" (=O; NH2) ou "imino" (-OH; =N-H) pour C et G
Associations non standard entre bases Mésappariements Mutations dues à erreurs de réplication de l'ADN
Fct OH réactive molécule instable
Synthèse d'ADN à partir de dnt3P et départ de PPi
Possibilité de cyclisation interne 1-3 : AMPc
NAD(P), FAD , coA
b) Autres dérivés de nucléotides remarquables : les coenzymes
c) Propriétés physicochimiques des nucléotides
- Propriétés acides des phosphates et charges négatives - Réactifs spécifiques :
réaction de Feulgen : HCl + Schiff rose
vert de méthyl acétique
- Propriété : absorption de la lumière
1- Les acides nucléiques : des polymères de nucléotides
2- L'ADN, une double hélice antiparallèle
a) Caractère double : association de paires de bases
Règle d'équivalence de Chargaff : Appariement A/T et G/C (1948-49)
Hydrolyse chimique de l'ADN + séparation + identification quantification des nucléotides A, T, C, G
Travaille sur grand nb d'organismes
Systématiquement %A=%T et %G=%C (A+G) / (T+C) = 1
Rapport (A+T)/(C+G) spécifique de l'espèce
(A+T)/(C+G) = 1,52 chez l'Homme (très variable chez bactéries)
Mise en évidence d'interactions stabilisant des empilements de bases
- Spectrométrie IR :
mélange G+A = somme des 2 spectres G et A calculés mélange G+C différent
G et C interagissent en solution
- Loi des gaz parfaits en solution PV=nRT
Nombre de particules observées par unité de volume trop faible
les bases se comportent comme des aggrégats (10 bases environ)
Appariements classique = type Watson et Crick entre bases par liaisons faibles (Hydrogène)
L= 2,4 et 2,6 Å
G°' = 6 à 9 kJmol-1
(mais il existe d'autres appariements des formes tautomèriques)
A=T
G C
a) Caractère double
b) Structure en hélice : fluidité Mise en évidence : Diffraction aux RX (Rosalind Franklin - 1952)
Grand Sillon
Petit Sillon
Caractéristiques structurales : Watson et Crick 1953
hélice droite hélice droite hélice gauche
sillon : grand
petit sillon : écrasé, inaccessible grand sillon : grand
grand petit sillon :
petit Les 2 sillons sont équivalents
paires de bases inclinées de 19° par rapport au plan
perpendiculaire à l'axe de l'hélice
paires de bases perpendiculaires au plan de l'axe de l'hélice
paires de bases perpendiculaires au plan de l'axe de l'hélice
Liaison osidique anti Liaison osidique anti Liaison osidique : purine : syn
pyrimidine :anti Présence
relativement fréquente
Présence très
fréquente Rare (dans zones alternant bases purique/pyrimidique ou avec C méthylées)
hélice A hélice B hélice Z
Liaisons de type Hoogsteen
Autres liaisons permettant triple ou quadruple hélice (ex plasmides)
Souplesse et Fluidité de l'ADN
- Possibilité reploiement sur lui-même
- Possibilité de passer d'une hélice type A à B à Z fct des paramètres du milieu (force ioniques ou prot).
- Fluidité de l'ADN (gènes sauteurs; recombinaisons = échanges entre portions de gènes) variabilité du génôme.
a) Caractère double b) Structure en hélice
c) Hélice antiparallèle : extrémité 5'P et 3'OH Josse, Kaiser et Kornberg :
- polymérisent ADN avec 4 types dnt3P dont un seul type à 32P - hydrolyse en 5'-P (transfert 32P en 3' de la base adjacente)
- compare fréquence des dntP marqués en 5' par rapport à ceux marqués en 3' après hydrolyse
- détermine fréquence de n'importe quel couple, sur chacun des brins de la double hélice
- compare avec modèles parallèles ou antiparallèles.
- Pour les 16 combinaisons, résultats toujours compatibles avec la structure antiparallèle
Convention : ADN avec l'extrémité 5'P sur le brin du bas à gauche
1- Les acides nucléiques : des polymères de nucléotides
2- L'ADN, une double hélice antiparallèle
3- Les ARN : intermédiaires de l'expression de l'ADN
a) Diversité des ARN
Localisation nucléaire et cytoplasmique - Réactif : pyronine
- Localisation : noyau + cytoplasme
Candidat comme intermédiaire entre IG nucléaire et protéines cytoplasmiques (translocation via pores nucléaires)
Diversité des propriétés physicochimiques
- Certains sont solubles dans l'alcool (ARNt) d'autres associés aux membranes du REG via des protéines (ARNr)
- Certains sont associés à protéines :
- de manière permanente (ARNr sur sous unités ribosomiales, HnARN sur SNURPs du splicéosome par ex.)
- transitoire (ARNt et ARNm sur aminoacyltransacétylase lors de traduction)
- Certains sont stables (ARNt, ARNr), d'autres non (ARNm) - Certains sont gros, d'autres petits (certains HnARN de 50 nt seulement)
Approche quantitative
- Globalement : dans une cellules (ex. fibroblaste), 2 à 5 fois plus d'ARN que d'ADN (10 pg d'ADN et 20 à 50 pg d'ARN)
- Proportions
Accumulation : ARNpré r 4%
ARNr cytoplasmique 71%
ARNm cytoplasmique 3% instables Hn ARN nucléaire 7%
ARNt et ARN de petite taille 15%
- Vitesse de synthèse 30nt/s
a) Diversité des ARN
b) Propriétés structurales et fonctionnelles des ARNARNr
- Transcrits dans le nucléole : zone fibrillaire/granuleuse associée aux prot
- ARNr peu variés (moins de 10 différents) - Structure spatiale reployée
Le nucléole, modèle de compartimentation transcriptionnelle.
(A) noyau
(B) détails nucléolaires : centre fibrillaire (FC), composant fibrillaire
dense (DFC), composant granulaire (GC)
(C) Noyau d’une cellule HeLa in vitro ; transcrits naissant en vert (Br-UTP), autres acides nucléiques rouges.
(D) Modèle d’organisation spatiale de la synthèse des ARNr.
- Chez procaryotes :
- 16, 23 et 5 Svedberg chez bactéries (mito 70S : 16 / 23 / 5 / 3)
(CP 70S : 16 / 23 / 5 / 7 / 3)
- 16S de 1542 nt +21prot (riches en Lys et arg et peu d'aromatiques) = 30S petite sous-unité (930 kDa)
- 16S porte séquence de Shine et Dalgarno sur extrémité 3' OH UCCU
s'associe à ARNm et permet la précision de son insertion = Ribosome Binding Site
- 23S de 2904 nt + 5S de 120nt + 31protéines = 50S grosse sous-unité ribosomiale (1590 kDa)
- Chez eucaryotes : - 18 / 28 / 5 / 6 S
- 18S 1800 nt + 33prot = 40S petite sous-unité (1400 kDa) - 28S 4700 nt + 5.8 S 150 nt + 5S 120 nt +49 protéines=60S
grosse sous-unité (2820 kDa), ayant tous un précurseur commun - Activité des ARNr : ribozymes
(nobel Altman : les enzymes ne sont pas toujours des prot.)
b) Propriétés structurales et fonctionnelles des ARNARNt
- solubles ds alcool
- Transcrits par polymérase de type pol I - 80 nt de 200 types différents
- 100 000 copies dans 1 cellule (facteur limitant de synthèse prot) - Pas associés à prot
- StructureII stable (qq heures à qq semaines) en trèfle
stabilisée par triplex (association G46/C13/G22), liaisons H et forces d'empilement des bases
- Structure III en L
boucle anticodon s'associe dans petit sous unité au codon constitué de 3 nt de
l'ARNm pour mettre en correspondance un
acides aminés
Fonction ACC de l'extrémité OH 3' :
liaison
covalente à aa
boucle Tpsi fixe
l'aminoacyltransférase
boucle dihydroU fixe ribosome
Maturation des ARN pré-t en ARNt
b) Propriétés structurales et fonctionnelles des ARNARNm
- Durée de demi-vie breve : - 2 à 5 min chez proca
- 30 min ou plus chez euca
- mise en évidence par Test de Monod et Jacob et Lwoff (1960) sur système inductible (utilisation du lactose par bactéries qui
utilisent normalement le glucose; marquage à l'uridine tritiée pour repérer ARN néosynthétisés
Apparition d'une nouvelle enzyme (bêta galactosidase) +
Apparition d'un nouvel ARN (ni r ni t mais m)
à durée de vie courte (demi vie de 2 min chez E.coli)
- ARNm en partie complémentaire de ADN - Dénaturation ADN et ARN radioactif à 85°C - Renaturation aléatoire à 60°C
- Hydrolyse des ARN libres par RNase - Filtration
- Résultat sur filtre = molécules d'ARN associées à ADN (protégées par association avec ADN)
- SI = SIII : chaine simple non reployée,non associée à prot - coiffe
- 7mG (méthylguanosine) en 5' (lien 5'-5' par estérification de sa fonction libre ribose en 5') plus 2 nt méthylés en 2'OH.
- Intérêts de la coiffe : Stabilise ARNm, protège ARNm des ribonucléases et reconnu par petite sous unité ribosomiale
Méthylations pdt ou juste après ajout de coiffe
reconnaissance par sous-unité ribosomiale
- Queue polyA en 3' (Polyadénylation) :
- Transcrits par pol II qui se détache sur séquence riche en A / T.
- Coupure spécifique (facteurs tissu spécifiques et intervention de SNURP)
- Polymérase met 40 à 400 résidus polyA
- Destruction par nucléase RNase (reconnait séquence de 10 à 1000 nt non traduite entre codon STOP et queue Poy A)
Hybride ADN / ARNm
Mise en évidence de l'épissage des introns (lors du passage dans les pores nucléaires)
Maturation de l'ARN pré-m en ARN
Ex. de l'ovalbumine
- Durée de vie : de plusieurs jours à moins d'une seconde (si moins de 40 A par ex.)
- Modulations par protection par PABP
Poly A Binding Protéines = 600 aa avec 4 domaines de liaison Nterminal à l'ARN très conservés de la levure à l'Homme.
- gènes dont ARN non polyA = histones, interféron, petits ARN nucléaires
- Partie non traduite des ARNm peut se reployer en boucles
mime portions d'ADN ou ARN (= leurres à protéines)
ex : ARNm des prot ribosomiales se replient et peuvent fixer les prot ribo à la place des ARNr, bloquant traduction
b) Propriétés structurales et fonctionnelles des ARNHn ARN, Micro ARN et autres petits ARN non codants
Heterogenus nuclear Ribonucleoparticules : 50 à 300 bases riches en U
- Transcrits par ARNpol III
- Participent à formation de complexes protéiques : Small NUclear RiboParticules (SNURP) et CYtoplasme RiboParticles (CYRP)
- S'associent aux ARNprém lors de passage des pores nucléaires - Positionnent enzymes capables de modifier les ARNprém :
soit en les méthylant (petits ARN de la famille C) soit en isomérisant U en pseudo-uridine
participent donc aux mécanismes d'EPISSAGE
- D'autres ont un rôle cytosolique participent à reconnaissance par les ribosomes de la séquence signal des protéines destinées à être exportées (ds cytoplasme)
b) Propriétés structurales et fonctionnelles des ARN MicroARN
- Mee 1993 Victor Ambros
Anomalie du developpement de Caenorhabditis elegans MicroARN lin4 s'associe à ARNm du gène lin14
(qui assure passage stade larvaire L1 L2)
MicroARN let7 s'associe sur ARNm du gène lin41 (régulant le passage L3 L4)
- Transcrits par Pol II - Taille : 21 à 25 nt
- Diversité : 207 identifié chez l'Homme
- Plus ou moins fortement exprimés (jusqu'à 50 000 copies/ cell)
MicroARN
- A partir de gènes ( 10 000 nt) non codants
priARN (en boucle à une extrémité)
Coupé par DROSHA prémicroARN
(en épingle à cheveux)
Exporté (par exportine5) ds cyto.
DICER coupe en dble brin décalé d'un nt
les 2 brins se séparent microARN mature
Association avec prot =microNucléoRiboParticule capable de s'associer avec ARNm
le dégrade (si parfaite complémentarité) l"'éteind" ss le dégrader
(n'empeche pas l'association avec ribosomes ni la progression de celui-ci sur l'ARNm!)
Autres petits ARN - ARN non codant
Ex : ARN 6S bactérien
- Se replient en double brin imite portion d'ADN reconnue par ARN pol Inhibition compétitive!
