Étude de la résistance à la sclérotiniose chez le soya
Thèse
Maxime Bastien
Doctorat en biologie végétale
Philosophiae Doctor (Ph.D.)
Québec, Canada
Résumé
La sclérotiniose, causée par le champignon Sclerotinia sclerotiorum, est une des maladies les plus importantes de la culture du soya dans l’est du Canada. L’utilisation de cultivars résistants est la manière la plus efficace et économique pour lutter contre l’agent pathogène. Or, la pression de maladie au champ varie considérablement d’une année à l’autre selon les conditions climatiques, ce qui complique l’identification de matériel résistant. Nous avons donc développé une méthode d’inoculation artificielle fiable et reproductible pour évaluer la résistance à la sclérotiniose du soya en serre et au champ. Appelée méthode «du coton», elle consiste à appliquer des morceaux de tampon à démaquiller, trempés dans une suspension de mycélium broyé, sur un bourgeon floral, et à mesurer la longueur de la lésion qui se développe sur la tige après une semaine. Cette méthode simple et rapide donne des résultats comparables à la méthode de référence utilisée au Québec tout en départageant la résistance vraie des mécanismes d’évitement. Nous avons ensuite utilisé la méthode du coton pour caractériser le degré de résistance au sein d’une collection de 130 lignées de soya représentative de l’étendue de la diversité génétique présente chez cette espèce au Québec. En parallèle, nous avons mis au point une méthode de génotypage par séquençage à haut débit pour le soya et l’avons utilisée pour génotyper la collection. Le séquençage a produit 266,7 millions de séquences distinctes qui, après différents filtres, ont révélé 7 864 marqueurs SNP répartis sur les 20 chromosomes du soya. Des analyses d’association entre le degré de résistance et le génotype des lignées de la collection ont révélé la présence de quatre locus de caractère quantitatif (QTL) conférant une résistance accrue à l’agent pathogène. L’association la plus forte a été validée chez une population issue d’un croisement entre deux parents contrastés à ce locus. De plus, aucun des génotypes les plus résistants ne porte tous les allèles de résistance, ce qui indique qu’on peut développer du matériel présentant une résistance accrue à la sclérotiniose. Ces résultats ouvrent des perspectives prometteuses pour la sélection assistée de marqueurs ou la sélection génomique.
Abstract
Sclerotinia stem rot (SSR), caused by the fungus Sclerotinia sclerotiorum, is one of the most important soybean diseases in Eastern Canada. Using resistant varieties is the most efficient and economic way to repress this disease. However disease pressure in the field fluctuates considerably from year to year according to climatic conditions, thus impeding the identification of resistant material. We developed a reliable and reproducible artificial inoculation method to assess resistance in the greenhouse and in the field. Named the «cotton pad method», it relies upon applying a piece of cotton pad soaked in a mycelial suspension on a floral bud and to measure the ensuing lesion length one week after inoculation. This quick and easy method provides disease ratings similar to the reference method used in Québec and is able to distinguish true resistance from disease avoidance mechanisms. We then used the cotton pad method to evaluate the degree of resistance in a panel of 130 soybean lines representing the genetic diversity present in this species in Quebec. In parallel, we developed a high-throughput genotyping by sequencing method for soybean and used it to genotype the collection. Sequencing provided 266.7 million distinct sequences, which yielded 7,864 SNPs on the 20 soybean chromosomes after several filtering steps. Association mapping performed between the genotype of the lines and their resistance level revealed the presence of four quantitative trait loci (QTLs) associated with SSR resistance. The strongest association was validated in a biparental population generated from a cross between two parents contrasted at this locus. Furthermore, none of the most resistant lines developed so far carries all of the resistance alleles, which suggests that it is possible to develop lines presenting increased SSR resistance. These results are promising for marker assisted or genomic selection.
Table des matières
Résumé ... iii
Abstract ... v
Liste des tableaux ... xi
Liste des figures ... xiii
Liste des abréviations ... xvii
Remerciements ... xxi Avant-propos ... xxiii Introduction générale ... 1 Chapitre I Revue bibliographique ... 3 1.1 La sclérotiniose ... 4 1.1.1 Taxonomie ... 4 1.1.2 Agent pathogène ... 4
1.1.3 Importance de la maladie en Amérique du Nord ... 4
1.1.4 Symptomatologie ... 5
1.1.5 Épidémiologie ... 6
1.1.6 Mécanismes moléculaires de l’infection ... 8
1.2 Méthodes de lutte ... 9
1.2.1 Pratiques culturales ... 10
1.2.2 Lutte chimique ... 10
1.2.3 Lutte biologique ... 11
1.3 Résistance à la sclérotiniose chez le soya ... 12
1.3.1 Évitement (résistance apparente) ... 12
1.3.2 Résistance vraie ... 13
1.3.3 Études de la génétique de la résistance ... 14
1.4 Méthodes d’évaluation de la résistance ... 15
1.4.1 Inoculation de la plante entière ... 16
1.4.2 Inoculation de parties de plantes coupées ... 18
1.4.3 Méthodes indirectes ... 19
1.5 Marqueurs génétiques ... 20
1.5.1 Différents types de marqueurs d’ADN ... 20
1.5.2 Marqueurs microsatellites ... 21
1.5.3 Marqueurs SNP ... 21
1.6 Technologies de génotypage à haut débit ... 22
1.6.1 RAD-seq ... 23 1.6.2 RRL ... 23 1.6.3 SLAF-seq ... 24 1.6.4 GBS ... 24 1.7 Méthodes d’analyse de QTL ... 25 1.7.1 Approches classiques ... 25
Chapitre II A Reproducible Assay for Measuring Partial Resistance to Sclerotinia
sclerotiorum in Soybean ... 35
2.1 Résumé ... 37
2.2 Abstract ... 38
2.3 Introduction ... 39
2.4 Materials and Methods ... 42
2.4.1 Plant Material ... 42 2.4.2 Fungal Strain ... 43 2.4.3 Inoculation Procedure ... 43 2.4.5 Field Experiments ... 44 2.4.6 Greenhouse Experiments ... 46 2.4.7 Statistical Analysis ... 46 2.5 Results ... 47 2.5.1 Symptoms ... 47
2.5.2 Field Experiment 1: Effect of Growth Stage at Inoculation and Irrigation on Field Inoculations ... 48
2.5.3 Greenhouse Experiments 1 and 2: Assessment of Disease Reaction Under Controlled Conditions ... 48
2.5.4 Field Experiment 2 and Greenhouse Experiment 3: Reproducibility ... 49
2.5.5 Field Experiment 3: Comparison with Disease Reactions Measured using Conditioned Sclerotia in the Field ... 49
2.6 Discussion ... 50
2.7 Acknowledgments ... 54
2.8 References ... 55
Chapitre III An Improved Genotyping by Sequencing (GBS) Approach Offering Increased Versatility and Efficiency of SNP Discovery and Genotyping ... 65
3.1 Résumé ... 67
3.2 Abstract ... 68
3.3 Introduction ... 69
3.4 Materials and Methods ... 70
3.4.1 Plant Material ... 70
3.4.2 DNA Extraction, Library Preparation and Sequencing ... 71
3.4.3 Scalable Complexity Reduction ... 71
3.4.4 In silico Assessment of Restriction Enzymes, Genes and Transposable Elements ... 72
3.4.5 Processing of Illumina Raw Sequence Read Data and SNP Calling ... 72
3.4.6 Experimental Validation of SNPs ... 72
3.4.7 Functional Annotation of SNPs ... 73
3.4.8 Phylogenetic Analysis ... 73
3.5 Results ... 74
3.5.1 Selection of an Appropriate Enzyme for GBS in Soybean ... 74
3.5.2 Sequencing and Mapping ... 74
3.5.3 SNP Discovery and Distribution ... 75
3.5.4 Experimental Validation of SNPs ... 76
3.5.5 Structural, Functional and Evolutionary Impact of SNPs ... 76
3.5.6 Phylogenetic and Pairwise Diversity Analysis ... 77
3.5.7 Optimizing the Number and Coverage of SNPs by the Use of Selective Primers ... 77
3.6 Discussion ... 78
3.7 Acknowledgments ... 82
3.8 References ... 83
Chapitre IV Genome Wide Association Mapping of Sclerotinia sclerotiorum Resistance in Soybean with a Genotyping by Sequencing Approach ... 95
4.1 Résumé ... 97
4.2 Abstract ... 98
4.3 Introduction ... 99
4.4 Materials and Methods ... 103
4.4.1 Soybean Lines ... 103
4.4.2 Validation Populations ... 103
4.4.3 Phenotypic Evaluation ... 103
4.4.4 DNA Extraction, Library Preparation and Sequencing ... 104
4.4.5 Processing of Illumina Raw Sequence Read Data and SNP Calling ... 105
4.4.6 Genotypic Data Analysis ... 105
4.4.7 Linkage Disequilibrium Analysis ... 105
4.4.8 Association Analysis ... 106
4.4.9 QTL Validation Experiments ... 107
4.4.10 Statistical Analysis of Phenotypic Data ... 107
4.5 Results ... 108
4.5.1 Evaluation of SSR Resistance in a Panel of 130 Soybean Lines ... 108
4.5.2 Marker Distribution ... 108
4.5.3 Linkage Disequilibrium Analysis ... 109
4.5.4 Population Structure Analysis ... 110
4.5.5 Association Mapping ... 110
4.5.6 Validation Experiments ... 111
4.5.7 Genomic Landscape Near the Peak SNP on Gm15 ... 112
4.6 Discussion ... 112
4.7 Conclusions ... 119
4.8 Acknowledgments ... 119
4.9 References ... 120
Chapitre V Discussion générale et conclusions ... 145
Liste des tableaux
Chapitre II - Tableau 1. Field experiment 1 : F values of fixed effects for lesion length (mm) after inoculation with the cotton pad method at two growth stages (R1 vs R3) and with or without irrigation in 2003-2005. ... 59 Chapitre II - Tableau 2. Greenhouse experiment 1 and 2: Mean lesion lengths in
seven soybean genotypes after inoculation with the cotton pad method. ... 59 Chapitre II - Tableau 3. Correlation of lesion lengths obtained in four independent
trials. A total of 26 genotypes were inoculated with the cotton pad method in the field (field experiment 2) or in the greenhouse (greenhouse experiment 3). ... 60 Chapitre III - Tableau 1. Summary of sequenced raw and processed reads in eight soybean genotypes obtained on an Illumina Genome Analyzer II. ... 85 Chapitre III - Tableau 2. Validation of single nucleotide polymorphism calls by
Sanger sequencing. ... 85 Chapitre III - Tableau S1. Functional annotation of SNPs. Annotation was
performed using snpEff v.3 for a collection of SNPs obtained by Illumina sequencing of a GBS library prepared from eight soybean genotypes. ... 92 Chapitre III - Tableau S2. Number of SNPs between pairs of soybean genotypes.
... 92 Chapitre IV - Tableau 1. Marker distribution among chromosomal regions. ... 127 Chapitre IV - Tableau 2. Most significant SNPs associated with resistance. ... 128 Chapitre IV - Tableau S1. Lesion length (mm) among the 130 soybean lines. .... 129
Liste des figures
Chapitre I - Figure 1. Symptômes de la sclérotiniose. a) Plante entière. b) Vue rapprochée de la tige attaquée avec des sclérotes à la surface. ... 5 Chapitre I - Figure 2. Cycle évolutif de la sclérotiniose. ... 7 Chapitre I - Figure 3. Réaction de résistance suite à l’inoculation d’un plant de soya avec le S. sclerotiorum. ... 14 Chapitre II - Figure 1. Cotton pad inoculation and the resulting lesions. (A) Cotton
pad inoculation. (B) Symptoms of Sclerotinia stem rot (7 d after inoculation) on stems of susceptible soybean plants inoculated with the cotton pad method. (C) Symptoms of Sclerotinia stem rot (7 d after inoculation) on stems of resistant soybean plants inoculated with the cotton pad method. ... 61 Chapitre II - Figure 2. Mean lesion length (in millimeters; detransformed data) of
five soybean cultivars after inoculation with the cotton pad method. Progression of the lesions was assessed 8 d after inoculation at either the R1 or R3 stage over 3 yr (2003-2005). Lesion lengths sharing a letter (lowercase for R1; uppercase for R3) are not significantly different at ∝ =0.05. ... 62 Chapitre II - Figure 3. Mean lesion length observed in lines homozygous for the
OAC Bayfield alleles (16 lines) or for the Maple Donovan alleles (10 lines) in field trials conducted at three locations in 2007 as well as one trial conducted in the greenhouse in 2008. For each location, genotypic groups differed significantly (at ∝ =0.01) as indicated by the letters a and b. ... 63 Chapitre II - Figure 4. Distribution of the reaction of soybean lines inoculated with either the cotton pad (lesion length, LL) method or the reference method (disease severity index, DSI) in Sclerotinia trials in 2005 (A), 2006 (B) and 2007 (C). Each line’s reaction is expressed as a percentage of the reaction seen with the highly susceptible check Nattosan (Nat). Additional checks are Maple Donovan (MD; resistant) OAC Bayfield (OB; intermediate susceptibility). ... 64 Chapitre III - Figure 1. Flowchart showing steps performed for the identification of
SNPs in the IGST-GBS pipeline. The process can be divided into three main steps: data processing, mapping and SNP calling. ... 86 Chapitre III - Figure 2. In silico analysis of restriction enzyme sites in the soybean
genome. Fragment size distribution obtained by in silico digestion of soybean chromosome 5 with ApeK1, Pst1 and Mse1 restriction enzymes showing a higher percentage of ApeK1 fragments in a suitable range for genotyping by sequencing. ... 87
Chapitre III - Figure 3. Sequence coverage and SNP distribution (a) Distribution of mapped sequence reads (scaled down to 1/10) and SNPs identified using a GBS approach, and (b) corresponding frequency of genes and transposons identified in the same bins on soybean chromosome 5. All the transposons and genes were retrieved from the soybase and phytozome database respectively (www.soybase.org, www.phytozome.org). ... 88 Chapitre III - Figure 4. Distribution of SNPs on the basis of their location in
respective predicted gene models in soybean genome. SNPs were categorised using gene structure information retrieved from phytozome
(www.phytozome.org). ... 89
Chapitre III - Figure 5. Phylogenetic tree showing genetic distance among a set of eight diverse soybean cultivars. The phylogenetic tree was constructed on the basis of 10,120 SNPs identified using the GBS approach. ... 90 Chapitre III - Figure 6. Impact of selective amplification on the number and depth of coverage of SNPs. (a) Schematic representation of an ApeKI restriction fragment flanked by suitable ligated adapters and the position of standard or selective primers, (b) Comparison of the number of SNPs and sequence read depth obtained with different sets of primers, and (c) number of SNPs and mean depth of coverage observed with selective amplification of ApeKI digested fragments with AC selective primers at different levels of multiplexing. ... 91 Chapitre III - Figure S1. Frequency distribution of SNPs identified in eight soybean cultivars using the GBS approach. Frequency was calculated for each 1 Mb bin on all 20 soybean chromosomes. ... 93 Chapitre III - Figure S2. SNP confirmed using re-sequencing of loci using Sanger
sequencing method. a) Agarose gel showing PCR amplification of SNP loci in different soybean cultivars. b) Sequence alignment showing SNP alleles in soybean cultivars. ... 94 Chapitre IV - Figure 1. Distribution of disease susceptibility among 130 soybean
lines. ... 130 Chapitre IV - Figure 2. Distribution of SNPs according to their minor allele
frequency (MAF). SNPs with MAF < 5% were excluded from the analysis. .. 131 Chapitre IV - Figure 3. Intrachromosomal LD decay over physical distance. (a)
Whole chromosome; (b) Telomeric regions; (c) Pericentromeric regions. .... 132 Chapitre IV - Figure 4. Plot of median r2 over physical distance. a) Pericentromeric
regions; b) Telomeric regions. ... 133 Chapitre IV - Figure 5. Cumulative distribution of p-values from genome-wide association tests using four statistical models. Cumulative p-values are equivalent to observed p-value under an expected model taking into account all background effects. ... 134 Chapitre IV - Figure 6. Genome-wide association scan for SSR resistance. The –
log10(P) values from the genome-wide scan are plotted against the SNP
positions on the physical map of each chromosome. The significance threshold (q = 0.1) is indicated by the horizontal line. ... 135
Chapitre IV - Figure 7. Lesion length among RIL classes contrasted for the SNP on Gm15 in two validation populations. ... 136 Chapitre IV - Figure 8. Predicted genes in the vicinity of the peak SNP at position
13,651,235 on Gm15. Genes involved in disease resistance are colored in yellow, other genes are colored in purple. ... 137 Chapitre IV - Figure 9. Heat map of r2 values between SNP markers located in an
interval containing SNP markers associated with Sclerotinia stem rot resistance (at q < 0.2) on Gm15. ... 138 Chapitre IV - Figure S1. Average r2 values over physical distance for the 20
soybean chromosomes. The arrows show the approximate extent of the pericentromeric region. ... 143 Chapitre IV - Figure S2. Projection of the 130 genotypes on the plane of the three
Liste des abréviations
ADN : Acide DésoxyriboNucléiqueAFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism BSA : Bulk Segregant Analysis
DL : Déséquilibre de Liaison GBS : Genotyping By Sequencing
HTS : Hautement Tolérant à la Sclerotinia OPA : Oligonucleotide Pool Assay
PDA : Potato Dextrose Agar
PCA : Principal Component Analysis PCR : Polymerase Chain Reaction QTL : Quantitative Trait Loci
RAD-seq : Restriction site Associated DNA sequencing RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA
RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism RGCQ : Réseau Grandes Cultures du Québec RRL : Reduced Representation Libraries
SLAF-seq : Specific-Locus Amplified Fragment sequencing SNP : Single Nucleotide Polymorphism
SSR : Sclerotinia Stem Rot
Remerciements
Merci à François d’avoir été pour moi une source d’inspiration, de support, et de motivation constante tout au long de mes études doctorales. Avec toi j’ai acquis une confiance accrue en mes moyens qui m’a permis d’atteindre de nouveaux sommets.
Merci à Martine pour ta patience d’ange et ta disponibilité. Tes judicieuses suggestions m’ont à maintes reprises aidé à aborder les problèmes d’un autre angle et à les résoudre.
Merci à Tung de m’avoir enseigné la rigueur dans la méthode scientifique. Ton souci du détail qui me semblait superflu lorsque je suis arrivé au laboratoire, j’ai fini par l’adopter. Tu as été mon modèle pour devenir un meilleur chercheur.
Merci à Denis et Martin pour votre assistance précieuse lors de l’exécution des essais en champ. Votre travail m’a permis d’avoir des données de qualité pour mes analyses.
Merci à mes parents Jocelyne et Richard, d’avoir été d’un soutien indéfectible au fil des ans, peu importe mes décisions. Votre accompagnement a contribué grandement à ma tranquillité d’esprit.
Merci à Marie-Catherine pour ton écoute et tes points de vue éclairés sur ce que je vivais. C’est grâce à toi que je suis resté zen lors de la fin de mon doctorat, particulièrement lors de l’interminable rédaction.
Merci à mon oncle Réjean et à ma tante Sylvie. Vous m’avez transmis votre passion pour l’agriculture.
Avant-propos
Ma thèse comporte cinq chapitres. Le premier chapitre est une revue bibliographique qui dresse le portrait des connaissances actuelles sur la sclérotiniose chez le soya, les méthodes d’inoculation de la maladie, les marqueurs moléculaires et les technologies de génotypage à haut débit, ainsi que les approches pour cartographier des locus de caractère quantitatif (« Quantitative Trait Loci », QTL) associés à des caractères d’intérêt. Les références bibliographiques sont citées à la fin de la thèse.
Les chapitres suivants sont présentés sous forme d’articles scientifiques. Le chapitre II, intitulé « A reproducible assay for measuring partial resistance to
Sclerotinia sclerotiorum in soybean », présente les travaux liés à l’atteinte du
premier objectif de ma thèse, c’est-à-dire développer une méthode d’inoculation fiable et reproductible de la sclérotiniose chez le soya utilisable en serre et au champ. Je suis le premier auteur d’une publication de ces résultats dans le journal « Canadian Journal of Plant Science ». J’ai participé à la réalisation de toutes les expériences présentées, et j’ai dirigé et analysé en totalité deux des volets (« mise au point de la méthode » et « comparaison avec la méthode de référence »). J’ai également rédigé l’article avec l’aide de mon directeur.
Le chapitre III, intitulé « An improved genotyping by sequencing (GBS) approach offering increased versatility and efficiency of SNP discovery and genotyping », rapporte l’adaptation d’une méthode de génotypage à haut débit chez le soya. Je suis le second auteur d’une publication de ces résultats dans le journal « PLoS One ». J’ai fourni du matériel expérimental dans le cadre de ces travaux et j’ai participé aux analyses génétiques visant à valider la qualité des marqueurs SNP obtenus via cette nouvelle approche. Finalement, j’ai participé à la rédaction de l’article à la phase de révision.
Le chapitre IV, intitulé « Genome wide association mapping of Sclerotinia
rapporte les résultats des travaux liés à l’atteinte du quatrième objectif de mon doctorat, à savoir d’identifier des QTL associés à une résistance accrue à la sclérotiniose. Je suis le premier auteur d’un manuscrit qui a été accepté dans le journal « The Plant Genome ». J’ai effectué la quasi-totalité des expériences et analyses qui y figurent et j’ai rédigé l’article.
Finalement le chapitre V est une discussion générale où les faits saillants de ce travail sont placés dans un contexte plus large et où des perspectives en vue de travaux futurs sont présentées.
Introduction générale
Le soya, Glycine max (L.) Merrill, fait partie de la famille des légumineuses. Cette plante est cultivée partout à travers le monde pour sa teneur en huile et en protéines, lesquelles varient autour de 18 et 40 %, respectivement (Beversdoff et al., 1995). En 2012, 239,5 millions de tonnes de soya ont été récoltées sur les cinq continents sur une superficie de 102,8 millions d’hectares (USDA, 2013). Au Québec, la culture du soya a débuté au cours des années 1980. En 1981 la superficie cultivée en soya était de seulement 1 400 hectares (CPVQ, 1990), mais elle a considérablement augmenté au cours des années, passant à 25 300 hectares en 1991 (BSQ, 1995), à 145 500 hectares en 2001 (ISQ et MAPAQ, 2004), et à 299 000 hectares en 2011 (ISQ et MAPAQ, 2013). C’est la deuxième culture en importance au Québec après le maïs-grain et devant l’avoine (ISQ et MAPAQ, 2013).
À chaque année, les agents pathogènes causent des millions de dollars de pertes dans la culture du soya. Une des maladies les plus néfastes dans nos régions est la sclérotiniose, ou pourriture à sclérotes, causée par le champignon Sclerotinia
sclerotiorum (Lib.) de Bary. Au Québec, la maladie a ravagé les champs de soya
de façon marquée pour la première fois en 1996, particulièrement en Montérégie où l’on a observé des pertes d’environ 12% (S. Rioux, communication personnelle). Suite à ces ravages, des efforts ont été déployés à différents niveaux pour combattre le champignon. À ce jour elle demeure la maladie la plus importante dans la culture du soya au Québec.
La lutte génétique à l’agent pathogène via le développement de cultivars résistants est une avenue prometteuse puisqu’elle est économique, respecte l’environnement et ne demande aucune modification à la régie de culture. Or, la sélection de lignées présentant une résistance accrue au sein d’un programme de sélection est tributaire d’une pression de maladie suffisante année après année. Comme cela n’est pas le cas en pratique, il est souvent difficile de faire une sélection efficace. Pour contourner le problème, de nombreux travaux faisant appel à des méthodes
d’inoculation ont été réalisés. Au Québec, la résistance est mesurée dans les essais officiels d’enregistrement avec une méthode qui reproduit fidèlement l’infection naturelle mais dont le succès de l’inoculation varie fortement selon conditions environnementales. D’autres méthodes utilisables en conditions contrôlées donnent des résultats faiblement corrélés avec la résistance observée au champ (Nelson et al., 1991b; Wegulo et al., 1998; Guo et al., 2008). De plus, ces méthodes sont souvent peu adaptées pour une utilisation à grande échelle au champ. Le développement d’une méthode fiable et reproductible, utilisable tant en serre qu’au champ, pour évaluer le degré de résistance à la sclérotiniose, faciliterait grandement les progrès en sélection.
Dans une perspective plus large, il serait opportun de délaisser les inoculations de matériel végétal pour faire une sélection via des marqueurs génétiques liés aux gènes d’intérêt. Or, depuis quelques années l’état des connaissances en génétique a fait un bon prodigieux grâce au développement des outils de la biologie moléculaire. Par exemple, le séquençage du génome du soya a été complété en 2010 (Schmutz et al., 2010). Aussi, des plates-formes permettant de génotyper le soya à des milliers de marqueurs simultanément sont désormais disponibles (Hyten et al., 2008; Varala et al., 2011; Song et al., 2013; Sun et al., 2013).
Concrètement cela amène deux conséquences majeures. D’une part, on peut désormais obtenir en quelques jours et à coût abordable l’information qui aurait pris plusieurs années à générer au tournant du siècle. Cela se traduit par une démocratisation de l’utilisation des outils de la biologie moléculaire qui auparavant étaient un luxe que seules les très grandes entreprises pouvaient se payer. En contrepartie toutefois, la masse d’information à traiter représente un défit de taille pour les scientifiques. De plus, il faut utiliser des méthodes statistiques novatrices pour trouver un lien entre la séquence d’un gène parmi des milliers et un caractère d’intérêt. C’est ici que se situe mon projet de doctorat.
Chapitre I
Revue bibliographique
1.1 La sclérotiniose
1.1.1 Taxonomie
Le genre Sclerotinia appartient à l’ordre des Heliotiales et la famille des
Sclerotiniaceae, famille à laquelle appartiennent également les genres Botryotinia, Monilinia et Myriosclerotinia (Cannon et Kirk, 2007). On a attribué plus de 250
espèces au genre Sclerotinia à travers les années, mais seules trois espèces sont unanimement reconnues : S. minor Jagger, S. trifoliorum Eriks, et S. sclerotiorum (Lib.) de Bary (Bolton et al., 2006).
1.1.2 Agent pathogène
L’agent pathogène de la sclérotiniose chez le soya est le Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary. Ce champignon nécrotrophe est la cause d’un large éventail de maladies chez plusieurs espèces. En effet, Boland et Hall (1994) ont recensé 408 espèces chez 75 familles qui sont vulnérables à cet agent pathogène. Ces espèces sont presque exclusivement des angiospermes, principalement des dicotylédones. En plus du soya, le tournesol, le canola, le haricot, le pois chiche, l’arachide, le pois sec, la lentille et l’oignon sont des espèces d’importance commerciale qui sont sensibles au S. sclerotiorum.
Le génome de S. sclerotiorum a été séquencé (Amselem et al., 2011). D’une longueur de 39,6 Mb, il comporte un total de 11 860 gènes prédits répartis sur 16 chromosomes. Parmi ceux-ci on retrouve de nombreux gènes impliqués dans la dégradation des parois cellulaires des plantes et de la production d’acide oxalique.
1.1.3 Importance de la maladie en Amérique du Nord
Il n’y a pas de statistiques relatives aux pertes causées par la sclérotiniose au Canada. Aux États-Unis, la maladie est observée essentiellement dans les états les plus nordiques (Wrather et al., 2001). De 1996 à 2009 elle figurait parmi les dix principaux ravageurs du soya lors de huit saisons sur quatorze, et elle s’est placée au deuxième rang en 2004 et 2009 (Wrather et Koenning, 2009; Koenning et Wrather, 2010). En moyenne, on estime les pertes causées par le champignon
dans le pays à plus de 200 millions de dollars par année, toutes espèces confondues (Bolton et al., 2006).
1.1.4 Symptomatologie
L’infection de la plante par l’agent pathogène peut se faire via du mycélium ou, le plus souvent, via des ascospores (Abawi et Grogan, 1975; Boland et Hall, 1988; Cline et Jacobsen, 1983; Grau et al., 1982). Celles-ci utilisent les pétales sénescents de la plante comme source d’énergie pour initier l’infection (Grau et Hartmann, 1999; Heran et al., 1999). L’entrée du champignon via les stomates et les cellules de l’épiderme a également été observée (de Silva et al., 2009).
Chapitre I - Figure 1. Symptômes de la sclérotiniose. a) Plante entière; b) Vue rapprochée de la tige attaquée avec des sclérotes à la surface.
Là où le champignon fait son entrée, le pétiole et la tige montrent une décoloration gris-verdâtre, qui éventuellement devient beige. Le champignon progresse dans la tige vers le haut et vers le bas de la plante. Lorsque les lésions entourent complètement la tige, le transport de l’eau, des minéraux et des produits de la
photosynthèse est perturbé. Conséquemment, le développement et le remplissage des gousses s’en trouvent réduits (Grau et al., 1982; Grau et Hartmann, 1999). À maturité, les gousses sont mal développées et les plantes sont blanches ou décolorées (Figure 1). De gros sclérotes de forme irrégulière, partiellement couverts d’un mycélium blanc et dense, sont présents à la surface et à l’intérieur de la tige (Grau et al., 1982; Grau et Hartmann, 1999). Si l’infection a lieu tôt, les graines ont une forme aplatie et ratatinée et peuvent même être remplacées par des sclérotes (Grau et Hartmann, 1999).
1.1.5 Épidémiologie
Les sclérotes, les structures de conservation du champignon, sont dispersés lors de la récolte et les labours (Figure 2). Ils peuvent demeurer dans le sol durant de longues périodes et conserver leur pouvoir germinatif (Ben-Yephet et al., 1993; Briard et al., 1997). Avant de produire des apothécies, les sclérotes doivent être conditionnés en demeurant sous des conditions fraîches et humides durant un certain temps (Abawi et Grogan, 1975; Ferraz et al., 1999). Seuls les sclérotes situés à moins de 5 cm, voire 2 cm, de la surface du sol peuvent développer des stipes qui atteindront la surface et formeront des apothécies (Abawi et Grogan, 1979; Grau et Hartmann, 1999; Mitchell et Wheeler, 1990). La production d’apothécies se fait entre 10 et 25°C, avec une température optimale de 10°C (Abawi et Grogan, 1975). Des fluctuations de température quotidienne de 8°C seraient optimales (Mila et Yang, 2008). Au champ, la production d’apothécies peut débuter à la fermeture du couvert végétal. Cette fermeture occasionne de longues périodes d’humidité élevée, une situation nécessaire à la germination des sclérotes et à l’apparition des apothécies. (Grau et Hartmann, 1999; Mila et Yang, 2008). Au Québec, la production d’apothécies débute à la fin du mois de juillet, environ quatre semaines après la fermeture du couvert végétal. À ce moment la floraison du soya est déjà avancée. La production d’apothécies se poursuit jusqu’à la fin octobre (S. Rioux, communication personnelle).
Chapitre I - Figure 2. Cycle évolutif de la sclérotiniose. Adapté de Jeffrey Rollins (2007). http://www.sclerotia.org/lifecycle/
Les apothécies produisent des ascospores qui sont libérées de façon continue lorsque le taux d’humidité varie entre 65 et 95% (Clarkson et al., 2003). Leur germination sur les pétales sénescents n’est pas tellement affectée par la température, mais 25°C est optimal pour la croissance du tube germinatif (Abawi et Grogan, 1975). Le début de l’infection ainsi que l’apparition de nouvelles lésions sont associés avec la colonisation des fleurs par l’agent pathogène et à des périodes prolongées d’humidité saturante à la surface de la plante (Boland et Hall, 1988; Grau et Hartmann, 1999). La température optimale pour la croissance du mycélium se situe entre 20 et 25°C.
1.1.6 Mécanismes moléculaires de l’infection
Le champignon réprime les mécanismes de défense des plantes durant l’infection (Veluchamy et al., 2012), notamment en perturbant les sentiers de l’acide jasmonique et de l’éthylène durant les premiers stades de l’infection (Zhu et al., 2013) et en détoxifiant les phytoalexines des plantes via la glucosylation (Sexton et al., 2009). Ce champ d’étude fait l’objet de plusieurs travaux qui révèlent progressivement la nature complexe du processus d’infection impliquant de nombreux gènes (Amselem et al., 2011).
Acide oxalique
L’acide oxalique stimule l’activité des polygalacturonases pour favoriser la dégradation de la paroi cellulaire (Rollins et Dickman, 2001; Cotton et al., 2003), inhibe les phytoalexines (Favaron et al., 2004), supprime le burst oxidatif (Cessna et al., 2000), facilite l’entrée de l’agent pathogène via les pores des stomates (Guimaraes et Stotz, 2004), module la signalisation du pH (Rollins et Dickman, 2001), induit la mort cellulaire programmée (Kim et al., 2008) et altère l’environnement oxydoréducteur dans la plante (Williams et al., 2011). Des plants de soya transgéniques porteurs d’un gène codant pour une oxydase ou une décarboxylase capable de dégrader l’acide oxalique ont présenté une résistance accrue au champignon (Cunha et al., 2010; Donaldson et al., 2001). Similairement, des mutants de S. sclerotiorum incapables de produire de l’acide oxalique sont reconnus par la plante et entrainent une réponse hypersensible et la résistance (Williams et al., 2011).
Certains rôles de l’acide oxalique peuvent sembler antagonistes a priori. Lors de l’initiation de l’infection, l’acide oxalique empêche le burst oxidatif, ce qui implique le relâchement de radicaux oxygénés libres (« reactive oxygen species »). Par la suite, le composé déclenche la production de radicaux oxygénés libres chez l’hôte qui induisent la mort cellulaire programmée (Kim et al., 2008). L’acide oxalique se trouve donc à la fois à stimuler et réprimer la production de radicaux oxygénés
libres lors d’une interaction compatible. Il semblerait qu’initialement le S.
sclerotiorum génère un environnement réducteur chez les cellules de l’hôte qui
supprime ses défenses, incluant le burst oxidatif et la déposition de callose. Ensuite, lorsque l’infection est établie, le champignon nécrotrophe induit la production des radicaux oxygénés libres par la plante qui entrainent la mort cellulaire programmée, ce qui favorise sa croissance (Williams et al., 2011).
Dégradation des parois cellulaires
Le génome de S. sclerotiorum contient 118 gènes prédits codant pour des protéines associées à la dégradation des parois cellulaires (Amselem et al., 2011) dont au moins une endopolygalacturonase impliquée dans la mort cellulaire programmée (Zuppini et al., 2005). Une analyse transcriptomique a identifié 40 gènes surexprimés par le champignon lors de l’infection de cotylédons de tournesol. Parmi ceux-ci certains étaient impliqués dans la dégradation de la cellulose (6), du xylane (8), de la pectine (11) et du mannane (2). Six endopolygalacturonases qui attaquent la pectine ont été étudiées plus en profondeur (de Lorenzo et al., 2001). Lors de l’infection, leur expression est modulée séquentiellement en fonction de l’acidification du milieu ambiant par le champignon qui crée un gradient de pH (Cotton et al., 2003). Les transcrits de trois polygalacturonases sont localisés à la zone de colonisation des tissus sains, ceux d’un autre sont retrouvés dans les tissus macérés, et ceux des deux derniers gènes sont détectés de façon plus constante (Cotton et al., 2003; Kasza et al., 2004).
1.2 Méthodes de lutte
Plusieurs travaux ont été faits pour mettre au point des moyens de lutte permettant de réduire les pertes causées par la sclérotiniose. Présentement, on combat le champignon avec des pratiques culturales appropriées, la lutte chimique, la lutte biologique et le développement de cultivars résistants.
1.2.1 Pratiques culturales
Aucune pratique culturale ne peut éliminer à elle seule la sclérotiniose d’un champ (Rousseau et al., 2007); c’est en les combinant qu’on peut réduire la banque de sclérotes au fil des ans. L’incidence de la sclérotiniose peut être aggravée par toute pratique culturale qui favorise des températures modérées ou un degré d’humidité élevé sous le feuillage (Ferraz et al., 1999). La fermeture du couvert végétal influence grandement ces deux paramètres. Lorsque les rangs sont rapprochés elle survient plus tôt, ce qui augmente le degré d’humidité sous le couvert, abaisse la température et favorise l’apparition des apothécies (Boland et Hall, 1988; Grau et Hartmann, 1999; Kurle et al., 2001). Il est donc important de favoriser un écartement plus large afin de réduire le degré d’humidité (Grau et Radke, 1984; Mila et Yang, 2008). Un mauvais désherbage dans les champs crée également un couvert végétal plus dense et les mauvaises herbes peuvent elles-mêmes être atteintes par le S. sclerotiorum, deux facteurs qui favorisent la formation des sclérotes (Maheu, 1999). L’application de fumier liquide ou de compost urbain augmente la gravité de la maladie (Mila et al., 2003). Cet effet serait indirect puisque le fumier encourage une croissance vigoureuse qui crée des conditions environnementales propices au développement de la maladie.
La date de semis est également un facteur à considérer. Les cultivars qui fleurissent avant la libération des ascospores, soit parce qu’ils sont hâtifs ou parce qu’ils ont été semés tôt, ne sont pas infectés (Kim et Diers, 2000; Hoffman et al., 2002). Finalement, une rotation des cultures est recommandée car, en présence d’espèces non-hôtes (comme les céréales), il y aura germination d’une portion des sclérotes présents dans le sol, réduisant d’autant le nombre de sclérotes pouvant fructifier l’année suivante (Gracia-Garza et al., 2002; Kurle et al., 2001; Müeller et al., 2002b; Rousseau et al., 2007).
1.2.2 Lutte chimique
Certaines études rapportent avoir obtenu une bonne répression de la sclérotiniose avec des fongicides (Jones, 1974; Mueller et al., 2004) ou des herbicides (Dann et al., 1999) alors que d’autres rapportent le contraire (Mila et al., 2003). L’efficacité
varie considérablement en fonction de l’intensité de la maladie au champ et de la sensibilité des cultivars employés (Mueller et al., 2002a; 2004). Elle pourrait être due à l’induction de mécanismes de résistance chez la plante et serait plus prononcée chez les cultivars sensibles lorsque la pression de la maladie est forte (Dann et al., 1999).
Au Canada, le seul fongicide chimique homologué par l’Agence de Réglementation de la Lutte Antiparasitaire dans la culture du soya est l’Acapela™ de la compagnie DuPont®. Il est à noter que l’étiquette du fongicide précise qu’une répression et non une suppression est obtenue avec ce produit (DuPont, 2012). Toutefois, bien que la lutte chimique puisse offrir de bons résultats dans certaines circonstances, on y fait peu appel dans les grandes cultures en raison des coûts élevés; l’augmentation du rendement apportée par le traitement pouvant ne pas justifier les dépenses encourues (Tu, 1989; del Rio et al., 2007).
1.2.3 Lutte biologique
Il existe plusieurs organismes vivant à la surface des sclérotes qui peuvent être utiles dans la lutte biologique contre la sclérotiniose chez le soya. Des travaux rapportent des résultats de répression biologique encourageants à l’aide du
Sporidesmium sclerotivorum, Trichoderma harzianum, Bacillus amyloliquefaciens, Streptomyces lydicus, Bacillus subtilis, Epicoccum purpurascens et Ulocladium atrum (Abdullah et al., 2008; del Rio et al., 2002; Gerlagh et al., 1998; Huang et al.,
2000; Li et al., 2003; Zeng et al., 2012b; Zhang et Xue, 2010). Toutefois, l’organisme qui a démontré le meilleur potentiel pour la répression de la sclérotiniose et a fait l’objet du plus grand nombre de travaux est le Coniothyrium
minitans (Huang et al., 2000; Huang et Erickson, 2008). Un travail récent a
comparé l’efficacité de la lutte biologique par différents produits commerciaux dans la culture du soya (Zeng et al., 2012a). Les produits utilisés étaient Contans®WG (C. minitans), Actinovate®AG (S. lydicus), PlantShield®HC (T. harzianum), et Serenade® MAX (B. subtilis). Parmi ceux-ci, Serenade® et Contans® sont homologués dans la culture du soya au Canada (Duval et al., 2012). Le Serenade®MAX (B. subtilis) n’a eu presque aucun effet sur le champignon alors
que le Contans®WG (C. minitans) a donné la meilleure répression, réduisant l’indice de gravité de la maladie et le nombre de sclérotes au champ de 68,5 et 95,3%, respectivement. Similairement, les réductions obtenues étaient de 43,1 et 90,6% pour Actinovate®AG (S. lydicus), et de 38,5 et 70,8% pour PlantShield®HC (T. harzianum). Bien que ces résultats semblent prometteurs, l’avantage économique de l’utilisation d’agents de lutte biologique chez le soya reste à démontrer.
1.3 Résistance à la sclérotiniose chez le soya
L’utilisation de cultivars modérément résistants est le moyen le plus efficace pour contrer la sclérotiniose chez le soya (Kurle et al., 2001). Il n’y a pas de résistance complète à la sclérotiniose (Vuong et al., 2008), mais du matériel partiellement résistant a été identifié (Kim et al., 2000; Hoffman et al., 2002; Rousseau et al., 2004; Chen et Wang, 2005). Il est donc possible d’améliorer la résistance du soya à la sclérotiniose dans le cadre de programmes d’amélioration génétique.
1.3.1 Évitement (résistance apparente)
Des mécanismes d’évitement tels que la taille, la verse, la date de floraison, la date de maturité et le port de la plante peuvent avoir un impact sur le développement de la maladie. On a rapporté des corrélations entre chacun de ces facteurs et l’incidence de la maladie (Boland et Hall, 1987; Hoffman et al., 2002; Kim et al., 1999; 2000; Rousseau et al., 2004; Schwartz et Steadman, 1978). Les plantes plus hautes ont davantage tendance à verser, ce qui crée un environnement favorable au développement du champignon (Boland et al., 1987). Les cultivars hâtifs peuvent échapper à la maladie en raison de leur petite taille et du fait qu’ils fleurissent alors que les apothécies n’ont pas encore commencé à libérer des ascospores (Kim et Diers, 2000; Hoffman et al., 2002). Les génotypes à port arbustif offrent un meilleur couvert végétal et emprisonnent plus l’humidité et la fraîcheur, favorisant ainsi la maladie (Blad et al., 1978; Grau et Hartmann, 1999; Hoffman et al., 2002). On observe un effet semblable lorsque l’écartement des rangs est réduit (Grau et Radke, 1984; Kurle et al., 2001). On note néanmoins que
des génotypes peuvent avoir une architecture favorisant la maladie tout en étant assez résistants (Grau et al., 1982; Kim et al., 1999).
1.3.2 Résistance vraie
Des lésions brun-rougeâtre sont souvent associées à la résistance du soya à la sclérotiniose (Figure 3). Chez les plantes qui présentent une telle réaction, le développement du champignon est ralenti ou arrêté (Boland et Hall, 1986; Calla et al., 2009; Donaldson et al., 2001). Des réponses ressemblant à de l’hypersensibilité du soya au S. sclerotiorum ont été rapportées, le plus souvent chez les cultivars les plus résistants aux points d’infection (Boland et Hall, 1986).
La résistance à la sclérotiniose est un caractère quantitatif déterminé par de nombreux gènes (Arahana et al., 2001; Valdès-Lopez et al., 2011; Vuong et al., 2008). Un travail d’intérêt faisant appel à des puces à ADN a comparé les profils d’expression des gènes huit et quatorze heures après l’inoculation de tiges de soya avec S. sclerotiorum (Calla et al., 2009). Les deux variétés utilisées étaient Williams 82, un cultivar sensible au champignon dont le génome a été séquencé, et 741-1, une lignée hâtive suédoise partiellement résistante au champignon. L’expression de 1270 gènes était significativement différente entre les deux moments post-inoculation, alors que l’expression de 105 gènes variait entre les deux variétés. On a observé une augmentation de l’abondance des extensines, des protéines de la paroi cellulaire dont le rôle dans la pathogénèse n’est pas clair, une augmentation de la synthèse de l’éthylène, et un ralentissement du sentier de signalisation de l’inositol. La production de certains métabolites secondaires, notamment les isoflavonoïdes et les anthocyanes, a également augmenté. Des gènes associés à la production d’anthocyanes étaient deux fois plus exprimés chez la variété résistante que chez la variété sensible. Des résultats semblables à ce travail ont été obtenus dans deux autres études de l’infection du canola par le
Chapitre I - Figure 3. Réaction de résistance suite à l’inoculation d’un plant de soya avec le S. sclerotiorum.
1.3.3 Études de la génétique de la résistance
Huit études rapportent avoir identifié des QTL pour la résistance à la sclérotiniose sur 19 des 20 chromosomes du soya (Arahana et al., 2001; Guo et al., 2008; Han et al., 2008; Huynh et al., 2010; Kim et Diers, 2000; Li et al., 2010a et Sebastian et al., 2010; Vuong et al., 2008). À une exception, la cartographie des QTL était effectuée en caractérisant, avec différentes méthodes d’inoculation, le degré de sensibilité d’une population de lignées recombinantes issues du croisement entre un parent sensible et un parent résistant. L’exception est le travail de Sébastian et al. (2010) où certains QTL furent détectés avec des analyses d’association au sein d’une collection de lignées élites représentant le germoplasme américain. Parmi les problèmes associés à ces études on note la détection de QTL associés à des mécanismes d’évitement (Kim et Diers, 2000) et l’emploi de seuils de signification peu sévères qui ouvrent la porte à la détection de faux positifs (Arahana et al., 2001; Guo et al., 2008). Aussi, le faible nombre (< 150) de marqueurs généralement utilisés se traduit par des intervalles significatifs s’étendant sur de
longues distances physiques, ce qui limite leur utilisation en amélioration génétique. Finalement il s’est avéré difficile de détecter les mêmes QTL dans différents essais menés avec la même méthode. En revanche, le travail le plus reproductible a identifié trois QTL sur les chromosomes 6 et 20 dans trois ou quatre (selon le QTL) essais au champ (Huynh et al., 2010). Des inoculations supplémentaires réalisées dans quatre expériences en serre et au champ ont confirmé l’impact de ces QTL candidats. La méthode d’inoculation utilisée dans ce travail fait l’objet du premier chapitre de cette thèse.
Bien que les résultats de ces travaux rencontrent certaines limites, ils ont mis en évidence la complexité de la résistance à la sclérotiniose chez le soya et l’avantage des marqueurs d’ADN dans l’étude génétique des caractères quantitatifs. Étant donné que plusieurs QTL sont impliqués dans cette résistance et que la capacité d’identifier ceux-ci varie selon les croisements et la méthode d’évaluation, d’autres travaux utilisant différents matériels génétiques et différentes méthodologies sont nécessaires. Ils permettraient non seulement de confirmer les résultats antérieurs, mais probablement aussi de détecter des QTL supplémentaires. Toutefois, quels que soient les techniques moléculaires et les marqueurs d’ADN que l’on utilise, l’identification de gènes d’intérêt n’est possible que si l’on peut obtenir des données phénotypiques de qualité. Pour la résistance à la sclérotiniose, il faut faire appel à des inoculations artificielles pour y parvenir.
1.4 Méthodes d’évaluation de la résistance
Les évaluations du degré de résistance à la sclérotiniose au champ sont habituellement réalisées en faisant des essais dans des parcelles infestées naturellement. Dans certains travaux, on ajoute de l’inoculum d’appoint sous la forme de sclérotes (Cober et al., 2003; Kim et al., 2000; Rousseau et al., 2004) ou de grains de céréales infectés avec du mycélium de S. sclerotiorum (Danielson et al., 2004; McLaren et Craven, 2008) afin d’augmenter la pression de maladie. Au Québec la méthode de référence utilisée dans les essais officiels d’enregistrement de variétés repose sur une infestation avec des sclérotes produits en laboratoire.
Toutefois, étant donné que la sclérotiniose se manifeste sporadiquement, de la variation spatiale et environnementale peut exister dans le site d’essai. De plus, les conditions climatiques influencent directement la germination carpogénique (apothécies), l’infection et la pression de maladie qui varie considérablement d’une année à l’autre. Afin de contourner ce problème, un nombre impressionnant de méthodes d’inoculation mesurant la résistance du soya à la sclérotiniose au champ ou en serre ont été mises au point. On peut les diviser en trois groupes: i) inoculation de la plante entière; ii) inoculation de parties de plantes coupées; et iii) mesures indirectes (Auclair et al., 2004). Les méthodes varient également selon le type d’inoculum utilisé: sclérotes, ascospores ou mycélium.
1.4.1 Inoculation de la plante entière
Cotylédons
Grau et Bissonnette (1974) ont inoculé des petites blessures faites sur les cotylédons de plantules de soya avec du mycélium et ont été parmi les premiers à trouver de la résistance génétique à la maladie. Kim et collaborateurs (2000) ont inoculé des cotylédons en insérant un grain d’avoine colonisé par le champignon à l’intérieur de petits trous et en y déposant un morceau de mycélium poussant sur milieu gélosé d’extrait de pomme de terre (Potato Dextrose Agar, ou PDA). Les résultats obtenus avec ces deux méthodes étaient modérément corrélés avec ceux obtenus au champ sous infestation naturelle et artificielle avec des sclérotes.
Feuilles
Chen et Wang (2005) ont pulvérisé une suspension de champignon broyé sur des plants. En serre, cette méthode a permis de départager la réaction de variétés reconnues sensibles ou résistantes; on ignore cependant si elle est reproductible ou si elle peut être utilisée au champ.
Fleurs
Plusieurs méthodes ont cherché à inoculer des plantes en fleurs en pulvérisant une suspension d’ascospores (Cline et Jacobsen, 1983; Rousseau et al., 2004), de mycélium (Wegulo et al., 2008), ou en insérant de petits morceaux de mycélium en croissance sur milieu PDA (Rousseau et al., 2004). Les résultats étaient très
variables, allant de aucune différence de sensibilité entre les cultivars à l’absence de corrélation avec les résultats obtenus au champ.
Tiges
Auclair et collaborateurs (2004) ont développé une méthode au champ qui fait appel à des grains d’orge infectés que l’on insère dans des blessures créées sur des tiges. Les résultats obtenus lors de deux années d’essais étaient faiblement corrélés entre eux (r= 0,21). Selon l’essai, la corrélation entre ces résultats et ceux obtenus en utilisant un indice de gravité au champ sous infection naturelle était faible, nulle, ou négative. Une autre méthode utilisée en serre consiste à déposer une suspension de mycélium broyé à l’extrémité de la tige principale (Chen et Wang, 2005). Cette méthode départageait la réaction des variétés sensibles et résistantes en conditions contrôlées mais aucune information n’a été présentée pour démontrer sa reproductibilité.
Pétioles
La méthode mise au point par Hoffman et collaborateurs (2002) consiste à insérer un morceau de paille pour boire, contenant du champignon en croissance sur milieu PDA, sur un pétiole coupé à 2,5 cm de la tige, de façon à mettre l’inoculum en contact avec la blessure. Avec cette méthode, les auteurs ont eu de la difficulté à départager la réaction de la plupart de leurs traitements témoins, mais ils ont tout de même obtenu des corrélations significatives avec les résultats au champ sous infestation naturelle.
« Limited-term inoculation »
Cline et Jacobsen (1983) ainsi que Boland et Hall (1986) ont trouvé qu’une technique d’inoculation dite «limitée» (‘Limited-Term Inoculation’) permettait de détecter des différences significatives du degré de sensibilité des génotypes à la maladie. On place un morceau de milieu de culture (PDA, carotte, céleri, haricot) colonisé par le mycélium à l’endroit souhaité et on peut le recouvrir avec du coton humide afin de maintenir un haut degré d’humidité. Les plantes sont incubées pendant 24 à 144 heures dans des conditions humides, puis le morceau de coton et l’inoculum sont enlevés. On évalue la progression de la maladie à divers
moments avec un indice de gravité (Cline et Jacobsen, 1983; Boland et Hall, 1986). Bien que cette méthode ait permis à Boland et Hall (1986) de trouver des différences significatives de la résistance entre les cultivars, ils n’ont pas trouvé de corrélation entre leurs résultats et ceux obtenus sous inoculation naturelle au champ (Boland et Hall, 1987).
Lors de ma maîtrise, j’ai développé une méthode d’inoculation limitée qui consistait à déposer un morceau de mycélium en croissance sur milieu PDA sur une blessure créée par l’ablation d’un bouquet floral (Bastien, 2004). On mesurait la longueur de la lésion sur la tige deux, quatre et six jours après inoculation. Cette méthode permettait de détecter de façon reproductible des différences significatives de la longueur des lésions entre les cultivars en serre et au champ. Malheureusement elle prenait trop de temps, un handicap pour son utilisation à grande échelle.
1.4.2 Inoculation de parties de plantes coupées
Tiges
Wegulo et collaborateurs (1998) ont inséré des morceaux de carotte colonisés par le champignon dans des blessures de 2 mm de diamètre créées dans des tiges de soya. La longueur de la lésion sur la tige était mesurée après cinq jours d’incubation dans des chambres d’humidité. Les résultats n’étaient pas corrélés avec ceux obtenus au champ. Chun et collaborateurs (1987) ont mesuré la longueur de la lésion cinq à sept jours après inoculation de tiges coupées avec des rondelles de mycélium de S. sclerotiorum en croissance sur de l’agar. Les résultats étaient plus ou moins corrélées avec ceux obtenus dans des champs infestés de sclérotes. Dans un autre travail faisant appel à cette méthode, des différences significatives de la longueur des lésions furent observées entre les cultivars, mais les réactions variaient selon l’essai. De plus, il n’y avait pas de corrélation entre ces résultats et ceux d’essais effectués dans des champs infestés artificiellement avec des sclérotes du S. sclerotiorum (Nelson et al., 1991a).
Feuilles
Cline et Jacobsen (1983) n’ont pas trouvé de différences significatives entre des cultivars de soya inoculés en déposant des morceaux de carotte colonisés par le champignon sur les feuilles. Un autre travail a trouvé une corrélation significative entre la surface de la lésion mesurée 48 heures après l’inoculation de feuilles excisées avec du mycélium poussant sur milieu PDA et les niveaux de maladie au champ sous infestation naturelle et artificielle avec des sclérotes (Kim et al., 2000). Hoffman et collaborateurs (2002) ont utilisé la même méthode et ont eu des résultats corrélés avec ceux obtenus dans des champs infestés naturellement seulement une fois sur cinq. Wegulo et collaborateurs (1998) ont utilisé une méthode similaire à celle de Kim et collaborateurs (2000), mais ils ont créé une blessure sur la feuille avant d’y déposer l’inoculum. Le résultat des classements a varié beaucoup entre les essais, mais les auteurs estimèrent tout de même que la méthode était bonne car les cultivars reconnus sensibles ou résistants se sont comportés tel quel dans la majorité des essais.
1.4.3 Méthodes indirectes
Wegulo et collaborateurs (1998) ont comparé cinq méthodes d’inoculation de la sclérotiniose dont deux faisaient appel à l’acide oxalique. La première méthode consiste à tremper des tiges de soya dans une solution d’acide oxalique. La longueur de la tige blanchie par la substance est mesurée après 4 jours. L’autre méthode plonge également des tiges de soya dans de l’acide oxalique. Un pigment rougeâtre est émis par la tige, se dissout dans la solution, puis est mesuré par absorbance avec un spectrophotomètre 48 heures après l’inoculation. Les auteurs ont conclu que ces deux méthodes étaient supérieures aux autres testées car elles avaient les meilleures reproductibilités et corrélations avec les résultats d’essais dans des champs artificiellement infestés avec des sclérotes. La mesure de pigments solubles a par la suite été utilisée dans un travail de cartographie QTL (Li et al., 2010a).
Globalement, les résultats obtenus avec ces diverses méthodes ont des degrés de concordance variables avec l’intensité de la maladie au champ (Chun et al., 1987;
Hoffman et al., 2002; Kim et al., 1999; 2000; Nelson et al., 1991a). Dans certains travaux les méthodes d’inoculation elles-mêmes ne sont pas stables car la réponse des variétés varie d’une expérience à l’autre (Guo et al., 2008; Kim et al., 1999; 2000; Nelson et al., 1991a; Wegulo et al., 1998). Le problème est tel que deux programmes d’amélioration génétique publics ontariens ont cessé de mettre des efforts dans l’évaluation de leur matériel pour la résistance à la sclérotiniose au moyen de méthodes d’inoculation artificielle (E. Cober, communication personnelle; I. Rajcan, communication personnelle). À ce jour, aucune méthode d’inoculation de la sclérotiniose ne fait l’unanimité au sein de la communauté scientifique. Il serait souhaitable de mettre au point une nouvelle méthode rapide et reproductible pour évaluer le degré de résistance du soya à la sclérotiniose.
1.5 Marqueurs génétiques
Dans une perspective plus large, l’identification de marqueurs moléculaires associés à des gènes de résistance permettrait de s’affranchir de l’obligation d’avoir recours à des méthodes d’inoculation pour caractériser la résistance du soya à la sclérotiniose. Cet avantage serait particulièrement marqué au sein des programmes d’amélioration génétique où l’on teste de nombreuses lignées pour identifier les plus prometteuses. La convergence du développement de plates-formes de génotypage à haut débit et de nouvelles méthodes d’analyses statistiques permet d’envisager l’identification de tels marqueurs.
1.5.1 Différents types de marqueurs d’ADN
Les marqueurs d’ADN sont ceux dont le polymorphisme révélé est lié directement au changement de séquence de l’ADN. D’un point de vue des caractéristiques alléliques et de la spécificité des marqueurs, on peut les classer en (i) marqueurs codominants et spécifiques du locus qui sont révélés individuellement comme les marqueurs RFLP (« Restriction Fragment Length Polymorphism ») (Tanksley et al., 1989), les microsatellites (« Single Sequence Repeat ») (Kumar, 1999), et les marqueurs de polymorphisme mononucléotidique («Single Nucleotide Polymorphism», SNP) (Rafalski, 2002) et (ii) marqueurs dominants et
non-spécifiques de locus qui sont révélés en masse et développés en utilisant la réaction en chaîne par polymérase («Polymerase Chain Reaction», PCR) comme les marqueurs RAPD (« Random Amplified Polymorphic DNA ») (Williams et al., 1990) et AFLP (« Amplified Fragment Length Polymorphism ») (Vos et al., 1995). Les marqueurs microsatellites et SNP sont les plus utilisés dans la cartographie et l’analyse de QTL chez les plantes. Les marqueurs RFLP, RAPD et AFLP ont cessé d’être utilisés avec le développement des marqueurs microsatellites et SNP au cours de la dernière décennie et ne seront pas discutés ici.
1.5.2 Marqueurs microsatellites
Les microsatellites sont de courtes séquences répétées d’ADN de 1 à 6 paires de bases qui sont présentes en différents nombres de copies. Par conséquent, la variation en longueur des séquences de microsatellites représente le polymorphisme détecté. Les microsatellites ont plusieurs caractéristiques qui leur conféraient un avantage indéniable en tant que marqueurs de sélection. Ils sont amplifiés par PCR, occupent un locus unique, sont codominants et ont une propension au multiallélisme. Un travail a identifié 210 990 répétitions de di-, tri- et tétranucléotides comme candidates potentielles pour le développement de marqueurs microsatellites dans le génome du soya. Cet effort a mené à la création d’une banque de données qui compile la position génomique et la séquence d’amorces flanquant 33 065 marqueurs microsatellites (Song et al., 2010). Les marqueurs microsatellites ont été utilisés entre autres pour l’identification de QTL (Li et al., 2008; 2011; Rouf Mian et al., 2008; Silva et al., 2008; Zuo et al., 2013), la caractérisation de la diversité génétique (Fu et al., 2007; Lee et al., 2011; Li et al., 2008; Tavaud-Pirra et al., 2009; Wang et al., 2008b) et la construction de cartes génétiques (Cregan et al., 1999; Hwang et al., 2009; Song et al., 2004).
1.5.3 Marqueurs SNP
Depuis la fin des années 2000, les marqueurs SNP (« Single Nucleotide Polymorphism ») commencent à prendre la place des marqueurs microsatellites pour la recherche génétique chez le soya. Les marqueurs SNP ont trois avantages principaux sur les marqueurs microsatellites: c’est la forme de variation plus
importante dans le génome, ils coûtent moins cher que les marqueurs microsatellites, et une vaste gamme de technologies pour leur analyse à haut débit existe sur le marché (Zhu et al., 2008). Le «Universal Soy Linkage Panel 1.0» (USLP 1.0), une sorte de puce à ADN qui permet d’interroger 1 536 marqueurs SNP répartis également sur le génome, a été mis au point par le United States Department of Agriculture (USDA) et peut être exploité sur la plate-forme Golden Gate d’Illumina (Hyten et al., 2008). On peut ainsi obtenir la séquence de 192 individus à ces marqueurs en trois jours, ce qui représente un gain de temps énorme par rapport au génotypage de marqueurs microsatellites. Cette plate-forme a été utilisée pour localiser des gènes d’intérêt (Hao et al., 2012b; Hyten et al., 2009a; Kim et al., 2012a; Lee et al., 2013b; Mamidi et al., 2011), étudier la diversité génétique (Li et al., 2010b) et pour construire une carte génétique consensus du soya (Hyten et al., 2010b).
Le département de l’agriculture des États Unis a récemment développé la puce SoySNP50K qui utilise la plate-forme Infinium d’Illumina (Song et al., 2013). Cette puce donne de l’information sur 52 041 marqueurs SNP simultanément par échantillon. Lors du travail de validation qui employait 96 lignées anciennes, 96 lignées élites et 96 accessions de soya sauvages, un total de 47 337 SNP se sont avérés utilisables et polymorphes. À ce jour, la seule étude publiée ayant fait appel à la technologie Infinium a étudié un gène de résistance à la rouille asiatique du soya (Phakopsora pachyrhizi Sydow) sur le chromosome 18 (Kim et al., 2012b). Cependant le département de l’agriculture des États Unis est présentement en train de l’utiliser pour génotyper l’ensemble de sa collection de 19 300 lignées de soya (P. Cregan, communication personnelle).
1.6 Technologies de génotypage à haut débit
L’arrivée sur le marché des plates-formes de séquençage de nouvelle génération qui produisent des masses de séquences à coût abordable a bouleversé l’étude de la génétique. Il est désormais possible de reséquencer le génome complet de lignées de soya pour fins d’études (Lam et al., 2010; Lee et al., 2013a; Subbaiyan
et al., 2012) mais cela demeure trop cher pour qu’on y ait recours à grande échelle. Il existe cependant quatre méthodes dites « de réduction de complexité », qui permettent de séquencer seulement une petite fraction du génome entier et d’y identifier des polymorphismes. Celles-ci sont: le séquençage d’ADN associé à des sites de restriction (« Restriction site Associated DNA sequencing », RAD-seq), les banques de représentation réduites (« Reduced Representation Libraries », RRL), le séquençage de fragments amplifiés provenant de locus spécifiques (« Specific-Locus Amplified Fragment (SLAF) sequencing », SLAF-seq), et le génotypage par séquençage (« Genotyping By Sequencing », GBS). Ces méthodes font toutes appel à des enzymes de restriction. Elles permettent d’obtenir un nombre élevé de marqueurs mais également beaucoup de données manquantes. Des logiciels ont été développés pour imputer ces données manquantes et il a été démontré que ceux-ci bouchent les trous correctement (Guan et Stephens, 2008).
1.6.1 RAD-seq
Les séquences RAD sont des petites régions voisines des sites de restriction. Le processus débute avec une digestion de l’ADN avec un enzyme de restriction qui laisse des bouts cohésifs. Les bouts subissent une ligation avec des adaptateurs qui contiennent une étiquette propre à chaque individu. Les ADN de tous les individus sont regroupés et coupés aléatoirement. Les fragments d’ADN d’une certaine taille sont alors sélectionnés, subissent une deuxième ligation avec un adaptateur, puis le tout est amplifié par PCR et séquencé. La méthode RAD-seq a été développée à l’origine chez les animaux et les champignons (Baird et al., 2008; Miller et al., 2007), mais a depuis été utilisée pour produire une carte de liaison chez l’orge (Chutimanitsakun et al., 2011), détecter 20 785 SNP chez le canola (Bus et al., 2012), et pour trouver des marqueurs associés à la résistance à l’anthracnose chez le lupin (Yang et al., 2012). Elle n’a cependant jamais été utilisée chez le soya.
1.6.2 RRL
L’approche RRL consiste à digérer l’ADN génomique provenant de plusieurs individus avec un enzyme de restriction qui reconnaît une séquence courte. Un
sous-ensemble de fragments d’une certaine taille est sélectionné et séquencé. La séquence de chaque fragment est alignée sur le génome de référence et on fait l’appel des SNP en comparant les différences entre les individus (Davey et al., 2011). Chez le soya l’approche RRL a permis d’identifier 1 682, 7 947, 25 047 et 14 550 SNP marqueurs SNP dans quatre travaux (Deschamps et al., 2010; Wu et al., 2010; Hyten et al., 2010a; Varala et al., 2011). On l’a également utilisée pour développer la puce Infinium en digérant l’ADN de huit génotypes avec 10 enzymes de restriction différents. Malheureusement l’approche RRL utilise entre 6 et 50 µg d’ADN par échantillon, une grande quantité lorsqu’on travaille avec de nombreux génotypes.
1.6.3 SLAF-seq
L’approche SLAF-seq débute avec une digestion de l’ADN de chaque échantillon avec un enzyme de restriction, une ligation avec un adaptateur et une seconde digestion (Sun et al., 2013). L’ADN subit une amplification PCR et est purifié, puis on regroupe les ADN provenant des différents individus. Cela est suivi d’une troisième incubation de l’ADN avec un enzyme et des adaptateurs et d’une deuxième purification. Les fragments d’ADN de 450 à 500 paires de bases sont sélectionnés sur gel, amplifiés une deuxième fois et finalement séquencés. Bien que cette méthode ait été testée chez la carpe commune, le poisson zèbre, le riz, le soya (Sun et al., 2013) et une espèce cousine du blé, Thinopyrum elongatum (Chen et al., 2013), elle ne deviendra probablement pas populaire chez le soya en raison de sa complexité.
1.6.4 GBS
La méthode du génotypage par séquençage décrite par Elshire et collaborateurs en 2011 devient de plus en plus populaire pour la recherche en génétique. Ici encore on commence par digérer l’ADN avec un enzyme de restriction. Les séquences d’ADN subissent une ligation avec deux adaptateurs dont un contient une étiquette propre à l’individu. Les échantillons sont regroupés, nettoyés et amplifiés par une réaction PCR. Les banques qui passent le contrôle de qualité sont séquencées. Le GBS a trois avantages indéniables par rapport aux
