Allergie moléculaire & Diagnostic in-vitro, Optimalisation de la prescription

(1)

Apport

des examens biologiques

en pratique allergologique

Romy GADISSEUR

02 AVRIL 2014

(2)

Allergie moléculaire

...le chemin parcouru...

1880

1967

1988-91

Tests de

Provocation

(SPT)

1

ers

allergènes

clonés

RAST

Caractérisation &

désignation des

IgE

Tests IN-VITRO

Tests IN-VIVO

Standardisation

des extraits

allergéniques

ANAMNESE

CLINIQUE

ANAMNESE

CLINIQUE

(3)

2000

2008

Dosages d’IgE spécifiques

pour les composants

allergéniques

Techniques

MULTIPLEXES dont

ImmunoCAP ISAC

Tests

IN-VITRO

Tests IN-VIVO

Figure 9. Selected examples of Allergen micro-Beads Array (ABA) IgE testing report. Eleven different micro-beads were tested in the same

tube in each run for each sample. Examples were selected on purpose among the samples with high total IgE. All IgE positive and negative ABA

results matched the ISAC results. Numbers in the upper left corner indicate the Table S1 row numbers and patients’ ID. In each panel: the upper left

graph shows clustered micro-beads by their dimension; the upper right: scatter plots of each fluorescent bead; the lower left: fluorescence intensity

and event counts; the lower right: summary table with median fluoresce nce values. Samples reported in each of the six panels had the following total

IgE values: Panel A=9,730 IU/l; Panel B=1,351 IU/l; Panel C=1,220 IU/l; Panel D=1,931 IU/l; Panel E=20,900 IU/l; Panel F=23,540 IU/l.

doi:10.1371/journal.pone.0035697.g009

Allergen Micro-Bead Array for IgE Detection

PLoS ONE | www.plosone.org

14 April 2012 | Volume 7 | Issue 4 | e35697

ANAMNESE

CLINIQUE

ANAMNESE

CLINIQUE

Allergie moléculaire

(4)

2000

2008 - ...

Figure 9. Selected examples of Allergen micro-Beads Array (ABA) IgE testing report. Eleven different micro-beads were tested in the same

tube in each run for each sample. Examples were selected on purpose among the samples with high total IgE. All IgE positive and negative ABA

results matched the ISAC results. Numbers in the upper left corner indicate the Table S1 row numbers and patients’ ID. In each panel: the upper left

graph shows clustered micro-beads by their dimension; the upper right: scatter plots of each fluorescent bead; the lower left: fluorescence intensity

and event counts; the lower right: summary table with median fluoresce nce values. Samples reported in each of the six panels had the following total

IgE values: Panel A=9,730 IU/l; Panel B=1,351 IU/l; Panel C=1,220 IU/l; Panel D=1,931 IU/l; Panel E=20,900 IU/l; Panel F=23,540 IU/l.

doi:10.1371/journal.pone.0035697.g009

Allergen Micro-Bead Array for IgE Detection

PLoS ONE | www.plosone.org

14 April 2012 | Volume 7 | Issue 4 | e35697

ANAMNESE

CLINIQUE

ANAMNESE

CLINIQUE

Allergie moléculaire

...pour arriver à destination !

1880

1967

1988-91

Tests IN-VITRO

Tests IN-VIVO

(5)

Le bilan allergologique

• _{Examen clinique... idéalement par un spécialiste en}

allergologie

• _{Anamnèse basée sur l’histoire clinique :}

–

_{Primordiale et fastidieuse !!}

–

_{Description des symptômes}

–

_Chronologie

 délai entre exposition/symptômes, caractère répétitif, perannuel

ou saison pollinique...

 Caractère post-prandial,

–

_{étude de l’alimentation,}

–

_{Antécédents familiaux et personnels d’atopie.}

• _{Tests in-vivo}

(6)

Tests in-vivo

du bilan allergologique

• _{Tests in-vivo}

_{basés sur l’histoire clinique}

_:

–

_{Tests cutanés}

–

_{Tests cutanés réalistes (prick-to-prick)}

–

_{Tests de provocation orale}

 Gold standard = double-blind placebo-controlled food challenge

• _{Régimes d’épreuve ou régime d’éviction (= diagnostique et thérapeutique)}

–

_{L’amélioration des symptômes sous régime d’épreuve permet d’identifier les}

aliments à l’origine des symptômes et conforter le diagnostic.

(7)

Le bilan allergologique

• _{Test in-vitro basés sur l’histoire clinique et/ou sur les résultats des tests cutanés :}

–

_{Dosage des IgE totales :}

 Peu d’intérêt

–

_{Dosage d’IgE spécifiques, dosages unitaires :}

1. Mixtures d’extraits globaux (exemples : fX5, mX1, tX6, wX3, gX2, eX1 ...)

 Si allergène responsable n’est pas identifié formellement, screening de départ

2. Extraits globaux (exemples : t3, g6, f13, d1, e1, w6, m3...)

 Malades avec Tests cutanés négatifs ou tous positifs, ou malades peu compliants.

 Peu discriminants pour le pronostic voire même faux (histoire du latex)

3. Protéines recombinantes ou naturelles purifiées (t215, f423, d201, e94..)

 Si source allergénique définie, si étude approfondie nécessaire

 Réactions croisées cliniques

 Pronostic (PFL-PR10-LTP-Prot stockage)

 Poser l’indication d’un TPO, d’une désensibilisation

 Standardisation des résultats, Contrôles de qualité

–

_{Dosage d’IgE spécifiques par technique Multiplex}

(8)

Tests in-vitro

Le dosage des IgE avec les recombinants

• Les extraits allergéniques utilisés ne permettent pas de définir à quelle protéine le

patient est spécifiquement allergique.

• Seules certaines protéines des sources allergéniques se lient aux IgE et sont à l’origine

des manifestations d’hypersensibilité de type 1.

• Toutes les protéines ne sont pas des allergènes !

• Progrès en biologie moléculaire :

• Synthèse des protéines recombinantes analogues aux protéines qui induisent

une réaction allergique et qui leur ressemblent au niveau immunologique.

• Production effectuée avec une qualité constante et en quantité suffisante.

 La détermination des IgE spécifiques dirigées contre ces protéines permet de

déterminer un profil réactionnel individualisé pour chaque patient.



Identification exacte des molécules qui induisent la maladie

.

Dans tous les cas aujourd’hui,

l’allergologie moléculaire ne concerne que

(9)

Tests in-vitro

du bilan allergologique

3

Allergen source based diagnosis SD

Extrakt von Birkenpollen

Allergen Component based diagnosis CRD

rBet v 1 rBet v 2 rBet v 4

Extrakt von Birkenpollen

Allergen Component based diagnosis CRD

rBet v 1 rBet v 2 rBet v 4

Quantitative assesment

Major allergen Cross reacting minor allergen Birch Bet v 1 Bet v 2° Bet v 4 *

°Profilin

* CalciumCalcium--bindbind. Protein. Protein

Allergens of pollen

(10)

Nomenclature des allergènes

selon l’IUIS

(International Union of Immunological Societies)

• _{t :}

_t

_ree

• _{f :}

_f

_ood

• _{g :}

_g

_rass

• _{i :}

_i

_nsect

• _{w :}

_w

_heat

• _{c :}

_c

_ure

• _{d :}

_d

_{ust mite}

• _{m :}

_m

_oisture

• _{e :}

_e

_pithelia

• _{p :}

_p

_arasite

• _{k : (professional allergens}

₎

• _{t3 :}

_Bet

_ula

_v

_erucosa

_{Bet v}

_1,2,4,6,7

• _{f17 :}

_Cor

_ylus

_a

_velana

_{Cor a}

_1,…8,...11

• _{f1 :}

_Bos

_d

_omesticus

_{Bos d}

_{1, 2, 3, …6}

• _{e1 :}

_Fel

_is

_d

_omesticus

_{Fel d}

_{1, 2, 3, …}

• _{f13 :}

_Ara

_chis

_h

_ypogaea

_{Ara h}

_{1, 2, 3, …8, …}

Nomenclature

empirique

« Nomenclature

recombinants »

(IUIS)

Taxon

genre

Nombre associé à l’ordre de

purification de la protéine

(11)

Allergie moléculaire

Etat des lieux

• Actuellement :

 ± 5000 allergènes décrits.

 >130

composants

allergéniques

commercialisés pour le dosage des IgEs.

 Réseau

• Outils in-vitro disponibles :

 Dosages unitaires :

 ImmunoCAP, Phadia (ThermoFisher)

>>> Immulite ou Hycor

 Dosages multiplexes :

 ImmunoCAP ISAC, Phadia (ThermoFisher), depuis 2008 en Belgique



Développements en cours, +/- aboutis...



Microbeads array



Lab-on-a-chip, microfluidics

(12)

L’allergie moléculaire

Nouveautés

Nouveaux

en 2013

(13)

Différents types de réactions croisées

• _{Réactions croisées entre espèces taxonomiquement proches :}

–

_{exemple : acariens (d1,d2), graminées (dactyle, phléole), oléacées (frêne,}

olivier), ombellifères (céleri, armoise)

• _{?!? Réactions croisées entre espèces taxonomiquement éloignées.}

–

_{Exemple : pomme/bouleau, allergie orale chez 50% des allergiques au}

pollen de bouleau (PR10 : Bet v 1/Mal d 1)

–

_{Ici, la relation botanique ne permet pas d’expliquer les RC !}

 Explication par la structure des allergènes et leur fonction avec notion

de famille moléculaire (rassemble des protéines provenant de divers

allergènes et ayant la même fonction physiologique)

(14)

Syndrome d’ allergie orale

• Par exemple associé à l’allergie à la bouleau

• pommes (Mal d 1)

• noisette (Cor a 1)

• À éviter selon tolérance

• _{Complètement}

• _{Que épluché ou cuit}

(15)

Allergie moléculaire

Composants disponibles

• _{Protéines PR-10, Bet v 1 homologue}

–

_{Instable à la chaleur, aliment cuit toléré en général.}

»

_{Breiteneder H, Biotechnol Adv, 2005}

–

_{Associé à des symptômes locaux comme le Syndrome Oral Allergique(OAS).}

–

_{Associé aux réactions allergiques aux fruits et légumes au Nord de l’Europe.}

Mal d 1

Pru p 1

Ara h 8

Cor a 1.01

Cor a 1.04

Api g 1

Gly m 4

Bet v 1

Act d 8

Aln g 1

(16)

Oral Allergy Syndrome

(OAS)

• _{Syndrome d’Allergie Orale : Réaction}

allergique, gêne au niveau de la bouche qui

apparaît instantanément ou peu de temps après

l’ingestion de l’aliment.

–

_{Un chatouillement ou sensation de brûlure au}

niveau des lèvres, de la bouche et/ou du pharynx.

• _{Associé à la sensibilisation à une ou plusieurs}

protéine de type PR-10 càd homologue de Bet

v 1 (bouleau).

o

_{Noisette, 46%}

o

_{Pomme, 39%}

o

_{Pêche, 24%}

o

_{Cerise, 22%}

o

_{Noix, 21%}

o

_{Poire, 20%}

o

_{Amande, 19%}

o

_{Prune, 17%}

o

_{Noix du Brésil, 16%}

o

_{Pomme de terre, 15%}

o

_{Carotte, 13%}

o

_{Arachide, 10%}

o

_{Fraise, 10%}

o

_{Orange, 9%}

o

_{Abricot, 7%}

PR-10

rBet v 1

rPru p 1

rGly m 4

rAra h 8

rApi g 1.01

rAln g 1

rCor a 1

nAct d 8

rMal d 1

rDau c 1

1 60 Birch MGVFNYETET TSVIPAARLF KAFILDGDNL FPKVAPQAIS SVENIEGNGG PGTIKKISFP Hazel MGVFNYETES TSVIPAARLF KAFILDGNNL IPKVAPQAVS SVENVEGNGG PGTIKKITFS Alder MGVFNYEAET PSVIPAARLF KAFILDGDKL LPKVAPEAVS SVENIEGNGG PGTIKKITFP Hornbeam MGVFNYEAET TSVIPAARLF KAFILDGNNL IPKVAPQAVS SVENVEGNGG PGTIKKITFS Beech MGVFTYESEN TSVIPPARLF KAFVLDADNL IPKVAPQSIK STETLEGDGG PGTIKKITFG Apple MGVFNYETET TSVIPAPRLF KAFILDGDNL IPKIAPQAIK STEIIEGDGG VGTIKKVTFG Cherry MGVFTYESEF TSEIPPPRLF KAFVLDADNL VPKIAPQAIK HSEILEGDGG PGTIKKITFG Apricot MGVFTYETEF TSVIPPEKLF KAFILDADNL IPKVAPTAVK GTEILEGDGG VGTIKKVTFG Pear MGLYTFENEF TSEIPPPRLF KAFVLDADNL IPKIAPQAIK HAEILEGNGG PGTIKKITFG Medicago MGVFNFEDET TSIVAPARLY KALVTDSDNL IPKVI.DAIQ SIEIVEGNGG AGTIKKLTFV Garden pea MGVFNVEDEI TSVVAPAILY KALVTDADNL TPKVI.DAIK SIEIVEGNGG AGTIKKLTFV Soybean MGVFTFEDEI NSPVAPATLY KALVTDADNV IPKAL.DSFK SVENVEGNGG PGTIKKITFL Tomato MGVNTYTYES TTTISPTRLF KALVLDFDNL VPKLLSQHVK NNETIEGDGG VGSIKQMNFV Celery MGVQKTVVEA PSTVSAEKMY QGFLLDMDTV FPKVLPQLIK SVEILEGDGG VGTVKLVHLG Carrot MGAQSHSLEI TSSVSAEKIF SGIVLDVDTV IPKAAPGAYK SVDV.KGDGG AGTVRIITLP Asparagus MSSSAVSHEI ESSVSAARLF KASMIEWHNL APKILPEIVS SASVVAVDGG VGSIRQINFT 120 Birch EGFPFKYVKD RVDEVDHTNF KYNYSVIEGG PIGDTLEKIS NEIKIVATPD GGSILKISNK Hazel EGSPFKYVKE RVEEVDHTNF KYSYTVIEGG PVGDKVEKIC NEIKIVAAPD GGSILKISNK Alder EGSPFKYVKE RVDEVDRVNF KYSFSVIEGG AVGDALEKVC NEIKIVAAPD GGSILKISNK Hornbeam EGSPVKYVKE RVEEVDHTNF KYSYTVIEGG PVGDKVEKIC NEIKIVAAPD GGSILKITSK Beech EGSQFKYVKH RIDEVDQANF SYGYSVIEGD VVSGIIEKIS YEIKIVASPD GGSLLKSTSK Apple EGSQYGYVKQ RVNGIDKDNF TYSYSMIEGD TLSDKLEKIT YETKLIASPD GGSIIKTTSH Cherry EGSQYGYVKH KIDSIDKENY SYSYTLIEGD ALGDTLEKIS YETKLVASPS GGSIIKSTSH Apricot EGSQYAYVKH RVDGIDKDNL SYSYTLIEGD ALSDVIENIA YDIKLVASPD GGSIVKTTSH Pear EGSQYGYVKH RVDSIDEASY SYAYTLIEGD ALTDTIEKIS YEAKLVASGS .GSTIKSISH Medicago EGGETKYDLH KVDLVDDVNF AYNYSIVGGG GLPDTVEKIS FESKLSAGPD GGSIAKLTVK Garden pea EDGETKHVLH KVELVDVANL AYNYSIVGGV GFPDTVEKIS FEAKLSAGPN GGSIAKLSVK Soybean EDGETKFVLH KIESIDEANL GYSYSVVGGA ALPDTAEKIT FDSKLVAGPN GGSAGKLTVK Tomato EGGPIKYLKH KIHVIDDKNL ETKYSLIEGD ILGEKLESIT YDIKFEANDN GGCVYKTTTE Celery EATEYTTMKQ KVDVIDKAGL AYTYTTIGGD ILVDVLESVV NEFVVVPT.D GGCIVKNTTI Carrot EGSPITSMTV RTDAVNKEAL TYDSTVIDGD ILLGFIESIE THLVVVPTAD GGSITKTTAI Asparagus SAMPFPYLKE RLDFVDEANF ECKSSLIEGG DLGTKLESAS SHFKLVPSSN GGCVVKLEGI 178 Birch YHTKGDHEVK AEQVKASKEM GETLLRAVES YLLAHSDAYN ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Hazel YHTKGDHEVD AEHIKGGKEK VEGLFRAVEA YLLAHSDAYN ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Alder FHTKGDHEIN AEQIKIEKEK AVGLLKAVES YLLAHSDAYN ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Hornbeam YHTKGDHEVP AEHIKGGKER VEGLLKPVEA YLLAHTAEYN N~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Beech YHIKGNHEIK EEEVKAGKEK AAGLFKAVEA YLLAHPDAYN ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Apple YHAKGDVEIK EEHVKAGKEK ASGLFKLLEA YLLAHSDAYN ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Cherry YHTKGNVEIK EEHVKAGKEK ASNLFKLIET YLKGHPDAYN ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Apricot YHTKGDVEIK EEQVKAGKEK AAGLFKLVEA YLLANPDAYN ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Pear YHTKGDIEIK EEHVKAGKEK AHGLFKLIES YLKDHPDAYN ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Medicago YFTKGDAAPS EEEIKGGKAR GDGLFKALEG YVLANPD.Y~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Garden pea YFTKGDAAPS EEQLKTDKAK GDGLFKALEG YCLAHPD.YN ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Soybean YETKGDAEPN QDELKTGKAK ADALFKAIEA YLLAHPD.YN ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Tomato YHTKGDHVVS EEEHNVGRRE NHEYFQGCRS IPSRESFCLR LNIDEKESGL HVRNYACT Celery YNTKGDAVLP EDKIKEATEK SALAFKAVEA YLLANLQFLA ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Carrot FHTKGDAVVP EENIKFADEQ NTALFKAIEA YLIAN~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Asparagus FKALPGVETT DEVAK.GKEM MTNAIKAAEA YLVANPTAYA ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~

(17)

• _{nsLTP (Protéines de transfert lipidique non spécifique)}

–

_{Stables à la chaleur et à la digestion => allergies aux aliments cuits.}

–

_{Souvent associées à des réactions systémiques, OAS => réactions + sévères.}

–

_{Causent souvent des allergies alimentaires aux fruits sans allergie pollinique.}

–

_{Souvent, associées aux réactions allergiques aux fruits et légumes au Sud de}

l’Europe.

Cor a 8

Pru p 3

Ara h 9

Mal d 3

Jug r 3

Tri a 14

Ole e 7

Pla a 3

Art v 3

Par j 2

Allergie moléculaire

Composants disponibles

! Nouveaux !

(18)

• _{Protéines de stockage}

–

_{Présentes dans les graines.}

–

Parfois, stable et résistante à la chaleur causant des réactions aux

aliments cuits.

Ber e 1

Ara h 1

Ara h 2

Ara h 3

Ara h 6

Cor a 9

Cor a 14

Ses i 3

Gly m 5

Gly

m 6

Jug r 1

Jug r 2

Ana o 2

Fag e 2

Allergie moléculaire

Composants disponibles

! Nouveaux !

(19)

Profiline

Bet v1/Pr-10

LTP

Protéines de stockage

Non spécifique

Spécifique

Sévérité de la réaction

(20)

Prédire les réactions croisées

Arachide (f13)

Arachide (f13) : Nég

Peu de risque de

réactions sévères

Arachide (f13) : Pos

Ara h 2 : Nég

Risques de réaction sévère?

Comment explorer?

Recommendations

Test : Risque

• Ara h 1 (f422)

• Ara h 3 (f424)

• Ara h 6 (ISAC)

• Ara h 9 (f427)

• Ara h 8 (f352)

• Ara h 5

Arachide (f13) : Pos

Ara h 2 : Pos

Très haut risque de

réaction sévère

(21)

• _{Protéines de stockage}

–

_{Présentes dans les graines.}

–

Parfois, stable et résistante à la chaleur causant des réactions aux

aliments cuits.

Ber e 1

Ara h 1

Ara h 2

Ara h 3

Ara h 6

Cor a 9

Cor a 14

Ses i 3

Gly m 5

Gly

m 6

Jug r 1

Jug r 2

Ana o 2

Fag e 2

Allergie moléculaire

Composants disponibles

! Nouveaux !

(22)

• _{175 TPO arachide positifs et 30 TPO arachide négatifs (enfants, jeunes adultes, 1-26}

ans) corrélés rétrospectivement avec des dosages d’IgE spécifiques f13 et les

composants Ara h 1, 2, 3, 8 et 9.

1. Le titre en IgE f13 et les composants est + importants en cas de TPO positif mais la

simple présence d’IgE ne l’est pas (=> sensibilisation!)

2. Le titre en IgE Ara h2 est prédictif de l’issue du TPO arachide

3. Cut off : IgE Ara h 2 = 1,63 kU/L pour une spécificité de 100% et une sensibilité de

70%. IgE f13 = 2,6kU/L

4. Données comparables à une autre cohorte publiée (Pays-Bas)

patients TPO positif

patients TPO négatif

(23)

• _{34 enfants <1an avec dermatite atopique, dont 29 avec AA.}

–

_{20 sensibilisés à la noisette}

 12/20 : Profil de sensibilisation à Cor a 9, sans Cor a 1.

 Parfois associé aux homologues de l’arachide/soja.

results to the three hazelnut components spotted

on the microchip. Figure 2 displays the

correla-tion between sIgE to Cor a 9 on the microarray

and sIgE hazelnut by traditional ImmunoCAP.

From this ﬁgure, it emerges that sIgE to Cor a 9

is highly related to sIgE hazelnut (r = 0.88,

p < 0.001). Except for one, all Cor a 9-positive

sera spotted on the microarray, had a sIgE to

hazelnut exceeding 5.5 kUA/l, whereas all sIgE

to hazelnut for the Cor a 9-negative sera were

< 2.0 kUA/l. To conﬁrm the Cor a 9 microarray

data, sera were also analyzed by a singleplexed

ImmunoCAP assay coated with the samenCor a

9 component as used in the microarray. This

comparative analysis demonstrated a high

corre-lation (r = 0.91, p < 0.001).

Next to nCor a9, themicroarray containsthree

other 11S legumin-like seed-storage proteins, i.e.,

nAra h 3 from peanut (Arachis hypogea), nGly m

6 from soy (Glycin max), and rAna o 2 from

cashew (Anacardium occidentale). Figure 1

dis-plays the percentages of positive results for these

different components. Sensitization to these

leg-umin-like proteins was restricted to the infants

sensitized to nCor a 9, except for oneinfant with

a sensitization to nAra h 3 but not to nCor a 9.

Actually, half of thepatients sensitized to nCor a

9demonstrated IgE reactivity to nArah 3. Fiveof

these six nAra h 3-sensitized infants also

demon-strated a positive sIgE result to nGly m 6 from

soy. Only one nCor a 9-sensitized infant showed

IgE reactivity to rAna o 2.

Table 1. Individual data of IgEsensitization byImmunoCAP to potential

cross-reactive plant derived food allergens

Peanut (f13)

Soy (f14)

Wheat (f4)

Potato (f35)

Infants with hazelnut sensitization

pt 1

22.1

21.4

63.4

24.3 pt 2

14.6

6.75

100

13.7 pt 3

96.3

8.1

9.18

10.1 pt 4

>100

23.8

4.33

0.36 pt 5

3.13 <0.35

1.99

28.3 pt 6

0.41 <0.35

NA

pt 7

1.61

0.47

9.63 NA

pt 8

2.66

0.47

26.1 NA

pt 9

8.07

3.73

1.21

4.2 pt 10

0.81 <0.35

<0.35

0.65 pt 11

1.66 <0.35

<0.35

3.18 pt 12

>100

2.38 <0.35

NA

pt 13

13.1 <0.35

0.57 <0.35

pt 14

<0.35

pt 15

<0.35

2.01

15.2 pt 16

<0.35

0.48 pt 17

<0.35

NA

pt 18

NA

<0.35

3.22 pt 19

0.35 NA

11.1 <0.35

pt 20

<0.35

1.91

3.63

21.6 Infants without hazelnut sensitization

pt 21

<0.35

0.36 <0.35

pt 22

NA

<0.35

0.85 pt 23

<0.35

2.00 pt 24

<0.35

0.44 pt 25

<0.35

1.64

0.85 pt 26

<0.35

NA

pt 27

<0.35

0.75 pt 28

<0.35

1.29 pt 29

<0.35

Speciﬁc IgE results are expressed in kUA/l.

Pt, Patients; NA, not available.

Fig. 1. Percentages of positive sIgE results by ISAC microarray for infants with (red) or without (blue) hazelnut sensitization

and infants without any food sensitization (green). CCD, cross-reactive carbohydrate determinants; Bet v 2, birch proﬁlin.

Sensitization to Cor a 9 from hazelnut (Corylus avellana)

(24)

• _{65 patients avec allergie immédiate à la noisette crue ou cuite.}

• _{6 groupes selon degré de sévérité + 34 patients contrôles allergiques au pollen de bouleau et tolérants à la noisette}

crue + des contrôles non allergiques.

• _{Profil moléculaire avec l’ImmunoCAP ISAC}

1. La présence d’IgE Cor a 9 ou Cor a 8 est restreinte à un tableau clinique sévère

(R.systémique)

2. Le profil « protéine de stockage » est plus fréquent chez l’enfant alors que le profil LTP

est plus fréquent chez l’adulte.

3. Dans cette série, aucune sensibilisation à Cor a 9 asymptomatique !

Biosciences). Flow cytometric analysis of basophil activation

was performed. Side scatter, CD123

+

_{, and HLA-DR}

)

_were

used to gate out the basophils. Subsequently, within this gate,

the percentage of activated basophils, i.e., co-expressing

CD63, was measured. Results were expressed as percentages

of CD63

+

_{basophils after subtraction of the negative control.}

Statistical analysis

Results were expressed as median (range). Non-parametric

tests were used where appropriate. IBM SPSS 17 (IBM ,

Chicago, IL, USA) software was used for data analysis.

Chi-squared analysis was performed to compare frequencies.

A p value of < 0.05 was regarded as statistically signiﬁcant.

Results

Demographics and clinics

Table 1 displays the results of all 103 puriﬁed and

recombi-nant components spotted on the microarray. Demographics

and results (median and range) of total IgE and singleplexed

sIgE to hazelnut and birch pollen of patients and control

individuals are summarized in Table 2. Twenty-nine patients

in our cohort suffered from a systemic reaction [17 preschool

children (median age of 2 years), six school children, and six

adults] and 36 patients reported an oral allergy syndrome

(three preschool children, nine school children, and 24

adults).

Sensitization to hazelnut components

The percentages of sensitization to the different puriﬁed and

recombinant hazelnut components (rCor a 1.04, rCor a 8,

and nCor a 9) and rBet v 1 from birch pollen are displayed

in Fig. 1.

The major observation is that in our birch-endemic region,

65% of preschool children and 50% of the school children

with systemic reactions on ingestion of processed hazelnut

(chocolate or chocolate spread) are sensitized to Cor a 9. In

hazelnut allergic adults with systemic reactions, sensitization

to Cor a 9 was demonstrable in 17%. The clinical data and

sensitization proﬁles of the Cor a 9 sensitized patients are

dis-played in Table 3. All our patients sensitized to Cor a 9

reported systemic reactions on ingestion of hazelnut in its

Figure 1 The percentages of sensitization to the three different hazelnut components (nCor a 9, rCor a 8, and rCor a 1.04) and rBet v 1 from birch pollen spotted on the microarray, in healthy control individuals, patients with systemic reaction on consumption of hazelnut (Hazelnut+, SR+), hazelnut allergic patients with merely an

oral allergy syndrome (Hazelnut+, OAS+), and patients tolerant to hazelnut but allergic to birch pollen (Hazelnut) , Birch pollen+). These groups were divided into three different age categories. For exact numbers, see Table 2.

Hazelnut allergy: sensitization proﬁles De Knop et al.

(25)

Poisson

• Souvent des quantités minimes provoquent une

réaction grave (odeur)

• Pas de différence entre poissons d’eau douce/mer

• Allergènes détruits partiellement par l’acidité de

l’estomac (IPP)

Untersmayr E, Poulsen LK, Platzer MH, Pedersen MH, Boltz-Nitulescu G, Stahl Skov P, Jensen- Jarolim E. The

effects of gastric digestion on codfish allergenicity. J Allergy Clin Immunol 2005; 115: 377-82

(26)

Parvalbumine

– Allergène majeur chez les

poissons d’avril.

–

_{Marqueur de réaction croisée entre les différentes espèces de}

poisson/amphibien.

–

_{Protéine extrêmement stable à la chaleur et à la digestion}

=> réactions même à l’aliment cuit !

 Responsable de 95% des allergies au poisson.

CARP rCyp c 1

Parvalbumin

rCyp c 1

rGad c 1

COD rGad c1

(27)

Diagnostic différentiel

=> Intoxication au poisson

• _{Quelques poissons (hareng, maquereau) se dégradent}

en produisant de l’histamine

• _{Réaction en quelques minutes :}

–

_Vomissements

–

_Urticaire

–

_Tachycardie

–

_Dyspnée

Taylor SL, Stratton JE, Nordlee JA, Histamine poisoning (scombroid fish poisoning): an allergy-like intoxication. J Toxicol Clin Toxicol.

1989;27(4-5):225-40.

(28)

• Tropomyosine

–

_{Actin-binding protein des fibres musculaires}

–

_{Allergène majeur des invertébrés comestibles, allergène mineur des}

acariens.

–

_{Marqueur de réactions croisées entre les crustacés, les acariens et les}

blattes.

rPen a 1

nPen m 1

nBla g 7

rAni s 3

rDer p 10

(29)

• _{CCD, MUXF3 (cross-reacting carbohydrate determinants) :}

–

_{Marqueur de sensibilisation aux déterminants carbohydrates}

_{(Glyco-épitopes).}

–

_{Présents dans la majorité des plantes et dans le venin d’hyménoptères}

–

_{Mise en évidence d’IgEs dirigés contre des glycans :}

 Causent des profils de sensibilisations croisées larges parmi les extraits

allergéniques

–

_{Responsables de réactions croisées in-vitro.}

 effets « in-vivo » ?

–

_{Rarement associé à des symptômes cliniques…}

–

_{A confronter aux informations cliniques et aux SPT…}

Prédire les réactions croisées

Disponibles

MUXF3

o214

Bromelin

(30)

Recrutement de 24 patients avec histoire d’urticaire, angioedème ou anaphylaxie 3-6h après

ingestion de viande

24/24 patients IgE alpha-GAL + et IgE viandes + Tests cutanés aux viandes fraîches positifs

Délais ++

Exprimé à la surface des cellules et des tissus des mammifères non-primates

Sensibilisation via infestation parasitaire? allergie au chat?

(31)

• 2,5% des enfants

• _{De l’urticaire, dermatite atopique, trouble GI, à l’anaphylaxie.}

• Blanc d’œuf (f1)

• IgEs Ovomucoïde/Gal d1 positif

–

_{Souvent allergie persistante, à vie}

–

_{Souvent l’œuf n’est toléré ni cuit, ni cru}

• _{IgEs Ovomucoïde négatif}

–

_{Souvent l’œuf cuit est supporté}

Goldstandard:

provocation par étapes

(32)

 L’absence d’IgE pour l’ovomucoide

témoigne d’une tolérance pour l’oeuf

cuit.

 La présence d’IgE pour l’ovomucoide

est corrélée à une forte probabilité

d’allergie à l’oeuf persistante

(33)

• _Profiline

–

_{Rarement associée à des symptômes cliniques mais réactions sévères pour une}

minorité de cas.

–

_{Panallergènes = présente dans une large variété de pollens (d’arbres, d’herbacées et}

de graminées) et d’aliments d’origine végétale.

–

_{Grande homologie de structure entre les profilines des différents fruits et légumes.}

Mal d 4

Hev b 8

Phl p 12

Bet v 2

Mer a 1

Pru p 4

Allergie moléculaire

Composants disponibles

(34)

Anaphylaxie au froment

• Tri a 19 / Omega 5 Gliadine

• Effort

• Confirmation du diagnostic

avec provocation + effort

Int Arch Allergy Immunol. 2012;158(1):71-6. Epub 2011 Dec 29.

Clinical Utility of IgE Antibodies to ω-5 Gliadin in the Diagnosis of Wheat Allergy:

A Pediatric Multicenter Challenge Study.

(35)

ImmunoCAP

SINGLEPLEX

+

ImmunoCAP ISAC

MULTIPLEX

Allergie moléculaire

2 concepts => Singleplex versus Multiplex

• Une détermination = Un résultat

• ImmunoCAP,

Immulite , HyTech

 Sélection des composants nécessaires

définie par l'histoire clinique du patient.

• ImmunoCAP ISAC, le + complet,

• Une détermination = 112 résultats

=> 112 composants, > 50 sources

Large

panel

d'allergènes

présélectionnés indépendamment de

l'histoire de clinique.

(36)

Microarray, Multiplex

ImmunoCAP ISAC

• Technique innovante, outil supplémentaire pour

le diagnostic in-vitro, basé exclusivement sur les

composants allergéniques.

–

_{Plateforme miniaturisée d’immunoessais}

–

_{Mesure des IgEs dirigés contre +/-50 sources}

allergéniques communes, en un seul dosage.

–

_{112 allergènes natifs et recombinants.}

 Allergènes choisis en fonction de leur pertinence

dans l’établissement d’un profil de sensibilisation.

–

_{Tests sur 30 μL de sérum ou sang total.}

–

_{Permet de déterminer des profils de sensibilisation}

(37)

Pollens : Cyn d 1, Phl p 1,

Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5,

Phl p 6 et Ole e 1

Bet v 1 homologues (PR-10):

Bet v 1, Aln g 1, Cor a 1,

Mal d 1, Pru p 1, Gly m 4,

Ara h 8, Api g 1

Profilines :

Bet v 2, Ole e 2, Hev b

8, Mer a 1, Phl p 12

Marqueurs d’espèce :

Gal d 1, Bos d

lactoferrine, Fel d 1,

Fel d 4, Can f 1, Mus

m 1, Alt a 1

Tropomyosine : Der p 10

Der p 1, Der f 1, Der f

2, Der p 2, Eur m 2

B. Julien (18 ans)

Grâce au CRD, nous trouvons des explications :

Nombreuses allergies alimentaires dues à la sensibilisation aux profilines,

protéines PR-10 (OAS), tropomyosine (fruit de mer), lait de vache…

Nombreuses graminées, acariens, animaux domestiques… qui expliquent

la rhinite perannuelle exacerbée durant le période pollinique.

(38)

Les désensibilisations

Intérêts des allergènes recombinants

• _{Pollen de bouleau : différents}

allergènes.

–

_{rBet v 1 (t215) : majeur, PR10,}

OAS, reconnu par 95% des

allergiques au bouleau.

–

_{rBet v 2 (t216) : mineur,}

profiline.

–

_{rBet v 4 (t220) : mineur, CaBP.}

• _{rBet v 1 !!}

–

_{Immunothérapie spécifique}

plus efficace si

monosensibilisé au bouleau.

R. Valenta, Diagnostic tests based on recombinant allergens:Assistants for the selection of allergy

therapies -New horizons- 2002,vol1

(39)

Les désensibilisations

Intérêts des allergènes recombinants

• _{Données récentes}

• _{746 patients en cours de désensibilisation (bouleau ou graminées), recul de 2}

années.

(40)

Mais

...

(41)

L’allergie moléculaire

-AM-a un coût...

• _{Limitation INAMI lors de la prescription :}

–

_{Maximum 6 allergènes remboursés / prise de sang / 24h.}

–

_Chaque

_allergène

_{supplémentaire}

_est

_facturé

_à

_8€13

_au

_patient.

Mixture, extrait, composant => Même prix, même limitation !

• _{Une même source allergénique = parfois 5 composants à tester...}

=> multiplication des tests pour faire de l’allergie moléculaire.

(42)

• _{Aucune étude : coût du diagnostic des allergies avec emploi de la puce ISAC}

• _{Une seule étude coût/efficacité}

–

_{l'analyse coût-efficacité en faveur des dosages IgE (AM) + SPT versus anamnèse}

sans autres tests

(Walsh J et al, Br J Gen Pract 2011)

–

_{Prévoir études plus approfondies.}

• _{Comment choisir quelle technique ?}

–

_{Considérer le nombre d'allergènes à tester, évaluer le prix (selon prix local et}

système de remboursement)

–

_{Selon pays, si > 10 à 12 allergènes => multiplexe préférable ?}

• _{Biopuces concurrence aux TC ?}

_{Mari A et al, Curr Allergy Asthma Rep 2010}

–

_{Réduit le nombre d'étapes avant d'atteindre le diagnostic final.}

–

_{Les coûts indirects de diagnostic de l'allergie pourraient être réduits.}

Multiplexes

Réflexions économiques

(43)

Allergie moléculaire

Recommandations

 Guide de l’AM

(indication, interprétation, diagnostic)

pour les allergologues.

 Evolution rapide : les cliniciens sont tenus de suivre le rythme.

• Allergie moléculaire

–

Diagnostic de l'allergie + précis.

–

Pronostic.

–

3 intérêts majeurs :

1. Meilleure compréhension des réactions croisées chez les patients

polysensibilisés.

2. Evaluation du risque : réactions systémiques versus locales dans l'allergie

alimentaire, anxiété du patient et la nécessité TPO alimentaire.

3. Identifie des candidats pour l'immunothérapie spécifique.

(44)



Multiplexes, peu de sérum (pédiatrique).



Fournit un profil de sensibilisation via un large panel de composants allergéniques



ISAC + anamnèse clinique : Remplacement de la provocation ?

Jing lin et al, J Allergy clin

Immunol 2012 (Equipe de Sampson)



De la provocation en soi...

Allergie moléculaire

(45)



Multiplexes, peu de sérum (pédiatrique).



Fournit un profil de sensibilisation via un large panel de composants allergéniques



Allergologue averti :



Fournit des sensibilités imprévues.



Attention aux FN (noix de cajou, sésame...)



Interprétation de nombreux résultats



Relevance clinique des sensibilisations & clinique du patient



Plusieurs critiques :

–

le coût du système,

–

le manque d’automatisation...

...

ma foi, ce n’est un souci que pour le labo

–

mélange d’allergènes indésirables,

–

tous les allergènes sources / molécules ne sont représentées.



Des programmes d'éducation sur l'utilisation et l'interprétation de AM sont nécessaires.



L'utilité clinique de la plupart des molécules allergèniques doit être approfondie.

Allergie moléculaire

(46)



                                   

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                    

Demander un ISAC...

oui mais...

(47)

WAO

Etudes : performance ISAC

• _{Bonne reproductibilité.}

–

_{Attention si faibles taux d' IgE (0,3-1 ISU) : plus grande variabilité.}

(48)

WAO

Etudes : performance ISAC

• _{Comparaison ISAC vs singleplex}

(

_{donnée comparative ImmuLite ou HyTech)}

–

_{Concordance variable selon les allergènes testés (ISAC version 103).}

 ISAC (version 112) : résolution de certaines divergences.

–

_{ISAC 0,3-100 ISU (semi-quantitatif) versus CAP en kU/L (quantitatif), pas interchangeables.}

–

_{CAP : liaison des IgE dans des conditions d'excès d’allergène versus ISAC utilise de}

(49)

WAO

Etudes : performance ISAC

• _{Variabilité inter-essai élevée pour ISAC :}

–

_{Pas recommandé pour le suivi des taux d'IgEs au cours du temps.}

• _{Etudes en faveur de l’ISAC :}

–

_{Améliore le diagnostic de l'allergie.}

–

_{Permet la gestion optimisée des SIT.}

–

_{Evalue la marche allergique et la sensibilisation dans les stades précliniques}

–

_...