© Lauriane Vélot, 2019
Analyse protéomique des réseaux de signalisation du
récepteur aux androgènes modulés par l'Enzalutamide
dans le cancer de la prostate résistant à la castration
Thèse
Lauriane Vélot
Doctorat en biologie cellulaire et moléculaire
Philosophiæ doctor (Ph. D.)
Analyse protéomique des réseaux de signalisation du
récepteur aux androgènes modulés par l’Enzalutamide
dans le cancer de la prostate résistant à la castration
Thèse
Lauriane Vélot
Sous la direction de :
Dr Nicolas Bisson, directeur de recherche
Dr Frédéric Pouliot, codirecteur de recherche
iii iii
Résumé
Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les hommes au Canada et demeure la troisième cause de mortalité par cancer. Le récepteur aux androgènes (AR) est un récepteur nucléaire qui appartient à la superfamille des récepteurs stéroïdiens. AR est un facteur de transcription, dont ses gènes cibles sont impliqués dans la prolifération et la survie des cellules prostatiques. La signalisation androgénique, via les androgènes et le AR, joue donc un rôle central dans le développement normal et pathologique de la prostate. Les patients métastatiques sont d’abord castrés puis traités par des anti-androgènes. Cependant, la majorité des CaP deviendront résistants à la castration (CRPC). Bien que de nouvelles thérapies, telles que l’Enzalutamide (Enza), aient été développées, les patients développeront des résistances et décèderont invariablement de leur maladie à court terme. L’objectif de nos études était de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la régulation de la signalisation du AR dans les CRPC, afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de prédire la réponse des patients à l’Enza. Nous avons utilisé deux techniques innovantes de protéomique. D’abord par une approche de biotinylation de proximité (BioID), nous avons identifiés 32 partenaires du AR dans des cellules de CaP non stimulées, dont 17 ne sont pas recensés à ce jour dans la littérature. De plus, après stimulation androgénique, le réseau du AR est étendu à 262 protéines, incluant 215 nouveaux interacteurs. De façon intéressante, nous avons démontré que la protéine Krüppel-like factor 4 (KLF4), un nouvel interacteur du AR après stimulation, réprime l’activité transcriptionnelle de celui-ci. Par ailleurs, via une approche de phosphoprotéomique quantitative, nous avons mis en évidence 26 protéines (42 phosphosites distincts) qui présentent des changements de phosphorylation dans des lignées de CaP résistantes à l’Enza par rapport à une lignée sensible. De plus, nous avons identifié six protéines (pour sept sites de phosphorylation) dont la phosphorylation est augmentée à la fois chez un patient ayant un CaP de score de Gleason 9 et dans une lignée résistante à l’Enza, en tant que biomarqueurs potentiels. Nos travaux nous ont ainsi permis de mettre en évidence des protéines qui sont impliquées dans la régulation des réseaux de signalisation du AR après stimulation androgénique ou dans la résistance à l’Enza. Par conséquent, ces candidats pourraient devenir des cibles thérapeutiques alternatives pour le traitement du CRPC et participer à l’amélioration de la prise en charge des patients.
iv iv
Abstract
Prostate cancer (PCa) is the most frequently diagnosed cancer in Canadian men and is the third cause of cancer mortality. The Androgen Receptor (AR) is activated by androgens, leading to prostatic cell proliferation and survival. The primary treatment for advanced PCa is thus androgen-deprivation therapy, which may be achieved via surgical or chemical castration. Nevertheless, most PCas become castration-resistant (CRPC). Although new anti-androgens (e.g. Enzalutamide) were developed to improve patients’ survival, their efficacy remains very limited and most CRPC patients die from the disease within a few years. We postulated that by gaining insights into AR signalling networks in the context of CRPC, we could better direct patients towards the best-suited therapy and propose new therapeutic targets. To achieve this, we took advantage of two innovative proteomic approaches to characterize global AR signalling networks. First, using proximity-labeling assay (BioID), we identified 32 AR-associated proteins in non-stimulated cells, 17 of which were not previously reported. Upon androgenic stimulation, the AR signalling network increased to 262 proteins, including 215 previously unreported partners. Interestingly, we identified the transcription factor KLF4 and found that it acts as a repressor of AR target genes transcription. Second, using quantitative phosphoproteomic analyses, we observed 26 phosphoproteins (from 42 peptides) whose phosphorylation is modulated in Enza-resistant PCa cells. Moreover, we identified 7 phosphosites (on 6 proteins) that are more abundant in high grade cancer biopsies and in Enza-resistant cells. These proteins could become potential biomarkers. Taken together, our data highlight new potential drug targets that may be relevant for the acquisition or the prediction of Enza resistance. These studies will lead to the development of new predictive tools as well as to the discovery of alternative therapeutic targets for CRPC.
v v
Table des matières
Résumé ... iii
Abstract ... iv
Table des matières ... v
Liste des figures ... xi
Liste des tableaux ... xiii
Liste des abréviations ... xiv
Remerciements ... xvii
Avant-propos ... xx
1. INTRODUCTION ... 1
1.1. Le récepteur aux androgènes ... 1
1.1.1. Stéroïdogenèse ... 1
1.1.1.1.
Voie hypothalamo-hypophysaire testiculaire ... 1
1.1.1.2.
Voie hypothalamo-hypophysaire surrénalienne ... 3
1.1.1.3.
Testostérone et DHT ... 3
1.1.2. Récepteurs nucléaires ... 4
1.1.3. Structure du AR ... 6
1.1.3.1.
Domaine N-terminal ... 8
1.1.3.2.
Domaine de liaison à l’ADN et région charnière ... 9
1.1.3.3.
Domaine de liaison au ligand ... 10
1.1.4. Signalisation génomique du AR ... 12
1.1.4.1.
Fixation du ligand et translocation nucléaire ... 12
1.1.4.2.
Activation transcriptionnelle ... 13
1.1.4.3.
Export nucléaire ... 14
1.1.5. Signalisation non génomique du AR ... 14
1.1.5.1.
Activation de la voie PI3K/AKT ... 15
1.1.5.2.
Activation de la voie MAPK/ERK ... 16
1.1.6. Modifications post-traductionnelles du AR ... 16
1.1.6.1.
Phosphorylation ... 17
vi vi 1.1.6.3.
Méthylation ... 19
1.1.6.4.
SUMOylation ... 19
1.1.6.5.
Ubiquitinylation ... 20
1.1.7. Les réseaux signalétiques du AR ... 20
1.1.7.1.
Approches protéomiques ... 21
1.1.7.2.
Partenaires du AR ... 22
1.1.7.2.1.
Composants de la machinerie transcriptionnelle générale ... 22
1.1.7.2.2.
Facteurs de transcriptions spécifiques ... 23
1.1.7.2.3.
Corégulateurs du AR ... 23
1.2. Le cancer de la prostate ... 25 1.2.1. Épidémiologie ... 25 1.2.2. Facteurs de risque ... 25 1.2.2.1.
Âge ... 26
1.2.2.2.
Antécédents familiaux ... 26
1.2.2.3.
Ethnicité ... 27
1.2.2.4.
Facteurs exogènes ... 27
1.2.3. Histologie physiologique de la prostate ... 28
1.2.4. Diagnostic du cancer de la prostate ... 29
1.2.4.1.
Bilan clinique ... 30
1.2.4.1.1.
Symptômes ... 30
1.2.4.1.2.
Toucher rectal ... 30
1.2.4.2.
Bilan biochimique ... 31
1.2.4.2.1.
Dosage de la PSA totale ... 31
1.2.4.2.2.
Dosages dérivés de celui de la PSA ... 32
1.2.4.2.3.
Biomarqueurs urinaires ... 33
1.2.4.2.4.
Autres marqueurs ... 34
1.2.4.3.
Bilan anatomopathologique ... 35
1.2.4.3.1.
Score de Gleason ... 35
1.2.4.3.2.
Classification TNM ... 38
1.2.4.4.
Bilan d’extension : imagerie complémentaire ... 39
1.2.4.4.1.
Tomodensitométrie (CT-Scan) ... 39
1.2.4.4.2.
IRM multiparamétrique ... 40
1.2.4.4.3.
PET-scan à la choline ... 40
1.2.4.4.4.
Scintigraphie osseuse ... 41
vii vii
1.3.1. Surveillance active ... 42
1.3.2. Traitements locaux ... 43
1.3.2.1.
Chirurgie : prostatectomie radicale ... 43
1.3.2.2.
Radiothérapie ... 45
1.3.2.2.1.
Radiothérapie externe ... 46
1.3.2.2.2.
Curiethérapie ... 46
1.3.2.3.
Thérapie focale ... 47
1.3.3. Traitements systémiques ... 48 1.3.3.1.
Castration chirurgicale ... 48
1.3.3.2.
Castration chimique ... 49
1.3.3.2.1.
Analogues de la LHRH ... 49
1.3.3.2.2.
Antagonistes de la LHRH ... 50
1.3.3.3.
Effets indésirables de la castration ... 50
1.3.3.4.
Anti-androgènes ... 51
1.3.3.4.1.
Anti-androgènes stéroïdiens ... 51
1.3.3.4.2.
Anti-androgènes non stéroïdiens ... 52
1.4. La progression en cancer de la prostate résistant à la castration et résistant aux traitements ... 53
1.4.1. Définition du CRPC ... 53
1.4.2. Chimiothérapie cytotoxique ... 53
1.4.2.1.
Docetaxel ... 54
1.4.2.2.
Cabazitaxel ... 55
1.4.3. Hormonothérapie de seconde génération ... 55
1.4.3.1.
Abiraterone ... 55
1.4.3.2.
Enzalutamide ... 56
1.4.3.2.1.
Mode d’action ... 56
1.4.3.2.2.
Études AFFIRM et PREVAIL ... 58
1.4.4. Autres traitements du CRPC métastatique ... 59
1.4.4.1.
Traitements ciblant les tissus osseux ... 59
1.4.4.1.1.
Traitements médicamenteux antalgiques ... 59
1.4.4.1.2.
Traitements par radiothérapie ... 59
1.4.4.2.
Immunothérapies ... 60
1.4.5. Résistance après traitement à l’Enzalutamide ... 62
1.4.5.1.
Résistance dépendante du AR ... 62
viii viii 1.4.5.1.2.
Mutations ponctuelles du AR ... 63
1.4.5.1.3.
Variants d’épissage du AR ... 65
1.4.5.1.4.
Altération de la stéroïdogenèse ... 67
1.4.5.2.
Résistance indépendante du AR ... 67
1.4.5.2.1.
Différenciation neuroendocrinienne ... 67
1.4.5.2.2.
Activation de récepteurs alternatifs ... 68
1.4.5.2.3.
Dérégulation de l’interaction AR/cofacteurs ... 69
1.4.5.2.4.
Activation de voies alternatives ... 70
1.5. Problématique, hypothèse et objectifs ... 72
2. CHAPITRE 1 : Proximity labeling proteomics of the androgen receptor reveals Kruppel-Like Factor 4 as a repressor of androgen-dependent genes ... 73
2.1. Avant-propos ... 74
2.2. Résumé ... 75
2.3. Abstract ... 76
2.4. Introduction ... 77
2.5. Résultats ... 79
2.5.1. BioID proximity labelling identifies known and novel AR-associated proteins. ... 79
2.5.2. KLF4 acts as a repressor for AR target genes ... 82
2.6. Discussion ... 85
2.7. Matériel et Méthode ... 87
2.7.1. Plasmid constructions and adenoviral production ... 87
2.7.2. Cell culture and transfection ... 88
2.7.3. Cell lysis and BioID proximity labeling ... 88
2.7.4. Western Blotting and antibodies ... 89
2.7.5. Luciferase assay ... 89
2.7.6. RT-qPCR assay ... 90
2.7.7. Immunofluorescence and microscopy ... 90
2.7.8. Experimental Design and Statistical Rationale ... 91
2.7.9. Mass spectrometry ... 91
2.7.10. Data availability ... 92
ix ix
2.9. Données supplémentaires ... 93
2.9.1. Supplementary figure ... 93
2.9.2. Supplementary tables ... 94
3. CHAPITRE 2 : Les réseaux de phosphorylation sont dérégulés dans le CRPC lors de la résistance à l’Enzalutamide ... 102
3.1. Introduction ... 102
3.2. Résultats ... 104
3.2.1. Mise au point d’une technique d’enrichissement des phosphopeptides 104 3.2.2. La phosphorylation des protéines est augmentée après stimulation à la DHT…... ... 105
3.2.3. La résistance à l’Enza entraîne un changement du phosphoprotéome ... 109
3.2.4. Les protéines dont la phosphorylation est régulée dans des lignées résistantes à l’Enza sont impliquées dans différents processus biologiques ... 113
3.2.5. L’utilisation d’une seule biopsie de patient est suffisante pour identifier des phosphopeptides par MS ... 116
3.2.6. Des sites de phosphorylation sont communs entre une biopsie d’un patient à risque élevé de récidive et des lignées cellulaires résistantes à l’Enza 119 3.3. Discussion ... 121 3.4. Matériel et Méthodes ... 125 3.4.1. Culture cellulaire ... 125 3.4.1.1.
Lignées cellulaires ... 125
3.4.1.2.
Marquage SILAC ... 125
3.4.1.3.
Traitements ... 125
3.4.2. Échantillons de patients ... 125 3.4.3. Lyse ... 126 3.4.3.1.
Lyse cellulaire ... 126
3.4.3.2.
Lyse de biopsies ... 126
3.4.4. Digestion trypsique ... 126
3.4.5. Dessalage des peptides ... 127
3.4.6. Enrichissement des phosphopeptides ... 127
3.4.7. Spectrométrie de masse ... 128
3.4.7.1.
OrbiTrap Fusion ... 128
x x 3.4.8. Analyses Statistiques ... 129 3.5. Données supplémentaires ... 130 3.5.1. Figure supplémentaire ... 130 3.5.2. Tableaux supplémentaires ... 131 4. DISCUSSION ET CONCLUSION ... 140
4.1. Les réseaux de signalisation du AR sont modifiés en fonction du traitement dans des lignées de CaP qui expriment un AR non muté ... 140
4.1.1. Après stimulation androgénique, 221 nouveaux partenaires interagissent avec AR dans des cellules de CaP ... 140
4.1.2. Quatre nouveaux partenaires interagissent spécifiquement avec AR après traitement à l’Enza ... 145
4.1.3. Quel avenir pour des anti-androgènes de nouvelle génération? ... 148
4.2. Le facteur de transcription KLF4 agit comme un répresseur des gènes cibles du AR dans des lignées sensibles aux androgènes et à l’Enza ... 150
4.3. La régulation du phosphoprotéome dans des modèles de CaP révèle des biomarqueurs potentiels de la résistance à l’Enza ... 153
4.4. La régulation signalétique du AR permet d’identifier des partenaires dont la phosphorylation est modulée dans la résistance à l’Enza ... 157
4.5. Quelle peut-être l’importance de ces candidats dans d’autres pathologies où la voie du AR est impliquée ? ... 159
4.5.1. Le cancer du sein ... 160
4.5.2. Le cancer de la vessie ... 160
4.5.3. Le cancer des glandes salivaires ... 162
4.6. Conclusion générale ... 163
xi xi
Liste des figures
INTRODUCTION :
Figure 1.1 : Synthèse des androgènes. ... 2
Figure 1.2 : Structure générale des récepteurs nucléaires. ... 5
Figure 1.3 : Structure du gène et de la protéine du AR. ... 7
Figure 1.4 : Voie génomique du AR. ... 13
Figure 1.5 : Voie non génomique du AR. ... 15
Figure 1.6: Modifications post-traductionnelles du AR. ... 17
Figure 1.7 : Anatomie de la prostate. ... 28
Figure 1.8 : Score de Gleason. ... 36
Figure 1.9: Mode d’action de l’Enzalutamide ... 57
Figure 1.10 : Séquence thérapeutique de la prise en charge du CaP. ... 61
Figure 1.11: Mécanismes généraux de résistance. ... 62
Figure 1.12 : Résistances dépendantes du AR. ... 65
Figure 1.13 : Activation du récepteur aux glucocorticoïdes. ... 69
Figure 1.14 : Activation de voies alternatives. ... 71
CHAPITRE 1 :
Figure 2.1: LAPC4 stable cell lines express a functional Flag-BirA*-AR chimera. 79 Figure 2.2: BioID proximity labelling reveals known and novel AR-associated proteins. ... 81Figure 2.3: KLF4 depletion does not affect AR expression but increases its transcriptional activity ... 83
Figure 2.4: KLF4 acts as a repressor of AR target genes ... 85
Figure 2.S1: KLF4 does not increase AR localization to the nucleus ... 93
CHAPITRE 2 :
Figure 3.1 : Le protocole d’enrichissement mis au point permet d’identifier une augmentation du nombre de protéines phosphorylées après stimulation à la DHT dans des lignées sensibles aux hormones. ... 107xii xii
Figure 3.2 : La résistance à l’Enza régule la phosphorylation de nombreux résidus identifiés après quantification. ... 109 Figure 3.3 : La résistance à l’Enza régule la phosphorylation des protéines exprimées dans des cellules résistantes. ... 112 Figure 3.4 : Les protéines dont la phosphorylation est régulée dans la résistance à l’Enza sont impliquées dans différents processus biologiques et voies de signalisation. ... 115 Figure 3.5 : L’utilisation d’une seule biopsie de patient est suffisante pour identifier des sites de phosphorylations dont certains sont communs avec des lignées résistantes à l’Enza. ... 118 Figure 3.S1 : Les lignées MR49F sont résistantes à l’Enza ... 130
DISCUSSION :
Figure 4.1 : AR interagit avec 64 protéines après traitement à l’Enza. ... 145 Figure 4.2 : L’expression de KLF4 est modulée dans une lignée résistante à l’Enza ... 153
xiii xiii
Liste des tableaux
INTRODUCTION :
Tableau 1.1 : Rôles fonctionnels des différents sites phosphorylés du AR. ... 18 Tableau 1.2 : Classification TNM. ... 39
CHAPITRE 1 :
Table 2.S1 : List of BioID identified peptides and proteins, as well as calculated SAINT scores. ... 94 Table 2.S2 : List of essential genes in LNCaP PCa cells (according to Fei et al.,) found in our BioID experiments and presented in Figure 2.2. ... 100
CHAPITRE 2 :
Tableau 3.S1 : Sites dont la phosphorylation est augmentée dans les LNCaP (ratio H/M). ... 131 Tableau 3.S2 : Sites dont la phosphorylation est augmentée dans les LAPC4 (ratio M/L). ... 131 Tableau 3.S3 : Sites dont la phosphorylation est augmentée dans les MR42D (ratio M1L) et MR49F (ratio H/L). ... 133 Tableau 3.S4 : Sites dont la phosphorylation est diminuée dans les MR42D (ratio M/L) et MR49F (ratio H/L). ... 135
xiv xiv
Liste des abréviations
17β-HSD : 17β-hydroxystéroïde déshydrogénase 3D : tridimensionnelle
3β-HSD : 3β-hydroxystéroïde déshydrogénase ABC : Bicarbonate d’Ammonium
ACN : Acétonitrile
ACT : α1-antichymotrypsine
ACTH : hormone adrénocorticotrope ADT : déprivation androgénique
AFFIRM : Safety and Efficacy Study of MDV3100 in Patients With Castration-Resistant Prostate Cancer Who Have Been Previously Treated With Docetaxel-based
Chemotherapy
AGR2 : Anterior Gradient-2
AJCC : American Joint Committee on Cancer AMPc : Adénosine monophosphate cyclique AP : purification d’affinité
AR : récepteur aux androgènes
ARE : éléments de réponse androgénique ARNm : ARN messager
AS : surveillance active
ASAP : Apoptosis and splicing associated protein BioID : biotinylation de proximité
BPH : hyperplasie bénigne de la prostate BT : curiethérapie
CaP : cancer de la prostate CBP : CREB-binding protein
CDK : Cyclin-dependent-like kinase
CHAARTED : ChemoHormonal Therapy vs Androgen Ablation Radomized Trial for Extensive Disease in prostate cancer
CPA : acétate de cyprotérone
CPRT : radiothérapie conventionnellement fractionnée CRPC : cancer de la prostate résistant à la castration CTC : cellules tumorales circulantes
ctDNA : ADN libre circulant CTE : extension C-terminale CTNNA1 : α-caténine
CYP17A1 : 17α-hydrolase/17,20 lyase DBD : domaine de liaison à l’ADN DBN1 : Debrin
DHEA : déhydroépiandrostérone DHT : Dihydrotestostérone DMSO : diméthylsulfoxide
DNA-PK : DNA-dependent protein kinase DRE : toucher rectal
DTT : Dithiothreitol
DUB : enzymes déubiquitinylantes EBRT : External Beam Radiotherapy
xv xv Enza : Enzalutamide
ERG : ets erythoblastosis virus E26
ERK : extracellular signal regulated kinase
ERSPC : European Randomized Study of Screening for Prostate Cancer FA : Acide formique
FASN : Fatty Acid Synthase FBS : fetal bovine serum
FDA : Food and Drug Administration FSH : hormone folliculo-stimulante
GnRH : Gonadotropin Releasing Hormone GO : Gene Ontology
GR : récepteur aux glucocorticoïdes GRHL2 : Grainyhead-like 2
GTF2F1 : facteur de transcription générale IIF Gy. Gray
HAT : histones acétyltransférases HDAC : histones désacétylases HEK : human embryonic kidney
HER : Human Epidermial growth factor Receptor HFRT : radiothérapie hypo-fractionnée
HK2 : kallikréine 2 humaine HR : région charnière
HRE : éléments de réponse hormonale Hsp : protéines de choc thermique IAA : Iodoacetamine
IMPACT : IMmunotherapy for Prostate Adenocarcinoma Treatment IP : immunoprécipitation
IRM : imagerie par résonnance magnétique
ISUP : International Society of Urological Pathology KLF4 : Krüppel-like factor 4
LBD : domaine de liaison au ligand LH : hormone lutéinisante
LHRH : Luteinizing Hormone Releasing Hormone
MALDI-TOF : matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MAPK : Mitogen-activated protien kinase, : mitogen-activated protein kinase MDC1 : Mediator of DNA checkpoint protein
MS : spectrométrie de masse
NCOR1 : Nuclear receptor CORepressor 1 NEPC : cancers de la prostate neuroendocriniens NES : signal d’exportation nucléaire
NLS : signal de localisation nucléaire NTD : région N-terminale
OMS : Organisation Mondiale de la Santé PAP : phosphatase acide de la prostate
PARP : Poly (adenosine 5′‐diphosphate) ribose polymerase PCa : prostate cancer
PCA3 : antigène 3 du cancer de la prostate PET : émission de positron
PHI : Prostate Health Index PI3K : phosphoinositol-3 kinase PIN : néoplasie intra-épithéliale
xvi xvi PIP3 : phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate
PIVOT : Prostate Cancer Intervention Versus Observation Trial
PLCO : Randomized Prostate, Lung, Colorectal and Ovarian Cancer Screening
PREVAIL : A Safety and Efficacy Study of Oral MDV3100 in Chemotherapy-Naive Patients With Progressive Metastatic Prostate Cancer
PSA : antigène prostatique spécifique
QQQ-MS : spectromètre de masse triple quadripôle RANKL : Receptor Activator of Nuclear factor-KB Ligand REST : Repressor Element-1 Silencing Transcription factor RIME : rapid immunoprecipitation MS of endogenous proteins RN : récepteur nucléaire
RP : prostatectomie radicale RT : radiothérapie
SAINT : Significance Analysis of INTeractome SBRT : radiothérapie stéréotaxique
SDC : Sodium desoxycholate SH2 : Src Homology 2
SHBG : Sex Hormone Binding Globulin
SILAC : Stable Isotope Labelling of Amino acids in Cell culture
SPARTAN : Selective Prostate Androgen Receptor Targeting with ARN-509 SPCG4 : Scandinavian Prostate Cancer Group-4
SRM : selected reaction monitoring
SRRM1 : Serine/arginine repetitive matrix protein 1
STAMPEDE : Systemic Therapy in Advancing or Metastatic Prostate cancer : Evaluation of Drug Efficacy
StAR : Steroidogenic Acute Regulatory protein
STAT3 : Signal Transducer and Activator of Transcription 3 SVF : sérum de veau foetal
SWOG : Southwest Oncology Group TDM : tomodensitométrie
TFA : Acide Trifluoroacétique TiO2 : dioxyde de titane TMA : Tissue micro-array
TMPRSS2 : Transmembrane protease serine 2 TSEN : tRNA splicing endonuclease
xvii xvii
Remerciements
Mon doctorat fut une belle expérience enrichissante qui m’a permis de murir à la fois dans ma réflexion scientifique et dans ma vie personnelle. Je remercie donc toutes les personnes que j’ai côtoyées, qui m’ont supportées et accompagnées durant cette aventure québécoise.
Plus particulièrement, je tiens tout d’abord à remercier mon directeur de recherche, le Dr Nicolas Bisson, et mon co-directeur de recherche, le Dr Frédéric Pouliot pour m’avoir donné l’opportunité de faire mon doctorat dans leurs laboratoires. Merci de votre confiance, de votre soutien tout au long de ces années. Vous m’avez laissé une autonomie rare que j’ai appréciée à sa juste valeur, tout en étant toujours présent si le besoin s’en faisait ressentir. Vous m’avez poussé à me dépasser, notamment en me soutenant dans mes demandes de bourses, mon implication associative, en me faisant participer à de nombreux congrès. Alors merci, parce que j’ai gagné en confiance et assurance grâce à tout ça.
Je remercie également les membres de mon jury, Dre Chantal Guillemette, Dr Paul Toren et Dr David Labbe, qui ont accepté de lire et d’évaluer mon travail. Merci également au Dre Guillemette de m’avoir suivie tout au long de ces années de thèse, aussi bien en tant qu’étudiante qu’en tant que membre du comité de direction du centre de recherche.
Je me suis également épanouie grâce à mon implication au sein du comité étudiant, alors je remercie tout particulièrement Émilie et Chelsea qui m’ont dès le début accueillie, formée et secondée dans mon rôle de co-responsable du comité des activités, puis du comité étudiant. Je remercie également mon cher acolyte Jean-Clément pour nos innombrables réunions, activités, organisations communes, souvent autour d’une bière et parfois avec de belles prises de têtes, mais toujours dans la bonne humeur! Je remercie également Pascale pour avoir pris le relais, pour sa gentillesse, sa disponibilité, sa réactivité et nos bons partys ; ainsi que tous les membres du comité étudiant, avec qui nous avons réalisé de belles choses, dont notamment LabOpatient, une soirée de vulgarisation grand public qui me tenait particulièrement à cœur. Je remercie également les membres du comité de direction du CRC pour leur écoute, leur respect, et la confiance dont ils ont fait preuve lors de nos réunions au cours de ces années.
Je remercie mes deux laboratoires d’accueil qui m’ont fait me sentir chez moi aussi bien dans l’un que dans l’autre laboratoire. En tout premier, je ne peux que remercier les PPR hors pairs
xviii xviii
avec qui j’ai eu le plaisir de travailler. Merci au Dr François Chartier pour sa disponibilité, son écoute et ses conseils toujours avisés. Le laboratoire de Nicolas ne serait pas pareil sans toi, alors merci pour tout. Je remercie également le Dr Bertrand Neveu, qui a toujours pris le temps de s’asseoir et de chercher des solutions à mes problèmes. Merci Bertrand de ta gentillesse, de toutes tes « petites gâteries » régulières, pour notre passion commune du chocolat et nos débats en pièce culture! Ce fut un réel plaisir de travailler à tes côtés, même avec ton humour particulier et ma musique de maestro ! Merci aussi au Dre Mélanie Rouleau, plus fraichement arrivée mais qui s’est de suite intégrée et impliquée dans mon projet. Merci pour tes nombreuses relectures, tes précieux conseils, de ton temps et de ton écoute. Merci de m’avoir remotivée quand le besoin s’en est fait ressentir ! Je tenais également à remercier Maxime Côté, notre PPR d’adoption comme dirait Alice, pour son accueil dans le laboratoire quand j’ai fait des expériences au 2ème, pour toutes ses histoires et ses blagues, pour l’ambiance du vendredi imbattable dans le bureau. Merci Maxime pour ta patience et ta prévenance.
Je remercie aussi chaleureusement tous les étudiants, passés ou présents, avec qui j’ai eu le plaisir de travailler. Merci plus particulièrement à Ugo et Noémie pour leur bonne humeur quotidienne, nos discussions scientifiques et pour avoir apporté une bonne ambiance au sein du laboratoire ! Je remercie Audrey avec qui nous avons partagé de bons moments scientifiques et personnels. Merci d’avoir toujours été là, disponible, à l’écoute et à la recherche de solutions, même quand la situation semblait désespérée. J’ai une pensée également pour Vanessa, stagiaire d’été avec qui j’ai partagé de bons moments d’échanges. Merci aussi au Dre Pallavi Jain, qui m’a formée à mes débuts et avec qui on s’est bien pris la tête pour nos essais de prolifération. Merci pour ton écoute, tes conseils, et ton expérience de première doctorante. Également merci à tous les autres étudiants ou plus du 1er étage : Oscar, Marjorie, Clovis, Denise, Fanny, Jean-François. Je remercie également tous les membres d’Uro-Onco pour leur accueil, leur gentillesse, leurs conseils et plus particulièrement les Dr Alain Bergeron, Dre Karine Robitaille et Valérie Picard.
Je ne peux que remercier sincèrement toutes les amitiés qui se sont tissées aux fils des ans et qui ont fait de cette expérience une histoire unique. Sans vous, rien n’aurait été pareil ! Merci à mes deux docteures préférées, je suis tellement fière de vous les filles ! Merci Dre Alice Beigbeder d’avoir été une collègue hors norme, de tes innombrables relectures, avec parfois des délais plus que déraisonnables, de ton soutien dans les moments plus compliqués, de toutes nos bières du mercredi ! Merci d’être ma jumelle cosmique, tout simplement ! Merci Dre Imène Boudaoud d’avoir été une deuxième maman pour moi, d’avoir toujours pris le temps de m’écouter, de me conseiller, de t’inquiéter pour moi ! Merci pour tous nos moments passés
xix xix
ensemble, du dimanche au labo au craquage shopping. Merci à Khalid et toi pour ma place sur le canapé, que j’ai retrouvé avec plaisir en France, et qui fait que je me sens chez moi chez vous ! Merci également à Laurent pour m’avoir nourrie quand nécessaires et surtout pour ton amitié à rebrousse-poil ! Merci également à mes ppf d’amours, Alice, Imène et Carole, qui ont su me supporter, me réconforter, m’accompagner tout au long de ces années aussi bien dans les réussites que les échecs! Sans nos soirées, nos fins de semaines, nos délires, nos danses et nos idées folles, la vie n’aurait pas été la même, alors merci d’avoir été là ! Je remercie également Claire, Manu, Alex, Alice, Cornélia, Myriam, Gaëlle, Mélany, Clémence et Maëva qui ont toujours répondu présentes et avec qui fêter aussi bien les réussites que les évènements importants était un vrai bonheur ! Merci pour les repas du midi qui avaient le don de nous redonner de l’énergie pour le reste de la journée ! Merci à toute cette famille québécoise merveilleuse ! J’ai également une pensée pour les copines de France, notamment Christelle, Stéphie et Charlotte, qui ont bravé le froid et les tempêtes de neige pour venir me voir et qui ont fait en sorte que malgré la distance et mon emploi du temps surchargé, rien ne change !
Ces remerciements ne seraient pas complets sans mentionner ma famille. Plus particulièrement, merci à mes parents, qui m’ont soutenue, accompagnée tout du long et qui ont été présents même dans les moments de doutes ! Merci à mes sœurs et mon frère, AnnC, Manue, Alex et JB, qui ont toujours cru en moi et ont su me redonner de l’énergie et de la confiance. Merci également à mes beaux-parents qui ont finalement adopté le Québec et sa neige, même si ce n’était pas gagné d’avance.
Enfin, je remercie mon homme, qui dès le début m’a dit que faire une thèse à Québec, c’était une opportunité à saisir et qui jusqu’à la fin a été là. Merci pour tes 26 allers-retours en 4 ans pour venir me voir, pour ton soutien au quotidien, pour ta présence et ton amour inconditionnel. Merci d’avoir été autant dans cette aventure que moi, et de nous avoir permis d’avancer malgré les 6 000 km et un océan qui nous ont séparés!
Je souhaite dédier ma thèse à ma grand-mère et mon oncle qui sont parti trop tôt, mais qui ont su m’apporter la passion et la patience nécessaire pour l’aboutissement de ce travail.
xx xx
Avant-propos
Cette thèse est le fruit de quatre années d’études réalisées en co-direction dans les laboratoires des Drs Nicolas Bisson et Frédéric Pouliot. Mon projet de doctorat avait pour but d’identifier des nouvelles cibles thérapeutiques ou biomarqueurs dans le cancer de la prostate et plus particulièrement après traitement à l’Enzalutamide, un anti-androgène de seconde génération utilisé en clinique. Ma thèse est divisée en quatre parties. La première est une introduction générale qui présente les connaissances reliées au récepteur aux androgènes, au cancer de la prostate et aux traitements disponibles. Les deuxième et troisième parties de cette thèse correspondent à mes chapitres de résultats et détaillent les travaux de recherche que j’ai réalisés. Le chapitre 1 est rédigé en anglais et correspond à un article scientifique dont je suis le premier auteur, et qui s’intitule : Proximity labeling proteomics of the androgen
receptor reveals Kruppel-Like Factor 4 as a repressor of androgen-dependent genes. Il est
soumis au journal Molecular & Cellular Proteomics. J’ai réalisé l’ensemble des expériences et de l’analyse des données et participé à sa rédaction. Cet article a été l’objet d’une collaboration avec le laboratoire du Dr Steve Bilodeau, qui m’a permis d’utiliser leurs réactifs et leur expertise afin de réaliser les expériences de RT-qPCR. Le chapitre 2 est rédigé en français et montre que les réseaux de phosphorylation, caractérisés par analyse du phosphoprotéome de cellules cancéreuses humaines, sont dérégulés dans le cancer de la prostate résistant à la castration et résistant à l’Enzalutamide. J’ai réalisé l’ensemble des expériences. L’analyse des données de spectrométrie de masse, via le logiciel MaxQuant, a été faite en collaboration avec la plate-forme de l’Université de Sherbrooke du Dr François-Michel Boisvert. Et enfin, la quatrième partie est une discussion et une conclusion de cette thèse.
Au cours de mon doctorat, j’ai également participé à la rédaction d’un chapitre du livre
Methods in Molecular Biology qui présente une méthode innovante de préparation
d’échantillons pour la spectrométrie de masse et pour lequel je suis co-premier auteur ((Beigbeder, Vélot et al., 2016). J’ai également apporté mon aide pour l’avancée d’essais moléculaires spécifiques, publiés dans Scientific Reports (Jain et al., 2016) ou pour des articles qui sont soumis ou en préparation. De plus, j’ai participé à un projet en collaboration avec les équipes des Drs Josée N. Lavoie, Michel Lebel, René C. Gaudreault et Éric Biron, sur le développement d’une thérapie anti-cancéreuse plus efficace dans le cancer du sein.
1 1
1. INTRODUCTION
1.1. Le récepteur aux androgènes
Les androgènes sont des hormones stéroïdiennes essentielles pour induire la différentiation et la maturation des organes reproducteurs masculins, dont la prostate (Heinlein and Chang, 2004; Labrie, 2004; Mooradian et al., 1987). Les androgènes permettent également le maintien des fonctions reproductives chez l’homme adulte (Murashima et al., 2015; Chang et al., 2013). La fonction androgénique implique la fixation des androgènes à leur récepteur spécifique, le récepteur aux androgènes (AR) afin d’activer la signalisation AR-dépendante.
1.1.1. Stéroïdogenèse
La stéroïdogenèse permet la synthèse de cinq classes de stéroïdes actifs, qui sont les androgènes, les estrogènes, la progestérone, les glucocorticoïdes et les minéralocorticoïdes (Labrie, 2004). Il existe deux voies de production des hormones sexuelles mâles: la voie testiculaire majoritaire et la voie surrénalienne (Figure 1.1A).
1.1.1.1. Voie hypothalamo-hypophysaire testiculaire
L’hypothalamus sécrète différentes hormones, dont la LHRH (Luteinizing Hormone Releasing Hormone ou GnRH, Gonadotropin Releasing Hormone). La LHRH est sécrétée de façon pulsatile et se fixe à ses récepteurs spécifiques sur l’hypophyse afin de stimuler les cellules gonadotropes et ainsi permettre la sécrétion de l’hormone lutéinisante (LH), et dans un moindre degré de l’hormone folliculo-stimulante (FSH) (Miller, 2009; Nankin and Troen, 1971) (Figure 1.1A). La LH a pour rôle de stimuler la sécrétion d’androgènes par les cellules de Leydig alors que la FSH favorise la spermatogenèse.
A) Production des androgènes après sécrétion par l’hypothalamus de la LHRH qui va stimuler
l’hypophyse. La LH entraine la production de testostérone par les testicules, et l’ACTH permet la sécrétion de DHEA par les glandes surrénales. Les androgènes se retrouveront dans la circulation sanguine, puis la testostérone sera majoritairement convertie en DHT dans la prostate. B) Voie de synthèse des androgènes à partir du cholestérol. La voie bleue est la voie majoritaire Δ5 et la jaune la voie Δ4. Le rectangle jaune représente la synthèse des minéralocorticoïdes et du cortisol par les glandes surrénales.
2 2
Figure 1.1 : Synthèse des androgènes.
Une fois sécrétée, la LH se fixe à ses récepteurs spécifiques sur les cellules de Leydig dans le testicule, et permet ainsi la formation d’AMP cyclique (AMPc). L’AMPc active les protéines enzymatiques CYP11A1 qui permettent la conversion du cholestérol en prégnénolone. En effet, le cholestérol est le premier acteur de la voie de synthèse hormonale, et entre dans les mitochondries via les protéines de transport StAR (Steroidogenic Acute Regulatory protein) (Figure 1.1B). Le prégnénolone nouvellement synthétisé est envoyé au réticulum endoplasmique lisse. Il va ainsi être métabolisé selon
A
B
Cholestérol
Prégnénolone Prégnénolone17α-OH DHEA
Androsténédione CYP17A1 CYP17A1 3β-HSD Testostérone 17β-HSD DHT 5α-réductase Progestérone 3β-HSD 11-Désoxy corticostérone CYP21 17α-OH Progestérone CYP17A1 CYP17A1 Corticostérone CYP11B1/B2 Aldostérone CYP11B2 11-Désoxycortisol CYP21 Cortisol CYP11B1/B2 CYP11A1 5α-androsténédiole 3β-HSD 3β-HSD LH ACTH TESTOSTÉRONE CORTISOL Prostate DHT DHEA Circulation sanguine Hypothalamus Hypophyse LHRH Testicules Glande Surrénale TESTOSTÉRONE
3 3
deux voies, Δ5 et Δ4 (Yin and Hu, 2014; Mostaghel, 2013; Miller and Auchus, 2011; Rainey and Nakamura, 2008). La voie Δ5 passe par l’enzyme CYP17A1 (17α-hydrolase/17,20 lyase), dont l’expression est sous le contrôle de la LH, pour permettre la production de la déhydroépiandrostérone (DHEA). Cette dernière est ensuite convertie en 5α-androsténédiole, puis en testostérone par la 3β-hydroxystéroïde déshydrogénase (3β-HSD). La voie Δ4 quant à elle agit par la 3β-HSD, qui permet la production de progestérone, à son tour convertie en androsténédione par la CYP17A1, puis en testostérone par la 17β-hydroxystéroïde déshydrogénase (17β-HSD).
La testostérone ainsi produite est convertie par la 5α-réductase en dihydrotestostérone (DHT), l’hormone androgénique la plus active (Mostaghel, 2013; Labrie, 2004). Comme la progestérone est un faible substrat de la CYP17A, la voie préférentielle de synthèse de la testostérone est la voie Δ5 (Miller and Auchus, 2011).
La FSH, présente uniquement dans les cellules de Sertoli, va agir indirectement par la sécrétion d’IGF1, qui stimule la stéroïdogenèse, et de TGF-β inhibant cette voie de synthèse (Lubik et al., 2013; Miller and Auchus, 2011).
1.1.1.2. Voie hypothalamo-hypophysaire surrénalienne
L’hypophyse sécrète également l’hormone adrénocorticotrope (ACTH). L’ACTH se fixe sur ses récepteurs membranaires au niveau de la glande surrénale, et active ses trois zones, soient la zone glomérulée, la zone fasciculaire et la zone réticulaire (Han et al., 2014; Miller and Auchus, 2011) (Figure 1.1A). Cette activation entraîne une augmentation de la concentration en AMPc, qui active alors la conversion du cholestérol en prégnénolone, comme pour les testicules (Figure 1.1B). La prégnénolone est ensuite métabolisée en progestérone. En fonction de la zone de la glande surrénale, la progestérone induit la synthèse de l‘aldostérone et de la corticostérone (minéralocorticoïdes), du cortisol (glucocorticoïde) ou de la DHEA (androgène) (Yin and Hu, 2014; Mostaghel, 2013). La DHEA alors en circulation permet la synthèse de testostérone dans les tissus périphériques.
1.1.1.3. Testostérone et DHT
Les androgènes ont une action de rétrocontrôle négatif, en fonction du niveau circulant, principalement sur l’hypothalamus mais également au niveau hypophysaire (Figure 1.1A). La testostérone et la DHT entraînent ainsi un ralentissement de la libération de LH (Yin
4 4
and Hu, 2014; Winters et al., 1984). Ils n'exercent en revanche aucun rétrocontrôle sur la glande surrénale où le cortisol régule la sécrétion d’ACTH (Figure 1.1A).
La testostérone, hormone mâle majoritaire, est produite à 90-95% par les cellules testiculaires de Leydig, à 5-10% par les glandes surrénales, et de façon infinitésimale par le cerveau (Labrie, 2004; Winters et al., 1998). La testostérone se retrouve sous trois formes : libre (2%), faiblement liée à l’albumine (68%) et étroitement liée à la SHBG (Sex Hormone Binding Globulin) (30%) (Hsing, 2001; Winters et al., 1998). C’est sous forme libre ou liée à l’albumine qu’elle est bio-disponible. La DHT, qui est le produit réduit de la testostérone et l’androgène le plus actif, se retrouve majoritairement produit par la prostate (75%), tandis que les testicules en produisent moins de 25%. Ceci peut être expliqué par le fait qu’il y ait très peu de 5α-réductase exprimée dans les testicules (Mostaghel, 2013; Labrie, 2004). Les hormones stéroïdiennes nouvellement synthétisées sont capables de traverser la membrane plasmique et ainsi activer leur récepteur nucléaire (RN) spécifique directement dans la cellule (Sever and Glass, 2013).
1.1.2. Récepteurs nucléaires
Les RN représentent la plus importante classe de facteurs de transcription (Knoedler and Denver, 2014; Robinson-Rechavi et al., 2003) et ont été initialement découverts dans les années 1960 par Jensen et Jacobsen, puis clonés dans les années 1980 (Evans, 1988; Jensen, 1962). Ils ont un rôle essentiel dans la régulation des gènes impliqués dans le développement, la reproduction, la différentiation, le métabolisme et la mort cellulaire, suite à leur stimulation par des hormones ou autres ligands métaboliques (Sonoda et al., 2008; Lavery and Mcewan, 2005; Gronemeyer et al., 2004; Mangelsdorf et al., 1995). Ils jouent également un important rôle dans la régulation de certaines maladies, telles que le diabète, l’obésité, l’athérosclérose ou encore certains cancers, comme c’est le cas pour AR dans le cancer de la prostate (CaP) (Sonoda et al., 2008; Gronemeyer et al., 2004; Mangelsdorf et al., 1995).
Il existe 48 RN différents, dont 24 récepteurs orphelins et 24 récepteurs ayants des ligands endocrines spécifiques, regroupés en 4 sous-familles fonctionnelles (Sonoda et al., 2008; Benoit et al., 2004; Mangelsdorf et al., 1995):
5 5
- Les récepteurs de type I, comprenant les récepteurs stéroïdiens que sont les récepteurs aux estrogènes, aux glucocorticoïdes, aux minéralocorticoïdes, aux androgènes et à la progestérone. Ils se lient à leurs ligands sous forme homodimérique. - Les récepteurs de type II, non stéroïdiens, s’hétérodimérisent avec le récepteur rétinoïde X. On retrouve par exemple les récepteurs des hormones thyroïdiennes, de la vitamine D et de l’acide rétinoïque.
- Les récepteurs de type III et IV, qui sont orphelins et n’ont donc aucun ligand endogène identifié. Les récepteurs peuvent soit s’homodimériser (type III) soit être sous forme monomérique (type IV).
Les RN partagent une structure commune, comprenant trois domaines fonctionnels essentiels, séparée en six sous-domaines distincts (de A à F) (Figure 1.2) (Lavery and Mcewan, 2005; Mangelsdorf et al., 1995; Robinson-Rechavi et al., 2003; Verrijdt et al., 2003).
Figure 1.2 : Structure générale des récepteurs nucléaires.
Les sous-domaines A et B (en orange) composent le domaine N-Terminal (NTD) qui possède la région de transactivation AF1. Le domaine de liaison à l’ADN (DBD) est représenté par le sous-domaine C (vert) et la région charnière par le sous-sous-domaine D (jaune). Les sous-sous-domaines E et F (rouge et bleu respectivement) représentent le domaine de liaison du ligand (LBD), avec la région de transactivation AF2 et le domaine C-terminal dont la présence est variable en fonction des récepteurs.
Le premier domaine, situé dans la région N-terminale (NTD), est extrêmement variable selon les individus en fonction du nombre de répétitions de polyglycines (GCC) et de polyglutamines (CAG). Le NTD contient également le premier domaine de transactivation AF1 (Activation Function 1). Ce domaine permet l’activation de la transcription, et peut exercer cette fonction de façon indépendante du ligand s’il est isolé du reste de la protéine. Le deuxième domaine correspond au domaine de liaison à l’ADN (DBD) qui comprend une structure hautement conservée avec deux doigts de zinc. Le DBD est impliqué dans la dimérisation des RN et induit l’activation ou la répression de leurs gènes cibles. Le troisième domaine est le domaine de liaison au ligand (LBD) qui possède le
NH2 COOH
A & B
C
DE
F
Domaine N-Terminal (NTD) Domaine de liaison à l’ADN (DBD) Domaine de liaison au ligand (LBD) Région charnière Domaine C-Terminal Domaine de6 6
domaine de transactivation AF2 et un signal de localisation nucléaire (NLS). Le LBD permet la liaison de coactivateurs et corépresseurs de façon dépendante du ligand. Les régions DBD et LBD sont reliées par une région charnière (HR) qui possède une grande flexibilité pour permettre la rotation du DBD et qui possède une partie d’un NLS.
Cependant, même si cette structure est commune, il existe une différence majeure entre les récepteurs stéroïdiens de type I et les récepteurs de type II (Germain et al., 2006). En effet, les premiers sont activés par la fixation de l’hormone au niveau du LBD, et se retrouvent donc dans un état inactif dans le cytoplasme avant stimulation. Les récepteurs de type II sont quant à eux, déjà liés à l’ADN sous forme d’hétérodimères, en absence de stimulation, et agissent comme de puissants corépresseurs. La fixation de leur ligand entraîne un changement de conformation et permet ainsi l’activation de la transcription. De façon intéressante, dans les deux cas, c’est le recrutement de complexes coactivateurs qui va permettre la transcription induite après stimulation par le ligand. Dans le cas des RN orphelins, ces complexes coactivateurs entraînent une répression de la transcription (Shi, 2007).
1.1.3. Structure du AR
Le AR est un RN qui appartient à la famille des récepteurs stéroïdiens et qui agit donc en tant que facteur de transcription. Le gène NR3C4, situé sur le chromosome X (Xq11-12), est composé de 8 exons et produit une protéine de 110 kDa, constituée de 919 acides aminés (Figure 1.3A) (Ferraldeschi et al., 2015; Gelmann, 2002; Brown et al., 1989). AR est exprimé dans différents tissus, dont les os, les muscles, la prostate et le tissu adipeux. Il est également retrouvé dans les systèmes cardio-vasculaire, reproducteur, immunitaire, neuronal et hématopoïétique (Davey and Grossmann, 2016).
De façon intéressante, AR n’est pas exprimé dans toute la prostate, puisqu’il est fortement exprimé dans les cellules sécrétrices luminales, alors que les cellules basales, les cellules neuroendocrines et les cellules souches fonctionnent de façon indépendante des androgènes et n’expriment ainsi pas AR (Maitland et al., 2011; Mirosevich et al., 1999).
7 7
Figure 1.3 : Structure du gène et de la protéine du AR.
A) Le gène NR3C4, situé sur le bras long du chromosome X, est composé de 8 exons qui sont
représentés par différents rectangles. Ce gène produit la protéine AR de 919 acides aminés. L’exon 1 (orange) produit le domaine NTD du AR, les exons 2 et 3 (vert) produisent le DBD, une partie de l’exon 4 (jaune) produit la région HR et les exons 4, 5, 6, 7 et 8 (jaune et rouge) produisent le LBD.
Zn polyQ polyG 1 919 Exon 1 2 3 4 5 6 7 8 3’ 5’ Chromosome X Gène Protéine q11-12
NTD
DBD
HRLBD
554 624 665 G C H Y G A L T S A E D G I L G S T K K Q P V F F K R A A E G K Q K Y L L R T I D K F R R K N P S D N R S A C C C C C C C C R K P-box D-box C Y E A G M T L G A R K L K K L G NA
B
554 588 624Exon 2 Exon 3 Exon 4
DBD
HR
NLS 100 370 Tau-1 360 485 Tau-5 NH2 - - COOH 742 817 NES 616 634 NLS FQNLF WHTLF AF1 AF2 ZnC
COOH NH2 H10 H1 Ligand R1881 H12 H3 H4 H6 H7 H11 H9 H8 H58 8
Le domaine NTD possède deux régions variables que sont les séquences polyQ et polyG, une région de transactivation AF1 avec ses deux sous-unités Tau-1 et Tau-5, et deux sites (FQNLF et WHTLF) qui permettent de réguler l’interaction entre le NTD et le LBD. Le NLS se trouve à la jonction entre le DBD et la région HR. Le LBD possède une région de transactivation AF2 et un signal NES. B) Représentation de la structure en doigt de zinc du domaine DBD, ainsi que du NLS présent en partie sur le DBD et sur le HR. Chaque exon produit un doigt de zinc, où quatre cystéines entourent l’ion zinc. La P-box permet l’interaction du AR aux niveaux des HRE, tandis que la D-box permet celle avec les ARE. Le NLS est à la jonction entre le DBD et la région HR. C) Structure tridimensionnelle du LBD en présence de son ligand synthétique, le R1881, selon la structure cristallographique disponible sur la base de donnée PDB (référence 1E3G) (Matias et al., 2000). Le R1881 est en contact avec les hélices H3, H5 et H11 au niveau de la poche de liaison et est refermé par l’hélice H12.
Même si la structure de chaque domaine est commune à tous les RN, AR possède
des particularités qui lui sont propres (Figure 1.3). Contrairement au domaine NTD,
les structures des domaines DBD et LBD ont été analysées par cristallographie.
1.1.3.1. Domaine N-terminal
Le domaine NTD est exclusivement produit par l’exon 1, et représente plus de la moitié de la taille du AR (résidus 1 à 554) (Figure 1.3A). Sa taille est cependant extrêmement variable en fonction du nombre de répétitions de trinucléotides GGC, appelée séquence polyG, et de répétitions CAG, appelée séquence polyQ.
Le nombre de répétitions polyG est de 10 à 27 résidus en condition normale, et il est rare qu’AR en présente un nombre en dehors de cet intervalle (Werner et al., 2006). Par ailleurs, la longueur de la séquence polyQ affecte la structure en hélice α et le repliement du NTD (Davies et al., 2008). Le nombre normal de répétitions est de 9 à 36, et l’activité transcriptionnelle du AR est inversement associée au nombre de répétitions (Davies et al., 2008; Choong and Wilson, 1998). En effet, un plus petit nombre de répétitions entraîne généralement une augmentation de la transactivation du AR. Ainsi, à l’extrême, cette transactivation est augmentée de plus de quatre fois si aucune répétition polyQ n’est présente, alors qu’à l’inverse un plus grand nombre de répétitions diminue cette activation. Cela peut être expliqué par le fait que la conformation 3D du AR varie en fonction de ces répétitions, ce qui influence les interactions protéines-protéines (Werner et al., 2006; Callewaert et al., 2003). Les variations d’activité du AR attribuables aux variations du nombre de répétitions seraient compensées par l’activité de l’axe hypothalamo-hypophysaire (Zitzmann et al., 2004). Cependant, lorsque ces répétitions sont plus nombreuses (40 à 62 triplets CAG), elles peuvent causer des pathologies telles que la
9 9
maladie de Kennedy, aussi appelée atrophie musculaire bulbo-spinale (Zajac and Fui, 2012; Davies et al., 2008; Zitzmann et al., 2004). Cette maladie neurodégénérative liée à l’X est rare, récessive et entraîne une forme allongée du AR et donc son mauvais repliement et son agrégation nucléaire dans les motoneurones.
Le NTD est dans un état partiellement replié pour lui permettre d’interagir avec une haute spécificité et une faible affinité avec de nombreux partenaires de liaison structurellement divers, tels que les coactivateurs de la famille p160, les facteurs généraux de la transcription, mais également d’interagir directement avec le LBD (Chandra et al., 2013; Lavery and Mcewan, 2005). La région AF1, principale région effectrice du NTD, est requise pour une activité transcriptionnelle complète (Callewaert et al., 2006; Simental et al., 1991). Le sous-domaine AF1 est composé de deux sous-unités de transcription, soient Tau-1 (acides aminés 100 à 370) et Tau-5 (acides aminés 360 à 485) (Callewaert et al., 2006) (Figure 1.3A). Tau-1 et Tau-5, respectivement via leur motif FQNLF et WHTLF vont médier les interactions dépendantes du ligand entre le NTD et le LBD, qui sont importantes dans la régulation de certains gènes dépendants des androgènes tels que celui de la PSA ou de probasin (Wilson, 2011; He et al., 2002; Doesburg et al., 1997). Ces interactions permettent la stabilisation du dimère et le ralentissement de la vitesse de dissociation du ligand (Zhou et al., 1995). En absence de LBD, le sous-domaine AF1 seul permet au AR d’être constitutivement actif (Ferraldeschi et al., 2015).
1.1.3.2. Domaine de liaison à l’ADN et région charnière
Le DBD est le domaine le plus hautement conservé chez tous les RN. Il est produit par les exons 2 et 3 pour AR (résidus 556 à 624) (Figure 1.3A). Le DBD est composé de deux doigts de zinc, où chaque doigt est composé de quatre cystéines qui entourent l’ion zinc (Figure 1.3B), de deux hélices α et de l’extension COOH qui se retrouve dans la région HR (Helsen et al., 2012; Claessens et al., 2008; Shaffer et al., 2004). Cette extension C-terminale (CTE) est impliquée dans la dimérisation du récepteur.
Le DBD permet la liaison de l’homodimère AR actif sur l’ADN via des éléments de réponse situés au niveau de régions promotrices. On distingue deux types d’éléments de réponse, soit ceux qui sont communs à tous les récepteurs hormonaux stéroïdiens (HRE), soit ceux qui sont spécifiques à la réponse androgénique (ARE). Les HRE sont composés de deux demi-sites hexamères égaux (5’-AGAACA-3’), séparés par 3 paires de bases (Helsen et
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al., 2012; Shaffer et al., 2004; Beato et al., 1995). Trois acides aminés (glycine-sérine-valine) situés au niveau de l’hélice α du doigt de zinc N-terminal, appelés boîte proximale ou P-box (Figure 1.3B), reconnaissent spécifiquement et interagissent directement avec ces HRE (Helsen et al., 2012; Beato et al., 1995). Cependant, comme les HRE sont identiques pour les récepteurs aux androgènes, aux glucocorticoïdes, aux minéralocorticoïdes et à la progestérone, le mécanisme sous-jacent permettant de comprendre comment est dictée cette spécificité est encore aujourd’hui mal connu. Les ARE, qui sont également des demi-sites hexamèriques tels que la séquence 5’-GGTTCT-3’, ont quant à eux une orientation de répétition directe (Helsen et al., 2012; Shaffer et al., 2004; Verrijdt et al., 2003; Claessens et al., 1996). La liaison du AR dimérisé se fera alors en tête-à-tête à travers la boîte distale ou D-box, qui est constituée d’une boucle de cinq acides aminés situés entre deux résidus cystéine du second doigt de zinc (Figure 1.3B). Cette liaison permet de stabiliser le complexe AR/ARE.
À la jonction entre le DBD et la région HR (résidus 624-665), on retrouve le premier NLS (résidus 617-634) responsable de l’import du AR au noyau (Clinckemalie et al., 2012; Jenster et al., 1993) (Figure 1.3A). Le NLS est composé de deux regroupements d’acides aminés basiques, séparés par dix résidus (617-RKCYEAGMTLGARKLKKL-634) (Figure 1.3B). Ce motif est conservé entre les récepteurs aux glucocorticoïdes, aux minéralocorticoïdes et à la progestérone (Gronemeyer et al., 2004). La liaison des androgènes au AR permet un changement de conformation du récepteur qui expose le NLS entraînant ainsi son import, via sa liaison avec l’importine-α (Ni et al., 2013; Cutress et al., 2008). Cette dernière a une structure interne qui lui permet d’interagir avec les acides aminés basiques du NLS. La région HR facilite également la liaison à l’ADN et le recrutement de coactivateurs au niveau du domaine NTD (Clinckemalie et al., 2012; Haelens et al., 2007). La région HR est un site cible pour l’acétylation, l’ubiquitinylation et la méthylation du récepteur. Ces modifications post-traductionnelles seront décrites dans la section 1.1.6 (Clinckemalie et al., 2012).
1.1.3.3. Domaine de liaison au ligand
Le domaine LBD (résidus 666-919), produit par les exons 4 à 8, est composé de onze hélices α (notées H1 à H12) et de quatre courts brins β formant deux feuillets β antiparallèles (Moras and Gronemeyer, 1998; Wurtz et al., 1996) (Figure 1.3A, 3C). Sa structure tridimensionnelle en trois couches formant un motif en « sandwich d’hélices α
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antiparallèles » est typique des LBD des RN (Moras and Gronemeyer, 1998). Cependant, le LBD du AR ne possède pas d’hélice H2, qui est remplacée par un long connecteur flexible (Figure 1.3C). Les hélices H1 et H3 forment donc la première couche du sandwich hélicoïdal, alors que les hélices H4, H5, H8, H9 et le premier feuillet β forment la deuxième couche. La troisième couche est complétée par les hélices H10 et H11 (Gronemeyer et al., 2004; Wurtz et al., 1996). La poche de liaison au ligand, qui correspond à la région de transactivation AF2, est entourée par les extrémités N-terminales des hélices H3, H5 et H11, et l’hélice H12 agit comme un couvercle pour fermer cette poche après liaison du ligand (Figure 1.3C). De plus, le domaine AF2 est essentiel au contrôle de la liaison des corégulateurs (Gronemeyer et al., 2004). En outre, le LBD possède une surface de dimérisation pour permettre l’interaction entre les deux LBD de l’homodimère.
AR est capable de se lier à de nombreux ligands différents en modifiant le volume de sa poche de liaison au ligand ou en changeant l’orientation des chaînes latérales des acides aminés (Cantin et al., 2007). Les ligands sont classés en tant qu’agonistes ou antagonistes, en fonction de leur capacité à activer ou inhiber la transcription des gènes cibles du AR après leur fixation au niveau de la poche de liaison présente dans le LBD. Ils ont généralement été identifiés par des tests de liaison in vitro ou des essais de gènes rapporteurs (Gao et al., 2005; Fang et al., 2003). Les deux ligands endogènes les plus importants sont la testostérone et la DHT, comme décrit précédemment. La DHT diffère de la testostérone par l’absence d’une double liaison, ce qui lui confère une affinité pour le AR dix fois supérieure, et qui diminue de cinq fois son taux de dissociation du récepteur (Grino et al., 1990; Saartok et al., 1984). La conformation de liaison entre AR et ses ligands agonistes est assez similaire. Quatre liaisons hydrogène sont formées entre le LBD et les atomes polaires des ligands testostérone ou DHT, alors que la position des chaînes latérales est parfaitement conservée (Pereira de Jésus-Tran et al., 2006).
Le LBD joue également un rôle important dans l’export nucléaire du AR vers le cytoplasme, après retrait du ligand (Saporita et al., 2003; Tyagi et al., 2000). En effet, un signal d’exportation nucléaire (NES) est présent sur le LBD (résidus 742 à 817) (Figure 1.3A).
Lorsqu’il est sous forme inactive, AR est maintenu dans le cytoplasme dans un état dit « apo » qui lui permet d’être compétent pour la fixation d’un ligand (Cano et al., 2013). Il est alors lié à des protéines chaperonnes, dont les protéines de choc thermique (Hsp)
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Hsp90 et Hsp70 ou p23 (Cano et al., 2013; Prescott and Coetzee, 2006; Georget et al., 2002) (Figure 1.4). Il peut ensuite être activé soit par la voie canonique génomique, soit par une voie non génomique.
1.1.4. Signalisation génomique du AR
L’activation du AR par la voie génomique est une activation via la fixation d’un ligand au niveau de son LBD. Cela mène à la translocation du AR puis à sa fixation à l’ADN afin d’induire la transcription de gènes cibles, tels que celui de l’antigène prostatique spécifique (PSA) (Livermore et al., 2016; Ferraldeschi et al., 2015; Bennett et al., 2010) (Figure 1.4).
1.1.4.1. Fixation du ligand et translocation nucléaire
La fixation de la DHT au niveau du LBD entraîne une série de changements conformationnels pour permettre la dissociation du AR de ses protéines chaperonnes (Cano et al., 2013; Helsen et al., 2012; Cantin et al., 2007). L’hélice H12 se réaligne sur la poche de liaison, et donc sur H3 et H4, pour former la plateforme hydrophobe d’interaction AF2 afin de faciliter à la fois l’interaction NTD/LBD et la liaison de cofacteurs (Tan et al., 2015; Askew et al., 2012; van de Wijngaart et al., 2012; Schaufele et al., 2005). Ces cofacteurs possèdent généralement des motifs riches en leucine (LXXLL, où X est n’importe quel acide aminé) qui sont appelés boîtes RN, puisque ces dernières sont communes à tous les RN. Cependant, même si AR est capable de se fixer avec une forte affinité au motif LXXLL, il a une large préférence pour les motifs riches en phénylalanine FXXLF ou tryptophane WXXLF (Zhou et al., 2010; Claessens et al., 2008; Hur et al., 2004; He et al., 2000).
AR ainsi libéré de ses chaperonnes va interagir avec ses corégulateurs, dont notamment le coactivateur des récepteurs nucléaires NCOA4 (ou ARA70), via son LBD et son DBD pour faciliter son homodimérisation (Helsen et al., 2012; He et al., 2002). La liaison concomitante avec la filamine-A et l’importine-α qui s’associent au NLS du AR permet la translocation nucléaire du récepteur (Ni et al., 2013; van de Wijngaart et al., 2012; Cutress et al., 2008; Loy et al., 2003) (Figure 1.4).
La liaison des androgènes au AR favorise une hyperphosphorylation du récepteur, avec le recrutement de kinases responsable de plusieurs phosphorylations en série de résidus
