Effets préventifs et thérapeutiques des polyphénols dans des modèles in vitro de la maladie parodontale

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Effets préventifs et thérapeutiques des polyphénols

dans des modèles in vitro de la maladie parodontale

Thèse

Amel Ben Lagha

Doctorat en microbiologie

Philosophiæ doctor (Ph. D.)

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Effets préventifs et thérapeutiques des polyphénols dans

des modèles in vitro de la maladie parodontale

Thèse

Amel Ben Lagha

Sous la direction du :

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Résumé

Les maladies parodontales sont des maladies inflammatoires multifactorielles ayant comme étiologie primaire l’accumulation d’un biofilm bactérien dans le sillon gingival. Elles sont modulées par des facteurs immunologiques de l’hôte qui en déterminent l’évolution et la sévérité et se traduisent cliniquement par une destruction des tissus de soutien de la dent. Les maladies parodontales constituent un réel problème de santé publique en raison de leur forte prévalence et des coûts qui leur sont associés. Le cadre thérapeutique parodontal vise à contrôler l’infection et la réponse immunitaire. L’objectif étant le rétablissement d’une flore microbienne compatible avec le maintien de la santé parodontale. À cet égard, nous proposons comme hypothèse que les polyphénols constituent des molécules bioactives naturelles capables d’agir sur plusieurs cibles thérapeutiques de la maladie parodontale incluant la réponse pro-inflammatoires de l’hôte et les facteurs de virulence des bactéries parodontopathogènes hautement dysbiotiques. En vue de vérifier cette hypothèse, le premier objectif de ce projet doctoral fut d’évaluer la capacité des polyphénols à atténuer les mécanismes de pathogénicité des principales bactéries parodontopathogènes plus spécifiquement Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum et Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Le second objectif portait sur l’évaluation du potentiel anti-inflammatoire et antioxydant des polyphénols, dans le but de réduire la destruction tissulaire induite par la pérennisation de l’inflammation parodontale. Enfin, le troisième objectif a permis d’évaluer la capacité des polyphénols à renforcer l’intégrité de la barrière épithéliale gingivale dans le but de contrecarrer la pathogenèse bactérienne caractérisée par la colonisation, l’invasion et la destruction tissulaire. Les résultats obtenus dans ce projet doctoral ont permis de mettre en évidence des propriétés antibactériennes, anti-adhérentes et

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anti-inflammatoires de plusieurs classes de polyphénols, en plus de leurs capacités à renforcer l’intégrité de la barrière épithéliale. Ces propriétés font des polyphénols des molécules prometteuses en vue d’une utilisation préventive ou thérapeutique pour le contrôle des maladies parodontales.

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Abstract

Periodontal diseases that cause destruction of the tooth-supporting tissue are multifactorial inflammatory diseases whose primary etiology relates to the accumulation of a Gram negative bacterial biofilm in the gingival sulcus. These infections are modulated by immunological factors of the host that determine the evolution and severity of the disease. Periodontal diseases represent an important public health problem with a high prevalence and high cost of treatment. The periodontal therapeutic framework aims to control both the infection and the immune response with the objective to establish a microflora compatible with the maintenance of periodontal health. In this thesis, we hypothesized that polyphenols, including proanthocyanidins from berry fruits, catechins and theaflavins from tea, as well as resveratrol, can modulate the host response and the virulence factors expressed by periodontopathogens. In order to verify this hypothesis, the first objective of this project was to evaluate the ability of polyphenols to attenuate the growth and pathogenic mechanisms of the major periodontopathogenic bacteria, more specifically Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum and Aggregatibacter actinomycetemcomitans. The second objective was to investigate the anti-inflammatory potential of polyphenols that may contribute to reduce the tissue destruction induced by the installation of chronic inflammation. Finally, the third objective was to determine the ability of polyphenols to enhance the epithelial barrier integrity with the aim of counteracting bacterial pathogenesis characterized by colonization, invasion and tissue destruction. The results obtained in this doctoral project have highlighted the antibacterial, anti-adhesion and anti-inflammatory properties of several classes of polyphenols, in addition to their ability to enhance the integrity of the epithelial barrier. These properties of polyphenols suggest that they may be

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promising candidates for novel therapeutic and preventive agents against periodontal diseases.

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Table des matières

RÉSUMÉ ... III ABSTRACT ... V TABLE DES MATIÈRES ... VII LISTE DES TABLEAUX ... XII LISTE DES FIGURES ... XIV LISTE DES ABRÉVIATIONS ... XX PARENTHÈSES ... XXIV AVANT-PROPOS ... XXV

CHAPITRE 1 ...1

INTRODUCTION ...1

PRÉAMBULE ...2

I. GÉNÉRALITÉS: LES POLYPHÉNOLS ...4

II. STRUCTURE ET CLASSES DES POLYPHÉNOLS ...5

III. ÉMERGENCE DE LA RECHERCHE SUR LE POTENTIEL PRÉVENTIF ET THÉRAPEUTIQUE DES POLYPHÉNOLS ...8

IV. MÉCANISMES IMPLIQUÉS DANS LES EFFETS BÉNÉFIQUES DES POLYPHÉNOLS POUR LA SANTÉ ... 11

V. POLYPHÉNOLS ET MALADIES CHRONIQUES ... 13

VI. POLYPHÉNOLS ET MALADIES BUCCODENTAIRES ... 17

VII. MALADIES PARODONTALES ... 24

VIII. TISSUS PARODONTAUX ... 26

I. GENCIVE ... 27

II. APPAREIL D’ANCRAGE ... 31

VIII. CHRONOLOGIE DE L’ÉTIOLOGIE DE LA MALADIE PARODONTALE ... 35

VIII. MICROBIOTE BUCCAL ... 38

IX. PATHOPHYSIOLOGIE BACTÉRIENNE ... 39

I. PLAQUE DENTAIRE OU BIOFILM DENTAIRE ... 40

II. PROFILS BACTÉRIENS ... 42

III. PORPHYROMONAS GINGIVALIS:BACTÉRIE CLÉ DE VOÛTE (KEYSTONE BACTERIA) ... 44

IV. FUSOBACTERIUM NUCLEATUM:BACTÉRIE VOYAGEUSE (PASSENGER BACTERIA) ... 47

V. AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS:LEUCOTOXINE ... 51

X. IMMUNOPATHOGÉNÈSE ... 53

I. CYTOKINES PRO-INFLAMMATOIRES ... 54

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III. MÉTALLOPROTÉINASES MATRICIELLES (MMPS) ... 56 IV. RÉSORPTION OSSEUSE ... 57 CHAPITRE 2 ... 59 PROBLÉMATIQUE ... 60 HYPOTHÈSE ... 65 OBJECTIFS SPÉCIFIQUES ... 66 CHAPITRE 3 ... 67

POLYPHÉNOLS DU THÉ VERT ET DU THÉ NOIR: ACTION BÉNÉFIQUE DANS LE TRAITEMENT ET LA PRÉVENTION DE LA MALADIE PARODONTALE ... 67

ARTICLE I: BLACK TEA THEAFLAVINS ATTENUATE PORPHYROMONAS GINGIVALIS VIRULENCE PROPERTIES, MODULATE GINGIVAL KERATINOCYTE TIGHT JUNCTION INTEGRITY AND EXERT ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY ... 68

RÉSUMÉ ... 69

ABSTRACT ... 71

INTRODUCTION ... 73

MATERIALSANDMETHODS ... 76

RESULTS ... 85

DISCUSSION ... 95

ACKNOWLEDGMENTS ... 101

REFERENCES ... 102

ARTICLE II: GREEN TEA POLYPHENOLS ENHANCE GINGIVAL KERATINOCYTE INTEGRITY AND PROTECT AGAINST INVASION BY PORPHYROMONAS GINGIVALIS ... 106

RÉSUMÉ ... 108

ABSTRACT ... 109

INTRODUCTION ... 110

RESULTS ... 118

DISCUSSION ... 127

CONCLUSION ... 131

ACKNOWLEDGEMENTS ... 132

REFERENCES ... 133

ARTICLE III: TEA POLYPHENOLS INHIBIT THE ACTIVATION OF NF-ΚB AND THE SECRETION OF CYTOKINES AND MATRIX METALLOPROTEINASES BY MACROPHAGES STIMULATED WITH FUSOBACTERIUM NUCLEATUM ... 138

RÉSUMÉ ... 139

ABSTRACT ... 140

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DISCUSSION ... 156

CONCLUSION ... 162

REFERENCES ... 167

ARTICLE IV: TEA POLYPHENOLS INHIBIT THE GROWTH AND VIRULENCE PROPERTIES OF FUSOBACTERIUM NUCLEATUM ... 172 RÉSUMÉ ... 173 ABSTRACT ... 174 INTRODUCTION ... 175 RESULTS ... 177 DISCUSSION ... 188

REFERENCES ... 198

ARTICLE V: TEA POLYPHENOLS PROTECT GINGIVAL KERATINOCYTES AGAINST TNFΑ-INDUCED TIGHT JUNCTION BARRIER DYSFUNCTION AND ATTENUATE NF-ΚB ACTIVATION OF AND IL-1Β SECRETION BY MONOCYTES/MACROPHAGES ... 203

RÉSUMÉ ... 204

ABSTRACT ... 205

MATERIALANDMETHODS ... 208

RESULTS ... 214 DISCUSSION ... 223 CONCLUSION ... 227 ACKNOWLEDGEMENTS ... 229 REFERENCES ... 230 CHAPITRE 4 ... 239

IMPACT DES POLYPHÉNOLS DE BLEUET ET DE CANNEBERGE SUR LES COMPOSANTES ÉTIOLOGIQUES DE LA MALADIE PARODONTALE ... 239

ARTICLE VI: WILD BLUEBERRY (VACCINIUM ANGUSTIFOLIUM AIT.) POLYPHENOLS TARGET FUSOBACTERIUM NUCLEATUM AND THE HOST INFLAMMATORY RESPONSE: POTENTIAL INNOVATIVE MOLECULES FOR TREATING PERIODONTAL DISEASES ... 240

GRAPHICALABSTRACT ... 241

RÉSUMÉ ... 242

ABSTRACT ... 243

(10)

RESULTS ... 254

DISCUSSION ... 266

ACKNOWLEDGMENTS ... 272

REFERENCES ... 273

ARTICLE VII: DUAL ACTION OF HIGHBUSH BLUEBERRY PROANTHOCYANIDINS ON AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS AND THE HOST INFLAMMATORY RESPONSE ... 280 RÉSUMÉ ... 281 ABSTRACT ... 283 BACKGROUND ... 285 METHODS ... 288 RESULTS ... 296 DISCUSSION ... 308 REFERENCES ... 317

ARTICLE VIII: CRANBERRY PROANTHOCYANIDINS NEUTRALIZE THE EFFECTS OF AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS LEUKOTOXIN ... 330

RÉSUMÉ ... 331

ABSTRACT ... 333

MATERIALANDMETHODS ... 338

RESULTS ... 344

DISCUSSION ... 353

REFERENCES ... 360

CHAPITRE 5 ... 366

EFFET DU RESVÉRATROL SUR LES PROPRIÉTÉS DE VIRULENCE DE PORPHYROMONAS GINGIVALIS ... 366

ARTICLE IX: RESVERATROL ATTENUATES THE PATHOGENIC AND INFLAMMATORY PROPERTIES OF PORPHYROMONAS GINGIVALIS ... 367

GRAPHICALABSTRACT ... 368

RÉSUMÉ ... 369

ABSTRACT ... 370

RESULTS ... 384

DISCUSSION ... 394

REFERENCES ... 402

CHAPITRE 6 ... 407

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I. EFFETS DES POLYPHÉNOLS SUR LA CROISSANCE ET LA PERSISTANCE MICROBIENNE . 409 II. ACTION DES POLYPHÉNOLS SUR LES FACTEURS DE VIRULENCE IMPLIQUÉS DANS LA

COLONISATION BACTÉRIENNE DES POCHES PARODONTALES ... 411

III. EFFETS DES POLYPHÉNOLS SUR LA RÉGULATION DE LA BARRIÈRE ÉPITHÉLIALE GINGIVALE ... 413

IV. CONTOURNEMENT DES PROCESSUS IMMUNITAIRES DE DÉFENSE DE L’HÔTE ... 417

V. MODULATION DE LA RÉPONSE DE L’HÔTE. ... 418

CHAPITRE 7 ... 423

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ... 423

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Liste des tableaux

Introduction

Tableau 1: Potentiel préventif et thérapeutique des polyphénols envers les maladies buccodentaire ... 21 Tableau 2: Infections extrabuccales impliquant Fusobacterium nucleatum ... 50

Article I

I.Table 1: Primers used for the quantitative real-time PCR analysis of P. gingivalis virulence factor gene expression ... 84 I.Table 2: Effect of TFs on the activity of recombinant MMP-9 ... 94

Article II

II.Table 1: Effects of the green tea extract and EGCG on Arg- and Lys-gingipain activities of P. gingivalis ... 126

Article III

III.Table 1: Effect of the green tea extract, EGCG, black tea extract, and theaflavins on the viability of U937-3xκB and U937 macrophage-like cells ... 145 III.Table 2: Secretion of IL-1β, TNF-α, IL-6, CXCL8, MMP-3, MMP-9, and sTREM-1 by F. nucleatum-stimulated macrophages. ... 147

Article IV

IV.Table 1: MIC and MBC values of green tea extract, EGCG, black tea extract, and theaflavins against F. nucleatum ... 177 IV.Table 2: Effects of green tea extract, EGCG, black tea extract, and theaflavins on the release of calcein-AM from F. nucleatum cells. ... 178 IV.Table 3: Effects of green tea extract, EGCG, black tea extract, and theaflavins on killing of a F. nucleatum pre-formed biofilm ... 184 IV.Table 4: Effects of green tea extract, EGCG, black tea extract, and theaflavins on viability of oral epithelial cells ... 185

Article VI

VI.Table 1: Phenolic composition of the blueberry extract... 254 VI.Table 2: Effect of the blueberry extract on the activity of MMP-9 ... 265

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Article VIII

VIII.Table 1: Primers used for the quantitative real-time PCR analysis of leukotoxin operon gene expression and inflammasome gene expression in macrophages ... 359

Article IX

IX.Table 1: Primers used for the quantitative real-time PCR analysis of TREM-1 and DAP- 12 gene expression in THP-1 cells. ... 380

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Liste des figures

Chapitre I et II

Figure 1: Structures chimiques des différentes classes de polyphénols ... 7

Figure 2: Cibles thérapeutiques à considérer lors de la recherche de nouveaux médicaments. ... 8

Figure 3: Effets pléiotropiques et bénéfiques des polyphénols sur la santé globale. ... 14

Figure 4: Les polyphénols, principes de vie ou de jouvence : oui, mais n’en abusez pas, attention aux dégâts ! ... 16

Figure 5: Progression de la maladie parodontale. ... 24

Figure 6: Structure anatomique du parodonte ... 26

Figure 7: Attache de la gencive à l’os alvéolaire et au cément ... 28

Figure 8: Coupe histologique de l’épithélium gingival ... 30

Figure 9: Coupe de mandibule humaine ... 32

Figure 10: Chronologie de l’étiologie de la maladie parodontale ... 34

Figure 11: Les complexes bactériens sous-gingivaux de Socransky et Haffajee ... 38

Figure 12: Réponse immunitaire pro-inflammatoire lors d’une atteinte parodontale. ... 54

Figure 13: Maladies parodontales et complications systémiques ... 62

Article I I.Figure 1: Effect of TFs on fimA, hagA, rgpA and kgp gene expression ... 85

I.Figure 2: Effect of TFs on the adherence of P. gingivalis to gingival keratinocytes and Matrigel™, as a model of extracellular membrane matrix ... 86

I.Figure 3: Effect of TFs on the gingival keratinocyte tight junction integrity. ... 87

I.Figure 4: Effect of P. gingivalis in the absence and presence of TFs on the gingival keratinocyte tight junction integrity. ... 88

I.Figure 5: Penetration of a gingival keratinocyte monolayer by P. gingivalis, and effect of black tea TFs, as determined using the B11 keratinocyte cell line in a double-chamber system. ... 89

I.Figure 6: Effect of TFs on the secretion of IL-1β, TNF-α, IL-6, and CXCL8 by macrophage-like cells stimulated with P. gingivalis ... 91

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I.Figure 7: Effect of TFs on the secretion of MMP-3, MMP-8, and MMP-9 by macrophage-like cells stimulated with P. gingivalis. ... 92 I.Figure 8: Effect of P. gingivalis in the absence and presence of TFs on NF-κB activation using the U937-3xκB cell model. ... 93

Article II

II.Figure 1: Time and dose effects of the green tea extract and EGCG on gingival keratinocyte tight junction integrity ... 118 II.Figure 2: Time and dose effects of the green tea extract and EGCG on the paracellular permeability of gingival keratinocytes to FITC-dextran 4 (FD-4). ... 119 II.Figure 3: Immunofluorescence staining of the tight junction proteins occludin and zonula occludens-1 of gingival keratinocytes treated with the green tea extract or EGCG ... 120 II.Figure 4: Effect of P. gingivalis in the absence and presence of the green tea extract and EGCG on gingival keratinocyte tight junction integrity. ... 121 II.Figure 5: Immunofluorescence staining of the tight junction proteins occludin and zonula occludens-1 in gingival keratinocytes following a treatment with P. gingivalis in the absence and presence of the green tea extract or EGCG... 123 II.Figure 6: Effects of the green tea extract and EGCG on the invasion of a gingival keratinocyte monolayer by P. gingivalis. ... 124 II.Figure 7: Effects of the green tea extract and EGCG on collagen degradation by P. gingivalis. ... 125

Article III

III.Figure 1: Effect of the green tea extract, EGCG, black tea extract, and theaflavins on F. nucleatum-mediated activation of the NF-B signaling pathway... 146 III.Figure 2: Effect of the green tea extract, EGCG, black tea extract, and theaflavins on the secretion of IL-1β by macrophages stimulated with F. nucleatum ... 149 III.Figure 3: Effect of the green tea extract, EGCG, black tea extract, and theaflavins on the secretion of TNF-α by macrophages stimulated with F. nucleatum ... 150 III.Figure 4: Effect of the green tea extract, EGCG, black tea extract, and theaflavins on the secretion of IL-6 by macrophages stimulated with F. nucleatum ... 151 III.Figure 5: Effect of the green tea extract, EGCG, black tea extract, and theaflavins on the secretion of CXCL8 by macrophages stimulated with F. nucleatum ... 152

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III.Figure 6: Effect of the green tea extract, EGCG, black tea extract, and theaflavins on the secretion of MMP-3 by macrophages stimulated with F. nucleatum ... 153 III.Figure 7: Effect of the green tea extract, EGCG, black tea extract, and theaflavins on the secretion of MMP-9 by macrophages stimulated with F. nucleatum ... 154 III.Figure 8: Effect of the green tea extract, EGCG, black tea extract, and theaflavins on the secretion of sTREM-1 by macrophages stimulated with F. nucleatum ... 155

Article IV

IV.Figure 1: Iron-chelating activity of the green tea extract, black tea extract, EGCG, and theaflavins determined using a siderophore colorimetric assay. ... 179 IV.Figure 2: Effects of the green tea extract, black tea extract, EGCG, and theaflavins on the growth of and biofilm formation by F. nucleatum. ... 180 IV.Figure 3: Effects of the green tea extract, black tea extract, EGCG, and theaflavins on the adherence of F. nucleatum to oral epithelial cells. ... 182 IV.Figure 4: Effects of the green tea extract, black tea extract, EGCG, and theaflavins on the adherence of F. nucleatum to extracellular matrix proteins (Matrigel®). ... 183 IV.Figure 5: Effects of the green tea extract, black tea extract, EGCG, and theaflavins on the hemolytic activity of F. nucleatum. ... 186 IV.Figure 6: Effects of the green tea extract, black tea extract, EGCG, and theaflavins on H2S production by F. nucleatum. ... 187

Article V

V.Figure 1: Effects of TNF-α on the secretion of IL-1β by macrophages. ... 214 V.Figure 2: Effects of TNF-α on the activation of caspase-1 in macrophages ... 216 V.Figure 3: Effects of TNF-α on the activation of the NF-κB pathway... 217 V.Figure 4: Effects of TNF-α in the absence and presence of the green tea extract, EGCG, black tea extract, and theaflavins on gingival keratinocyte tight junction integrity determined by monitoring TER. ... 219 V.Figure 5: Immunofluorescence staining of the tight junction proteins occludin and zonula occludens-1 of gingival keratinocytes treated with TNF-α in the absence and presence of the green tea extract, EGCG, black tea extract, and theaflavins ... 220

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V.Figure 6: Effects of the green tea extract, EGCG, black tea extract, and theaflavins on the paracellular permeability of gingival keratinocytes treated with TNF-α determined by measuring the transport of FITC-dextran 4 (FD-4). ... 221 V.Figure 7: Effects of TNF-α on the secretion of IL-8 by oral epithelial cells ... 222 V.Figure 8: Proposed protective roles of tea polyphenols in the pathogenesis of periodontal disease associated with an uncontrolled secretion of TNF-α. ... 228

Article VI

VI.Figure 1: Effect of the blueberry extract on F. nucleatum growth and biofilm formation. ... 256 VI.Figure 2: Iron-chelating activity of the blueberry extract determined using a chrome azurol sulfate colorimetric assay. ... 257 VI.Figure 3: Scanning electron micrographs of F. nucleatum biofilms. ... 258 VI.Figure 4: Effect of the blueberry extract on the production of AI-2 ... 259 VI.Figure 5: Effect of preincubating F. nucleatum with the blueberry extract on NF-κB activation ... 260 VI.Figure 6: Effect of the blueberry extract on F. nucleatum-mediated activation of the NF- κB signaling pathway ... 261 VI.Figure 7: Effect of the blueberry extract on the secretion of IL-1β, TNF-α, IL-6, and CXCL8 by macrophages stimulated with F. nucleatum... 263 VI.Figure 8: Effect of the blueberry extract on the secretion of MMP-8 and MMP-9 by macrophage-like cells stimulated with F. nucleatum ... 264

Article VII

VII.Figure 1: Effect of highbush blueberry PACs on A. actinomycetemcomitans growth and biofilm formation. ... 297 VII.Figure 2: Time-course release of calcein-AM by A. actinomycetemcomitans cells treated with various concentrations of highbush blueberry PACs. ... 298 VII.Figure 3: Effect of highbush blueberry PACs on A. actinomycetemcomitans biofilm desorption and viability. ... 299 VII.Figure 4: Effect of A. actinomycetemcomitans in the absence and presence of highbush blueberry PACs on the integrity of the oral keratinocyte tight junction. ... 301

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VII.Figure 5: Effect of highbush blueberry PACs on A. actinomycetemcomitans leukotoxin activity on macrophage-like cells ... 302 VII.Figure 6: Effect of highbush blueberry PACs on the secretion of IL-1β, TNF-α, IL-6, and CXCL8 by macrophages stimulated with A. actinomycetemcomitans LPS ... 304 VII.Figure 7: Effect of highbush blueberry PACs on the secretion of MMP-3 and MMP-9 by macrophages stimulated with A. actinomycetemcomitans LPS ... 305 VII.Figure 8: Effect of highbush blueberry PACs on the secretion/shedding of sTREM-1 by macrophages stimulated with A. actinomycetemcomitans LPS... 306 VII.Figure 9: Effect of A. actinomycetemcomitans LPS in the absence and presence of highbush blueberry PACs on NF-κB activation ... 307

Article VIII

VIII.Figure 1: Effects of cranberry PACs on the expression of ltxB and ltxC mRNA in two strains of A. actinomycetemcomitans (Y4 and JP2). ... 344 VIII.Figure 2: Effect of cranberry PACs on the real-time viability of macrophages exposed to purified LtxA. Immunofluorescence microscopy of macrophages treated with purified LtxA in the presence or absence of cranberry PACs ... 346 VIII.Figure 3: Effect of cranberry PACs on LtxA-induced apoptotic death of macrophages. Cells were stained with annexin V/PI and were analyzed by flow cytometry. ... 347 VIII.Figure 4: Effect of cranberry PACs on LtxA-induced caspase-1 activation in macrophages. ... 348 VIII.Figure 5: Effect of cranberry PACs on intracellular and released caspase-1, IL-1β, and IL-18 from LtxA-treated macrophages. ... 349 VIII.Figure 6: Effects of cranberry PACs on the LtxA-modulated CIAS and P2X7 expression in macrophages. ... 350 VIII.Figure 7: Dose- and time-dependent effects of cranberry PACs on LtxA-induced increases in ROS and superoxide production by macrophages. ... 351 VIII.Figure 8: Effects of cranberry PACs on the binding of FITC-LtxA to macrophages. ... 352

Article IX

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IX.Figure 2: Dose-dependent effect of resveratrol on the integrity of the oral keratinocyte barrier... 388 IX.Figure 3: Dose-dependent effect of resveratrol on the P. gingivalis-induced decrease in the TER values of oral keratinocytes, paracellular permeability to FITC-conjugated dextran of oral keratinocytes, and expression of zonula occludens-1 ... 389 IX.Figure 4: Dose- and time-dependent effects of resveratrol on the degradation of FITC-labeled type I collagen by P. gingivalis ... 390 IX.Figure 5: Dose-dependent effects of resveratrol on the P. gingivalis-modulated TREM- 1 gene and protein expression in THP-1 cells ... 391 IX.Figure 6: Effect of resveratrol on P. gingivalis-induced NF-κB activation ... 392 IX.Figure 7: Effect of resveratrol on PPAR-γ activation ... 393

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Liste des abréviations

% Pourcentage °C Celsius TPA 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate MTT 3-[4,5-diethylthiazol-2-yl]-2,5diphenyltetra-zolim bromide A550 Absorbance à 550 nm

ADN Acide désoxyribonucléique

ARN Acide ribonucléique

ATP Adénosine Triphosphate

A. actinomycetemcomitans Aggregatibacter actinomycetemcomitans

ATCC American Type Culture Collection

Calcein-AM Calcein acetoxymethyl ester

OD Densité optique

ROS Dérivés réactifs de l’oxygène

DMSO Diméthylsulfoxyde

CO2 Dioxyde de carbone

DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

EGCG Epigallocatéchine-3-gallate

spp. Espèce

NF-κB Facteur nucléaire kappa B

FD-4 Fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran FLICA Fluorochrome inhibitor of caspases

F. nucleatum Fusobacterium nucleatum

GAPDH Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase g, mg, µg Gramme, Milligramme, Microgramme

h Heure

IBD Inflammatory bowel disease

IL Interleukine

FITC Isothiocyanate de fluorescéine

K-SFM Keratinocyte serum-free medium

LPS Lipopolysaccharide

LDL Lipoprotéines de basse densité

L, ml, µL Litres, Millilitre, Microlitre

MMPs Métalloprotéinases matricielles

MBC Minimal bactericidal concentration MIC Minimal inhibitory concentration

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MOI Multiplicité d’infection

NADPH Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate

OPG Ostéoprotégérine

PRR Pattern Recognition-Receptors

PMA Phorbol myristate acétate

PBS Phosphate-buffered saline

PCR Polymerase chain reaction

PMN Polymorphonucléaires

P. gingivalis Porphyromonas gingivalis

pH Potentiel hydrogène

PGE2 Prostaglandine E2

TLR Récepteur de type Toll

RANKL Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand RUF Relative fluorescence units

RPMI-1640 Roswell Park Memorial Institute 1640 medium

FBS Sérum bovin fetal

H2S Sulfure d’hydrogène

T. forsythia Tannerella forsythia

TIMPs Tissue Inhibitor of MetalloProteinases

THB Todd-Hewitt broth

TER Transepithelial electrical resistance T. denticola Treponema denticola

TREM-1 Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 1

TNF-α Tumor necrosis factor alpha

U. sphaerogena Ustilago sphaerogena

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(23)

Il y a des jours, des mois, des années interminables où il ne

se passe presque rien. Il y a des minutes et des secondes qui

contiennent tout un monde.

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Parenthèses

Le célèbre chef cuisinier Paul Bocuse a dit « Nous sommes des manuels. Notre métier s’apprend, c’est un métier de compagnonnage que nous avons le devoir de transmettre ». Cette citation décrit exactement mon expérience doctorale sous la direction du Dr Daniel Grenier marquée par sa volonté de transmission. Il est à l’origine d’une communication facilitée pour un partage d’expériences et de compétences qui m’ont permis de grandir et de développer différentes aptitudes. Pour cela, je lui exprime ma sincère gratitude et le remercie de la confiance qu’il a su m’accorder, de sa bienveillance et de l’excellence de son encadrement sur lequel repose la réussite de ce projet.

Mes remerciements s’adressent également aux membres du jury qui ont suivi l’évolution de ce projet et fourni leurs critiques constructives au cours des nombreuses rencontres de mon comité aviseur. Plus particulièrement le Dre Fatiha Chandad pour sa disponibilité et ses précieux conseils ainsi que le Dr Reginaldo Gonçalves pour son apport sur les aspects cliniques de la parodontie. Je remercie le Dre Mariela Segura pour avoir accepté d’être évaluatrice externe de cette thèse.

J’exprime aussi toute ma gratitude à tous mes enseignants, qui m’ont transmis leur savoir et leur expérience et qui m’ont donné le goût d’apprendre, le devoir d’enseigner et le besoin de chercher de nouvelles connaissances.

Dans le cadre d’un sport collectif, les équipes les plus performantes ne sont pas obligatoirement celles composées des meilleurs joueurs, chacun pris individuellement. Elles sont plutôt formées par des joueurs performants qui ont appris à jouer ensemble. Il en est de même dans le monde de la recherche. Pour cela je ne remercierai jamais assez l’ensemble des membres du laboratoire du Dr Grenier pour leurs soutiens, leurs aides et la bonne humeur qui m’ont permis d’apprécier chaque instant passé dans ce cocon protecteur. Ce parcours atypique, multiculturel et coloré je le dois finalement à mes murs porteurs qui m’ont encouragée et accompagnée dans toutes mes démarches; mes parents qui nous ont permis à mes sœurs et à moi-même de développer peu à peu nos personnalités et de nous épanouir. Je les remercie pour la richesse de notre enfance bercée de nos voyages et de toutes ses découvertes remplies de bonheurs simples que peuvent ressentir tous les enfants et qui touchent encore les adultes nostalgiques de leur propre enfance. Se sentir aimer et entourer, parvenir à être fier de ses parents et de nous-mêmes est à la fois unique et universel.

(25)

Avant-propos

La présente thèse de doctorat est divisée en sept chapitres. Le chapitre 1 représente une mise en contexte du sujet de thèse sous forme d’une revue de littérature actualisée. S’en suit le chapitre 2 où la problématique, l’hypothèse et les objectifs de recherche seront détaillés. Les principaux résultats obtenus dans ce projet doctoral ont fait l’objet de publications dans des journaux avec comité de lecture et sont retranscrits dans les chapitres 3, 4 et 5 avec l’autorisation des coauteurs et dans le respect des licences de diffusion. Finalement, une discussion générale des résultats obtenus sont abordées dans le chapitre 6 ainsi qu’une conclusion générale et les perspectives futures dans le chapitre 7.

Chapitre 3: Effets des polyphénols de thés sur les composantes étiologiques de la

maladie parodontale

Article 1: Cet article a été publié sous la référence Ben Lagha, A. & Grenier, D. Black tea

theaflavins attenuate Porphyromonas gingivalis virulence properties, modulate gingival keratinocyte tight junction integrity and exert anti-inflammatory activity. J Periodontal Res

52, 458-470, doi:10.1111/jre.12411 (2017). La contribution des auteurs est la suivante : le

premier auteur (Amel Ben Lagha) a effectué toutes les expériences à l’exception des résultats de qPCR réalisés par Jade Fournier. Le premier auteur a rédigé la première version du manuscrit. Le tout a été effectué sous la supervision de Dr Daniel Grenier qui a également contribué à la conception des expériences, l’analyse des données et la révision du manuscrit.

Article 2: Cet article a été publié sous la référence Ben Lagha, A. Groeger, S. Meyle, J. &

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against invasion by Porphyromonas gingivalis. Pathog Dis, doi:10.1093/femspd/fty030 (2018). Les Dre Groeger et Dr Meyle ont fourni les kératinocytes gingivaux au laboratoire. Le premier auteur (Amel Ben Lagha) a effectué toutes les expériences et a rédigé la première version du manuscrit. Le tout a été effectué sous la supervision de Dr Daniel Grenier qui a également contribué à la conception des expériences, l’analyse des données et la révision du manuscrit.

Article 3: Cet article a été publié sous la référence Ben Lagha, A. & Grenier, D. Tea

polyphenols inhibit the activation of NF-kappaB and the secretion of cytokines and matrix metalloproteinases by macrophages stimulated with Fusobacterium nucleatum. Sci Rep 6, 34520, doi:10.1038/srep34520 (2016). Les expérimentations et la rédaction de cet article ont été effectuées par le premier auteur sous la supervision du directeur de recherche le Dr Daniel Grenier.

Article 4: Cet article a été publié sous la référence Ben Lagha, A. Haas, B. & Grenier, D.

Tea polyphenols inhibit the growth and virulence properties of Fusobacterium nucleatum. Sci Rep 7, 44815, doi:10.1038/srep44815 (2017). La contribution des auteurs est la suivante: le premier auteur (Amel Ben Lagha) a effectué toutes expériences excepté les essais de production de H2S réalisés par Bruno Haas. Le premier auteur a rédigé le manuscrit sous la

supervision de Dr Daniel Grenier qui a également contribué à la conception des expériences, l’analyse des données et la révision du manuscrit.

Article 5: Cet article a été publié sous la référence Ben Lagha, A. & Grenier, D. Tea

polyphenols protect gingival keratinocytes against TNF-α-induced tight junction barrier dysfunction and attenuate NF-κB activation of and IL-1β secretion by

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monocytes/macrophages. Cytokine 115 (2019) 64-75. La contribution des auteurs est la suivante: le premier auteur (Amel Ben Lagha) a effectué toutes expériences et a rédigé le manuscrit sous la supervision de Dr Daniel Grenier qui a également contribué à la conception des expériences, l’analyse des données et la révision du manuscrit.

Chapitre 4: Impact des polyphénols de bleuet et de canneberge sur les composantes

étiologiques de la maladie parodontale

Article 6: Cet article a été publié sous la référence Ben Lagha, A. Dudonne, S. Desjardins,

Y. & Grenier, D. Wild Blueberry (Vaccinium angustifolium Ait.) Polyphenols Target Fusobacterium nucleatum and the Host Inflammatory Response: Potential Innovative Molecules for Treating Periodontal Diseases. J. Agric. Food Chem. 63, 6999-7008, doi:10.1021/acs.jafc.5b01525 (2015). La contribution des auteurs est la suivante : le premier auteur (Amel Ben Lagha) a effectué toutes les expériences à l’exception de la caractérisation de l’extrait de bleuet effectuée par Madame Stéphanie Dudonné et le Dr Yves Desjardins. Le premier auteur a rédigé le manuscrit sous la supervision de Dr Daniel Grenier qui a également contribué à la conception des expériences, l’analyse des données et la révision du manuscrit.

Article 7: Cet article a été publié sous la référence Ben Lagha, A. LeBel, G. & Grenier, D.

Dual action of highbush blueberry proanthocyanidins on Aggregatibacter actinomycetemcomitans and the host inflammatory response. BMC Complement Altern Med

18, 10, doi:10.1186/s12906-017-2072-x (2018). La contribution des auteurs est la suivante :

Geneviève Lebel a réalisé les essais antibactériens et anti-biofilms. Le premier auteur (Amel Ben Lagha) a effectué le reste des expériences et a rédigé la première version du manuscrit.

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Le tout a été effectué sous la supervision de Dr Daniel Grenier qui a également contribué à la conception des expériences, l’analyse des données et la révision du manuscrit.

Article 8: Cet article a été soumis dans la revue "Cell death & disease" sous la référence

Ben Lagha, A. Howell, A. & Grenier, D. Cranberry proanthocyanidins neutralize the effects of Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin. La contribution des auteurs est la suivante : le premier auteur (Amel Ben Lagha) a effectué toutes les expériences et a rédigé le manuscrit sous la supervision de Dr Daniel Grenier qui a également contribué à la conception des expériences, l’analyse des données et la révision du manuscrit. Le Dr Howell a fourni l’extrait de PACs de canneberge.

Chapitre 5: Effet du resveratrol sur les propriétés de virulence de Porphyromonas

gingivalis et sur les mécanismes de défense innée

Article 9: Cet article a été soumis dans la revue "Molecular Oral Microbiology" sous la

référence Ben Lagha, A. Andrian, E. & Grenier, D. Resveratrol attenuates the pathogenic and inflammatory properties of Porphyromonas gingivalis. La contribution des auteurs est la suivante : le premier auteur (Amel Ben Lagha) a effectué toutes expériences. Le manuscrit a été rédigé par Elisoa Andrian et Amel Ben Lagha sous la supervision de Dr Daniel Grenier qui a contribué à la conception des expériences, à l’analyse des données et la révision du manuscrit.

(29)

CHAPITRE 1

(30)

Préambule

epuis leur apparition sur Terre, les plantes ont toujours fait partie de l’alimentation humaine puisqu’il n’est physiologiquement pas possible pour l’Homme de se nourrir exclusivement de produits d’origine animale 1_.

La thérapie par les plantes médicinales se développa au fil des siècles et des cultures. Les plus anciennes traces écrites décrivant la médecine traditionnelle à base de plantes ont été retrouvées en Chine, en Inde, en Mésopotamie et en Égypte. L’un des premiers recueils médicaux retrouvés et retranscrits est le papyrus Ebers, qui aurait été rédigé durant l’antiquité égyptienne vers 1600 ans avant notre ère; il représente une importante pharmacopée où sont décrites environ 800 préparations thérapeutiques à base de plantes et de minéraux 2,3. Durant l’antiquité grecque vers 460 avant Jésus-Christ, Hippocrate, considéré comme le théoricien de la santé par l’alimentation, a mis l’emphase sur l’importance des aliments pour le maintien de la bonne santé. Contrairement aux croyances jusqu’alors adoptées, à savoir que les maladies sont la conséquence d’une intervention divine; Hippocrate rationalise le concept de maladie et propose que les pathologies soient des causes naturelles et que l’alimentation joue un rôle primordial dans l’équilibre du maintien de la santé 4. Cette théorie influencera les conceptions des scientifiques pendant plus de deux millénaires ouvrant la voie de la diététique, de la connaissance des aliments et de la phytothérapie. Au début du XIXe siècle, la découverte de nombreux principes actifs issus de plantes bouleversa rapidement la médecine par l’isolement de la morphine de l’opium, de la strychnine de la noix vomique et de la quinine de l’écorce de quinquina 5_.

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Durant les dernières décennies, de grandes firmes pharmaceutiques, des universités et d’autres organismes recensent et développent les usages traditionnels de tous les végétaux possibles en questionnant les populations et, en particulier, les "guérisseurs" afin d’isoler de nouvelles molécules bioactives issues de plantes. C’est ainsi que nous assistons à l’émergence d’une médecine nutritionnelle qui vise à conserver le plus longtemps possible la santé en optimisant les fonctions des cellules, des tissus et des organes sous l’action de nutriments de qualité. Parmi la grande diversité des molécules bioactives retrouvées dans les plantes, de nombreuses recherches se sont concentrées sur les effets physiologiques des phytonutriments, plus particulièrement les polyphénols. Les phytonutriments sont des métabolites présents à l’état naturel dans les aliments d’origine végétale, nécessaires à l’organisme humain et agissant en combinaison avec d’autres nutriments essentiels 6_{. Dans}

ce contexte, les fruits comme les baies (canneberge, bleuet, cerise, raisin rouge, fraise), les légumes, le thé, le cacao ou encore le vin rouge constituent des aliments très riches en polyphénols et font l’objet de plus en plus d’attention de la part de la communauté scientifique 7.

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I. Généralités: Les polyphénols

Les polyphénols sont impliqués dans diverses fonctions physiologiques du règne végétal à savoir la croissance, la lignification, la pigmentation, la pollinisation de même que dans la protection contre le rayonnement ultraviolet et la résistance face aux prédateurs exogènes tels que les insectes nuisibles ou les microorganismes 8,9_{. Les végétaux n’étant pas mobiles,}

ont recours à leur contenu phénolique pour se protéger des préjudices environnementaux. Synthétisés naturellement par les plantes, les polyphénols sont les métabolites secondaires les plus abondants et sont distribués de manière ubiquitaire dans la plupart des tissus végétaux 9. Plus de 50 000 métabolites secondaires comprenant des groupements phénoliques de grande diversité, sont compartimentés dans les vacuoles des cellules végétales 9. Dans les aliments, les polyphénols peuvent contribuer à la richesse nutritive, l’astringence, la couleur, la saveur, l’odeur et la stabilité oxydative. Vers la fin du XXe

siècle, des études épidémiologiques et des méta-analyses associées ont fortement suggéré que la consommation à long terme d’aliments riches en polyphénols réduisait le développement et la progression de cancers, de maladies cardiovasculaires, du diabète, de l’ostéoporose et de maladies neurodégénératives 7,10,11_{. Les polyphénols sont naturellement}

présents dans l’ensemble des tissus de la plante, de la racine jusqu’aux fruits. L’homme ne possédant pas la capacité de les synthétiser, ceux-ci doivent être apportés par son alimentation. Les fruits comme les raisins, les pommes, les agrumes, les canneberges et les baies contiennent jusqu’à 200 à 300 mg de polyphénols par 100 grammes de poids frais 12_.

Les produits alimentaires fabriqués à partir de ces fruits contiennent également des polyphénols en quantités significatives. Typiquement, un verre de vin rouge ou une tasse de

(33)

thé ou de café contient environ 100 mg de polyphénols 12_{. Les céréales, les légumineuses}

sèches et le chocolat contribuent également à l’apport polyphénolique 13,14_.

II. Structure et classes des polyphénols

Composés très répandus dans le règne végétal, les polyphénols ou composés phénoliques forment une famille étendue de molécules biologiques jouant un rôle protecteur chez les plantes. Biochimiquement, les polyphénols montrent une grande variété structurale allant de composés contenant un simple noyau phénolique (acide phénolique) à des composés polymériques complexes comme les tanins (polymères de catéchine et épicatéchine présentant plusieurs dizaines d’unités) 14_{. Actuellement, plus de 8 000 composés}

polyphénoliques ont été identifiés dans le règne végétal, et sont divisés en une dizaine de classes chimiques 15,16_{. Tous les composés phénoliques végétaux proviennent d’un}

intermédiaire commun, la phénylalanine ou un précurseur proche, l’acide shikimique. Ces molécules sont caractérisées par une structure chimique commune, constituée d’au moins un cycle aromatique portant un ou plusieurs groupements hydroxyles 7. L’association avec d’autres composés, comme les acides carboxyliques et organiques, les amines, les lipides et les liaisons avec d’autres phénols sont également fréquentes 17_{. Toutes ces structures}

confèrent aux polyphénols de multiples propriétés et de nombreux bienfaits pour la santé. Les polyphénols peuvent être classés en différents groupes en fonction du nombre de cycles phénoliques qu’ils contiennent et des éléments structuraux qui lient les cycles les uns aux autres. Les principales classes polyphénoliques comprennent les acides phénoliques, les flavonoïdes, les stilbènes et les lignanes (Figure 1) 14_{. Les flavonoïdes sont largement}

(34)

l’alimentation humaine. Les flavonoïdes peuvent être divisées en six sous-groupes: 1) les flavanols, 2) les flavones, 3) les isoflavones, 4) les flavanones, 5) les flavonols et 6) les anthocyanines. Les flavanols peuvent être polymérisés pour créer des flavanoïdes également appelés tanins condensés (proanthocyanidines) 7. Les stilbènes sont quant à eux composés de deux cycles aromatiques liés par un pont méthylène et peuvent être trouvés sous forme cis et trans ayant des propriétés biologiques et chimiques différentes 18_{. Le resvératrol,}

probablement le plus étudié des stilbènes peut également être retrouvé sous forme de dimères ou trimères comme les viniférines présentes dans le vin rouge.

(35)

(36)

III. Émergence de la recherche sur le potentiel

préventif et thérapeutique des polyphénols

En ce début de XXIe_{siècle, les défis majeurs des scientifiques et des industries}

pharmaceutiques sont de réaliser des innovations conceptuelles en vue de développer de nouveaux médicaments à action multiple (Figure 2). Ce besoin se traduit par l’espérance de vie grandissante, l’augmentation de la prévalence des maladies chroniques et la propagation de la résistance aux antibiotiques chez plusieurs agents pathogènes impliqués dans différentes maladies infectieuses.

Figure 2: Cibles thérapeutiques à considérer lors de la recherche de nouveaux médicaments.

Depuis 1995, le nombre de nouveaux médicaments introduits sur le marché a diminué de 50 %, malgré les investissements qui ont doublé et le progrès des technologies 19_{. Il est}

intéressant de constater qu’environ 50 % des médicaments approuvés entre 1981 et 2006 provenaient directement ou indirectement de produits naturels 20. Cette observation suggère

(37)

que les molécules bioactives de plantes contiennent plus de sources potentielles de médicaments que les composés synthétisés par la chimie combinatoire. Des études qui s’intéressent à la conceptualisation évolutive ont suggéré que la biologie évolutive est susceptible de fournir des explications afin de comprendre le potentiel thérapeutique des polyphénols et des inspirations pour la découverte de nouveaux médicaments 21. La théorie évolutive reconnait que toutes les espèces ont un ancêtre commun hypothétique de telle sorte qu’un certain nombre de gènes humains devraient avoir des orthologues dans les génomes de plantes et de microbes expliquant la possibilité de découvrir des molécules activement intéressantes au sein d’autres règnes vivants 21_{. Grâce à ce rapprochement génétique, des}

chercheurs utilisent quotidiennement des organismes modèles issus de différents règnes tels que la levure, la drosophile ou encore l’arabette des dames (Arabidopsis thaliana) afin d’élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Par exemple, 70 % des gènes impliqués dans le cancer sont retrouvés chez Arabidopsis thaliana, ce qui a permis aux scientifiques d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques comme les voies de signalisation cellulaire 22_.

Un deuxième concept en biologie évolutive qui supporte le fort potentiel de développement de médicaments à partir des polyphénols est le fait de la coévolution entre les différents organismes. Durant la coévolution à long terme au sein des communautés biologiques, les organismes en interaction peuvent synthétiser diverses molécules pouvant affecter les espèces environnantes 21_{. Certains de ces agents naturellement synthétisés peuvent être d’un}

intérêt médicinal pour l’Homme comme ce fut le cas pour les antibiotiques 23_{. La découverte}

et l’utilisation des antibiotiques ont permis de faire un grand pas dans la lutte contre les maladies infectieuses allongeant l’espérance de vie des personnes qui y ont accès d’environ 15 ans 24. L’âge d’or a duré un demi-siècle, période durant laquelle certains scientifiques avaient considéré que les maladies infectieuses étaient définitivement vaincues. Cependant,

(38)

au cours des dernières décennies, le miracle des antibiotiques a été sévèrement ébranlé avec la propagation exponentielle de la résistance bactérienne aux antibiotiques, qui pourrait nous ramener à l’ère préantibiotique 24_{. Par conséquent, la lutte contre la résistance aux}

antibiotiques à croissance rapide est une tâche urgente pour les « chasseurs de molécules ». C’est en étudiant le pouvoir antioxydant des polyphénols, que les scientifiques se sont intéressés à leur implication dans la santé humaine, afin de leur trouver de nouvelles fonctionnalités. Reconnus pour leur capacité à lier des protéines structuralement différentes, les polyphénols sont des molécules potentiellement prometteuses pouvant agir sur différentes cibles thérapeutiques. Par exemple la quercétine, l’un des flavonoïdes les plus répandus dans la nature, peut efficacement inhiber 12 cibles protéiques structuralement différentes 25. Généralement commercialisé sous forme de complément alimentaire, le flavonoïde Veregen a été récemment approuvé par la FDA (Food and Drug Administration des États-Unis) comme un médicament pour le traitement topique des verrues génitales et périanales externes

26,27_{. Fait intéressant, les concentrations intracellulaires de polyphénols nécessaires pour}

affecter les voies de signalisation cellulaire sont beaucoup plus faibles que celles nécessaires pour piéger les radicaux libres 28_{, il est donc proposé que l’avenir de la découverte de}

(39)

IV. Mécanismes

impliqués

dans

les

effets

bénéfiques des polyphénols pour la santé

Les polyphénols ont la capacité de se fixer aux protéines par un mécanisme de liaison non spécifique associé au groupement phénol ubiquitaire qui favorise les interactions polyphénols/protéines responsables des effets biologiques 29. Décrits comme étant de puissants antioxydants, les polyphénols sont capables de piéger dans l’organisme les radicaux libres qui altèrent les cellules, dégradent l’ADN et entrainent la mort cellulaire 30_{. Au sein}

des organismes vivants, une production excessive de dérivés réactifs de l’oxygène (ROS) incluant les radicaux libres, le peroxyde d’hydrogène, l’oxygène singlet et l’acide hypochloreux est associée à diverses situations pathologiques (cancers, diabète, arthrite rhumatoïde, maladies cardiovasculaires) d’où le potentiel préventif et thérapeutique des polyphénols vis-à-vis de ces maladies 31_{. Par la présence de domaines hydrophobes et}

hydrophiles, les polyphénols interagissent avec les lipides membranaires des cellules et les protéines 32-35_{. Ces interactions non spécifiques peuvent entrainer des changements}

fonctionnels associés à la membrane tels que les activités des enzymes membranaires, les interactions ligand-récepteur, les flux d’ions et/ou de métabolites et la modulation de la transduction du signal. La présence du groupement phénol permet également aux polyphénols de s’adsorber, se fixer et/ou s’insérer dans les membranes cellulaires au niveau de la bicouche lipidique. Ainsi en prenant en considération leur capacité à capturer les radicaux libres, lorsqu’ils sont adsorbés sur la surface de la membrane, les polyphénols pourraient constituer une barrière physique vis-à-vis des radicaux libres 36.

(40)

Subséquemment, lorsqu’une structure chimique spécifique d’un polyphénol interagit avec les protéines, il s’agira alors d’un mécanisme d’action spécifique. Ces interactions spécifiques dépendent des protéines impliquées notamment des enzymes, des récepteurs ou encore des facteurs de transcription cellulaire. Un large éventail de polyphénols est reconnu comme des inhibiteurs efficaces de l’activité d’un très grand nombre d’enzymes. Les cibles enzymatiques des polyphénols sont par exemple les enzymes ayant des purines (ATP) comme substrats tels que les kinases, les ATPases, les phosphodiestérases cycliques, les adénylate cyclases, les transcriptases inverses, les xanthines oxydases, les ARN et ADN polymérases, les ribonucléases et les ADN ligases 37. Étant donné la similitude entre les structures de l’ATP et du NADPH, les enzymes dépendantes du NADPH seraient également affectées par les polyphénols, tels que l’aldose réductase, la malate déshydrogénase, le lactate déshydrogénase, l’oxyde nitrique synthase et la glutathione réductase.

Une autre spécificité intéressante des polyphénols porte sur le pouvoir de modulation des facteurs de transcription cellulaire, notamment le facteur de transcription nucléaire NF-κB hautement impliqué dans la réponse immunitaire pro-infllammatoire 38_{. Ce facteur de}

transcription est essentiel pour l’expression de gènes inductibles associés aux réponses inflammatoires, incluant les cytokines (ex: TNF-α, IL-6), les métalloprotéinases matricielles (MMPs) et les molécules d’adhésion cellulaire (ex: ICAM) 39_{. À leur tour, ces médiateurs de}

l’inflammation peuvent induire la production de dérivés réactifs de l’oxygène (ROS) et ainsi générer une boucle de récontrôle positive 40. Il a été suggéré que le stress oxydatif et l’inflammation constituent des mécanismes homéostatiques/compensatoires maintenant la balance physiologique tissulaire. Lorsqu’un des mécanismes surcharge chroniquement l’autre, il y a un débalancement qui entraîne l’altération des processus physiologiques 40,41_.

(41)

Finalement, les mécanismes non spécifiques nécessitent des concentrations élevées de polyphénols dans la plupart des tissus, contrairement aux mécanismes plus spécifiques qui sont basés sur l’interaction entre des polyphénols spécifiques et des protéines particulières. Une meilleure connaissance de la nature et des conséquences biologiques des interactions des polyphénols avec les composants cellulaires contribuera certainement à développer des stratégies nutritionnelles et pharmacologiques orientées vers la prévention et le traitement des maladies persistantes.

V. Polyphénols et maladies chroniques

Cette capacité à interagir avec diverses protéines et à interférer dans les mécanismes de signalisation cellulaire peut expliquer les effets bénéfiques des polyphénols sur les désordres systémiques. Les maladies chroniques incluant les maladies cardiovasculaires, les maladies neurodégénératives et les maladies inflammatoires de l’intestin ont été associées en 2009 aux dix principales causes de décès au Canada. Dans le cadre de leurs préventions et leurs traitements, de nouvelles stratégies nutritionnelles basées sur la consommation d’aliments riches en polyphénols dans le but de réguler les perturbations fonctionnelles sont apparues (Figure 3) 11,13_.

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Figure 3: Effets pléiotropiques et bénéfiques des polyphénols sur la santé globale.

La prévalence des maladies cardiovasculaires est en constante hausse et constitue l’un des problèmes de santé les plus importants dans les pays industrialisés 42. Plusieurs études épidémiologiques ont révélé une association inverse entre le risque de développer des maladies cardiovasculaires et la consommation d’aliments riches en polyphénols. L’un des effets bénéfiques les plus étudiés des polyphénols est leur capacité à améliorer le profil lipidique 43_{. Par ce biais, les polyphénols aident à la prévention de l’apparition ainsi qu’à}

l’accumulation de lipides au niveau des parois artérielles afin de permettre la réduction de l’obstruction progressive des artères 44_{. On parlera alors de l’effet protecteur des polyphénols}

contre l’oxydation des lipoprotéines de basse densité ou LDL comme un élément antiathérogène 45,46. Il a été rapporté qu’une consommation modérée de vin riche en polyphénols peut être bénéfique, un fait connu à une certaine époque sous le nom de « paradoxe français » 47. Plus précisément, le resvératrol, l’un des principaux polyphénols du vin, entrave l’oxydation des LDL et diminue la cytotoxicité causée par les LDL oxydées dans les cellules endothéliales 48. Plusieurs expériences cliniques ont également établi que les

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suppléments de procyanidine réduisent significativement les valeurs de LDL oxydées chez les patients diabétiques 49.

Selon les estimations les plus récentes, un Canadien sur cinq sera âgé de plus de 65 ans en l’an 2030, augmentant ainsi la prévalence des maladies neurodégénératives dont la maladie d’Alzheimer. La maladie d’Alzheimer est une maladie multifactorielle et irréversible qui se caractérise par des problèmes de mémoire, une désorientation temporelle et spatiale de même qu’une altération du jugement, qui physiologiquement dépend du stress oxydatif qui affecte particulièrement les tissus cérébraux 50. Les antioxydants tels que les polyphénols pourraient donc contribuer à la prévention 51. Des études in vivo réalisées sur des rats vieillissants ont montré qu’un régime enrichi d’extraits d’épinard, de fraise ou de bleuet riche en polyphénols a amélioré leurs fonctions cognitives et la transduction du signal neuronal 52,53. Des études prospectives épidémiologiques, menées en France, au Danemark et au Canada ont démontré une relation négative entre la consommation modérée de vin rouge (riche en polyphénols) et le risque de développer des maladies neurodégénératives 54-56. Une telle association n’a pas été observée suite à la consommation de bière dans la cohorte danoise. Les troubles cognitifs étaient plus faibles chez les buveurs modérés que chez les non-buveurs dans une cohorte italienne, cependant la probabilité de déficience cognitive était plus élevée chez les buveurs excessifs (Figure 4) 57_{. Une association inverse entre la consommation de flavonols et de}

(44)

Figure 4: Les polyphénols, principes de vie ou de jouvence : oui, mais n’en abusez pas, attention aux dégâts!59

Les maladies inflammatoires de l’intestin se caractérisent par une inflammation chronique des tissus du tractus gastro-intestinal favorisant la formation d’ulcères pouvant causer des saignements 60_{. À plus long terme, la présence de maladies inflammatoires de l’intestin}

augmente le risque de développer un cancer de l’intestin ou encore un cancer colorectal 61_.

De nombreuses études in vitro ont montré les effets bénéfiques d’une grande variété de polyphénols tant sur la perméabilité de l’épithélium intestinal que sur la réponse inflammatoire traduisant ainsi le potentiel préventif et thérapeutique de ces molécules naturelles 62_{. En plus des cellules eucaryotes formant les tissus intestinaux, le microbiote}

symbiotique intestinal joue un rôle primordial dans le maintien de la santé intestinale. Des études récentes ont suggéré que les composés phénoliques influencent la composition de la microflore intestinale par des effets prébiotiques sélectifs et des activités antimicrobiennes dirigées contre les bactéries pathogènes de l’intestin 63-72_{. Les propriétés bénéfiques}

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contre les agents pathogènes, le renforcement des jonctions épithéliales intestinales, l’augmentation de la sécrétion du mucus intestinal et la modulation de la réponse immunitaire intestinale 73-75. Les polyphénols agissent également sur les activités enzymatiques bactériennes qui augmentent la prévalence du risque global de cancer. Utilisant un modèle in vivo chez le rat, des chercheurs ont montré que la supplémentation intragastrique en resvératrol réduisait significativement plusieurs activités enzymatiques bactériennes associées à la prévalence des tumeurs coliques. L’activité enzymatique bactérienne réduite était associée à une diminution significative de l’incidence des tumeurs coliques chez les rats nourris au resvératrol par rapport aux rats témoins 76.

VI. Polyphénols et maladies buccodentaires

Carie dentaire, halitose, maladie parodontale, candidose et cancer buccal représentent les affections les plus répandues de la cavité buccale affectant un large éventail de la population mondiale dépendamment de l’âge, du sexe, des origines ethniques et de la condition physique et impactant la qualité de vie des individus. Le point commun de ces affections réside dans la complexité de leur étiologie, puisqu’elles sont multifactorielles, généralement d’origine microbienne, mais également caractérisée par l’installation d’une inflammation chronique et d’un stress oxydatif non contrôlé par l’organisme. De nombreuses études se sont intéressées au potentiel préventif et thérapeutique des polyphénols dans la lutte contre les maladies buccodentaires (Tableau 1). Assurément, un même polyphénol contrairement à un antibiotique ou à un agent anti-inflammatoire peut être à la fois antibactérien, antifongique, anti-inflammatoire et antioxydant permettant ainsi une action simultanée sur plusieurs cibles

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thérapeutiques. En outre, ils représentent une économie publique plus durable qu’un système axé uniquement sur les traitements conventionnels 77.

Affectant environ 60 à 90 % des enfants, la carie dentaire se caractérise par une déminéralisation acide de l’émail de la dent. Les acides organiques produits par les bactéries cariogènes, dont Streptococcus mutans et Streptococcus sobrinus, à la suite de la fermentation des sucres de l’alimentation (principalement le sucrose), diminuent le pH des biofilms à des niveaux inférieurs à 5.5, une condition favorable à la dissolution de l’émail de la dent 78. Des recherches in vitro et in vivo ont montré que certains polyphénols contenus dans le raisin exerçaient des effets antibactériens vis-à-vis de S. mutans se manifestant par une inhibition de la croissance bactérienne et de l’adhésion aux surfaces de la dent 79,80_{. Il a}

également été rapporté que des extraits de raisin enrichis en polyphénols réduisent l’activité de la glucosyltransférase de S. mutans 81. Cette enzyme étant impliquée dans la synthèse du glucane, favorise l’adhésion bactérienne à la surface de la dent et la formation du biofilm 82.

L’halitose ou plus communément la mauvaise haleine affecte une grande proportion de la population entrainant de nombreux impacts socio-économiques. Plusieurs bactéries sont impliquées dans la production de composés sulfurés volatils (CSVs), principalement le sulfure d’hydrogène (H2S), le méthanethiol (CH3SH) et le diméthylsulfate 83,84 provoquant la

diffusion d’odeur nauséabonde. Des études ont démontré que le thé vert et son principal constituant l’épigallocatéchine gallate (EGCG), pouvait réduire la mauvaise haleine en agissant directement sur le processus de formation de ces composés volatils 85,86 ou en agissant indirectement sur la croissance des bactéries impliquées dans l’halitose 87.

(47)

La candidose buccale est une infection des muqueuses buccales très fréquente et le plus souvent associée au mycète Candida albicans. Son pouvoir de virulence est associé à son aptitude à former un biofilm, à entrainer une réponse inflammatoire importante et à sa capacité de passer de la forme levure à la forme hyphe caractéristique d’une invasion tissulaire accrue 88. Il a été démontré que l’EGCG présente des activités fongicides variables en fonction du temps et de la concentration 89_{. En effet, C. albicans s’est révélé sensibles à}

ce polyphénol, suggérant que les catéchines du thé pourraient être utiles dans le traitement des infections fongiques des muqueuses buccales, de l’intestin et du vagin 89.

Les cancers de la bouche et du pharynx sont des lésions malignes qui touchent les lèvres, les glandes salivaires, la langue, l’oropharynx, le nasopharynx et l’hypopharynx. Les tumeurs malignes qui se manifestent dans différents sièges anatomiques sont surtout des carcinomes spinocellulaires ou épidermoïdes, c’est-à-dire des lésions qui gagnent les cellules squameuses. Des études sur plusieurs cohortes ont démontré une association inversée entre la consommation de fruits et de légumes et le développement de cancers buccaux pharyngés, en particulier avec une nutrition riche en flavonoïdes 90-93_{. Inversement lorsque l’apport}

quotidien en polyphénols est faible, environ 20 à 25 % de ces tumeurs peuvent être favorisées

94,95_{. Reconnus pour leurs effets antiprolifératifs et pro-apoptotiques sur les cellules}

tumorales, les polyphénols pourraient contribuer à la prévention des cancers buccaux.

Dans une étude épidémiologique récente, une légère association inverse entre la consommation de thé vert et la maladie parodontale a été observée se traduisant par une réduction de la profondeur de sondage moyenne et de la perte d’attachement des tissus de soutien de la dent 96_{. Réalisées sur des modèles animaux ou chez l’humain, des études ont}

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démontré que le thé réduisait significativement l’indice de plaque dentaire et de carie 97-100_et

que la délivrance de polyphénols du thé vert et du thé noir dans la bouche pendant 2 à 5 minutes augmente la capacité antioxydante de la salive 101. Ces résultats suggèrent que l’application continue des polyphénols du thé au quotidien pourrait représenter une méthode utile et pratique dans la prévention de la maladie parodontale.

Un des objectifs de la recherche actuelle et de la présente thèse est de parvenir à comprendre l’impact de divers polyphénols sur les composantes étiologiques de la maladie parodontale. L’intérêt étant l’identification d’un polyphénol ayant un potentiel anti-inflammatoire, antioxydant et antimicrobien agissant au niveau sous-gingival, et ne causant pas d’effets secondaires dans un but préventif et thérapeutique.

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Tableau 1 : Potentiel préventif et thérapeutique des polyphénols envers les maladies buccodentaire.