Imagerie de neurones en profondeur par fibre optique avec champ de vue variable et imagerie à grand champ volumétrique rapide avec sectionnement optique HiLo

Imagerie de neurones en profondeur par fibre optique

avec champ de vue variable et imagerie à grand champ

volumétrique rapide avec sectionnement optique HiLo

Mémoire

François Côté

Maîtrise en biophotonique - avec mémoire

Maître ès sciences (M. Sc.)

Imagerie de neurones en profondeur par fibre optique

avec champ de vue variable et imagerie à grand

champ volumétrique rapide avec sectionnement

optique HiLo

Mémoire

François Côté

Sous la direction de:

Daniel Côté, directeur de recherche Martin Lévesque, codirecteur de recherche

Résumé

Un des défis majeurs en neurosciences est d’acquérir des images de neurones profondément dans le cerveau tout en gardant un champ de vue raisonnable et en causant le moins de dommage possible au tissu. Le premier projet décrit dans ce mémoire consiste en un système endoscopique à balayage laser. En utilisant des composantes micro-optique au bout d’une fibre monomode de 125 µm de diamètre, un laser vient être focalisé sur le côté de cette fibre à environ 60 µm de celle-ci. Un micro capillaire de verre de 250 µm de diamètre externe et 150 µm de diamètre interne sert de guide pour cette fibre dans l’échantillon. Le point focal possède un diamètre entre 2 et 3 µm et peut être balayé sur une même ligne horizontale à une vitesse de 30 Hz et sur un angle de 90o _{par un système construit spécialement pour}

suivre la géométrie cylindrique de l’endoscope. Un actuateur piezoélectrique déplace la fibre verticalement avec une résolution microscopique sur un intervalle de 400 µm pour compléter une image cylindrique. Le fait de collecter le signal de fluorescence sur le côté de la fibre facilite son utilisation lors de l’acquisition et permet d’acquérir des images sur des zones non affectées par la chirurgie. De plus, le champ de vue du système est contrôlé par l’angle de balayage et la translation verticale de la fibre, donc complètement indépendant du diamètre de celle-ci. En utilisant des longueurs de fibres à gradient d’indice différentes, il est également possible de modifier le champ de vue du système, sans modifier son diamètre. Il a été possible avec ce système d’acquérir des images de microglies dans le mésencéphale d’une souris CX3CR1-GFP. Le système est prêt à être utilisé pour de l’imagerie calcique sur une ligne de pixel.

L’imagerie de cerveaux entiers peut révéler une panoplie d’informations permettant de mieux comprendre le développement neuronal à l’échelle microscopique, mais également macrosco-pique. De plus, visualiser le cerveau comme un tout permet de mieux conceptualiser comment différentes maladies l’affectent dans son ensemble plutôt que de s’intéresser qu’à certaines structures spécifiques. En ce moment, il existe deux défis quant à l’imagerie de cerveau de souris complet : 1) le temps d’acquisition souvent très long (plusieurs heures) et 2) la créa-tion d’une grande quantité de données qui requiert une gescréa-tion ordonnée et spécifique pour ce genre d’application. Pour pallier à ces défis, on présente dans ce mémoire un système d’ima-gerie volumétrique à excitation 1-photon ayant une résolution raisonnable, capable d’acquérir un cerveau de souris entier avec sectionnement optique en quelques minutes. Il s’agit d’une combinaison entre un système à grand champ et l’algorithme HiLo. Le champ de vue est

d’en-viron 24 mm2 _{et permet de voir un cerveau de souris âgé d’un jour en presque une image}

avec une résolution latérale de 2 µm et une résolution axiale d’environ 4 µm. Cette résolution permet l’acquisition de corps cellulaires et de projections axonales. Ce système permet donc d’enregistrer les images dans un format plus facile à utiliser et prenant moins d’espace disque. Cet outil permettrait de valider la qualité des échantillons volumétriques avant de passer aux systèmes hautes résolutions. Finalement, puisque ce microscope est rapide, possède un champ de vue très large et ne requiert pas d’objectifs haute résolution pour l’imagerie 2-photons, il serait un outil idéal pour des échantillons en "Expansion Microscopy" (technique permet-tant de grossir les échantillons sans perdre l’intégrité structurelle), technique maintenant très populaire en neurobiologie.

Abstract

Imaging cells and axons in deep brain with minimal damage while keeping a sizable field of view remains a challenge, because it is difficult to optimize one without sacrificing the other. We propose a scanning method reminiscent of laser scanning microscopy to get a reasonable field of view with minimal damage deep in the brain. By using micro-optics at the tip of our 125 µm-diameter singlemode fiber inside a 250 µm capillary, we can create a focal spot on the side of the fiber at a distance of approximately 60 µm. The focal spot has a 2 µm diameter and can be scanned at up to 30 hertz by a custom scanning device over a 90 degree angular sweep on a single line. A piezoelectric actuator moves up and down the fiber to achieve a cylindrical scanning pattern. By having this side illumination, there is no need for surgical exposure of the tissue, making our method simple and easy to achieve. The field of view is controlled by the angular and vertical sweeps, unrelated to the fiber diameter. Furthermore, by modifying the length of the grin lens, we could directly increase or decrease the field of view of our optical system, without any change on the probe diameter. We have succeeded in imaging microglia in the midbrain of a CX3CR1-GFP mouse. The system is also ready for calcium imaging on single pixel lines.

Imaging whole mouse brains can provide a wealth of information for understanding neuronal development at both the microscopic and macroscopic scale. Furthermore, visualizing entire brain samples allow us to better conceptualize how different diseases affect the brain as a whole, rather than only investigating a certain structure. Currently, two main challenges exist in achieving whole mouse brain imaging: 1) Long image acquisition sessions (on the order of several hours) and 2) Big data creation and management due to the large, high-resolution image volumes created. To overcome these challenges, we present a fast 1-photon system with a slightly decreased resolution allowing whole brain, optically sectioned imaging on the order of minutes by using a mathematical algorithm termed “HiLo”. Our large field of view (25 mm2₎

allows us to see an entire newborn mouse brain in a single snapshot with a resolution of about 2 µm in lateral direction and 4 µm in axial direction. This resolution still allows visualization of cells and some large axonal projections. This technological advancement will first and foremost allow us to rapidly image large volume samples and store them in a smaller format without losing the integral information, which is mainly stained-cell quantity and location. Secondly, the design will allow for increased successful high-resolution imaging by screening

for well-stained samples before commencing their multi-hour acquisitions. Lastly, since the microscope has a large field of view and does not require collection objectives needed in 2-photon high resolution microscopes, we can use this device to image expansion microscopy (a technique which can grow samples while keeping their structural integrity) samples as they are quickly gaining interest in the biological field.

Table des matières

Résumé iii

Abstract v

Table des matières vii

Liste des tableaux ix

Liste des figures x

Remerciements xv

Avant-propos xvii

Introduction 1

1 Imagerie par fluorescence en biologie 6

1.1 Principe de fluorescence . . . 6

1.2 Diffusion de la lumière . . . 7

1.3 Absorption de la lumière . . . 8

1.4 Faisceau gaussien . . . 8

1.5 Invariant optique . . . 9

1.6 Microscopie à grand champ de vue . . . 9

1.7 Microscopie à balayage laser . . . 10

1.8 Microscopie par feuillet de lumière . . . 11

1.9 Transparisation des tissus . . . 12

1.9.1 iDisco . . . 13

1.9.2 Expansion Microscopy . . . 14

1.9.3 SHIELD . . . 15

2 Imagerie longitudinale de neurones in vivo en profondeur 16 2.1 Imagerie par fibre optique . . . 16

2.2 Montage optique . . . 18 2.3 Simulations . . . 20 2.4 Logiciel . . . 23 2.5 Caractérisation . . . 25 2.5.1 Résolution. . . 25 2.5.2 Profondeur de champ . . . 26

2.7 Imagerie calcique . . . 29

2.8 Imagerie in vivo. . . 31

2.9 Discussion . . . 31

3 Imagerie volumétrique rapide avec sectionnement optique HiLo 37 3.1 Objectifs. . . 37

3.2 Les tavelures dans une fibre optique et leurs propriétés . . . 38

3.3 Simulations . . . 39

3.4 Montage optique . . . 41

3.5 Développement mathématique du HiLo. . . 43

3.6 Caractérisation . . . 44

3.6.1 Taille des grains laser . . . 44

3.6.2 Résolution. . . 46

3.7 Efficacité de transition du scrambler de GigaConcept . . . 48

3.7.1 Résumé . . . 48

3.7.2 Méthode. . . 48

3.7.3 Résultats . . . 49

3.8 Imagerie de cerveaux transparents . . . 49

3.9 Discussion . . . 51

Conclusion 62 Bibliographie 64 A Codes de simulations du PIM 70 A.1 Sans capillaire. . . 70

A.2 Avec capillaire. . . 70

B Codes de simulations du HiLo 72 C Étude sur l’efficacité de transition du scrambler de GigaConcept 73 C.1 Fréquence d’allumage on/off du scrambler de 12.5Hz . . . 73

C.2 Fréquence d’allumage on/off du scrambler de 25Hz . . . 73

C.3 Codes - Mesure du temps de réponse du scrambler . . . 73

C.4 Codes - Mesure de la fréquence maximal d’utilisation du scrambler . . . 75

Liste des tableaux

3.1 Durée de la période transitoire du scrambler pour passer de l’étant uniforme à

des tavelures pour différentes acquisitions. . . 49

3.2 Taux de réussite du scrambler à passer d’un état uniforme à des tavelures à diffé-rente fréquence d’oscillation on/off. On remarque que typiquement, la fréquence

Liste des figures

1.1 Diagramme de Jablonski démontrant le concept de fluorescence.[4] . . . 7

1.2 Schéma d’un faisceau gaussien présentant ces caractéristiques.[5] . . . 9

1.3 Le produit de la surface de la source et son cône forme un invariant optique.[38] 10 1.4 Microscopie de fluorescence à champ large.[6] . . . 11

1.5 Principe de la microscopie confocal.[3] . . . 12

1.6 Feuillet de lumière créé à partir de lentilles cylindriques.[12] . . . 13

1.7 Feuillet de lumière créé par balayage d’un faisceau gaussien.[23] . . . 13

2.1 Comparaison entre 3 types de fibre optique pour l’imagerie et la microscopie. . 17

2.2 De la micro-optique est ajoutée au bout de la fibre pour permettre son utilisation dans un système à balayage imageant. . . 19

2.3 Schéma du montage optique du PIM . . . 19

2.4 Représentation schématique de la reconstruction de l’image . . . 21

2.5 Le champ de vue du système n’est plus dépendant du diamètre de la fibre, mais de son système de balayage et de sa distance focale. . . 22

2.6 Tracer de rayons depuis la sortie de la fibre optique jusqu’au point focal, passant par les 2 barreaux de verre et la GRIN. . . 22

2.7 Tracer de rayons depuis la sortie de la fibre optique jusqu’au point focal, passant par les 2 barreaux de verre et la GRIN en considérant un capillaire de verre de 150 micromètres de diamètre interne et 250 micromètres de diamètre externe. . 23

2.8 Diagramme fonctionnel du logiciel d’acquisition du microscope. . . 24

2.9 Microbilles fluorescentes de 3-4 micromètres en diamètre. Image acquise par le microscope à fibre PIM. La barre correspond à 30 micromètres. . . 25

2.10 Profile d’intensité de 10 billes fluorescentes acquises avec un microscope confocal Zeiss LSM 710 et avec le PIM. . . 26

2.11 Amplitude normalisée en fonction de la distance séparant la fibre optique de la lame fluorescente. . . 27

2.12 Image prise dans la substance noire d’un cerveau de souris adulte marqué Anti-TH avec le fluorophore Alexa594. La barre d’échelle correspond à 60 micromètres. 28 2.13 Profil d’intensité d’un filament dendritique et d’un soma d’un neurone dopami-nergique dans la substance noire d’un cerveau de souris adulte avec un marquage anti-TH. . . 29

2.14 Signaux spontanés d’une tranche organotypique d’hippocampe de rat ayant été marquée avec un virus GCAMP6s. . . 30

2.15 Un microcapillaire de verre est utilisé comme guide pour l’imagerie in vivo. . . 31

2.16 Microglies dans le mésencéphale d’une souris CX3-CR1-GFP. . . 32

2.18 Microglies dans le mésencéphale d’une souris CX3CR1-GFP. . . 34

3.1 L’algorithme HiLo utilise deux types d’illumination laser pour fonctionner. . . . 38

3.2 Deux modes se propageant dans une fibre optique vont produire un patron

d’interférence. . . 39

3.3 Simulation par tracé de rayons de l’illumination du microscope HiLo. . . 41

3.4 Montage optique du microscope HiLo à grand champ de vue. . . 43

3.5 Les grains sont visibles après avoir appliqué un filtre passe-bas sur l’image prise

avec une lame de microscope fluorescente. . . 45

3.6 Les grains laser ne sont pas visibles sur l’image avec une illumination uniforme,

comme il est souhaité, même après avoir passé un filtre passe-bas. . . 46

3.7 a,b,c,d) Transformée de Fourier rapide ("Fast Fourier Transoform") d’images avec une illumination par tavelures provenant de différentes fibres avec des ou-vertures numériques (NA) variables. Le centre correspond aux basses fréquences

et les extrémités de l’image correspondent aux hautes fréquences. . . 54

3.8 Une cible Thorlabs R1DS1N est utilisée pour caractériser la résolution du système. 55

3.9 Les éléments 3 du groupe 7 sont les plus petits éléments que le microscope peut résoudre. Les éléments du groupe 4 deviennent trop flous. On voit que l’intensité

lumineuse de chaque ligne n’est pas constante. . . 55

3.10 Trois images HiLo consécutives d’une bille fluorescente de 3-4 µm de diamètre. Chaque image est séparée de 5 µm dans l’axe axial. Les figures d, e et f sont le

profil d’intensité correspondant pour chaque image sur la ligne présentée en a. . 56

3.11 Variance d’une série de données en fonction du temps. Vers 1 seconde, le scram-bler est allumé et la variance est donc élevée. À 2 secondes, le scramscram-bler est

arrêté et la variance passe à zéro. . . 56

3.12 Données de variance à partir du dernier pic de la figure 3.11 avec un fit. Le temps caractéristique correspond au temps pour descendre à 10% de la valeur

de variance maximale. . . 57

3.13 Cerveau de souris P1 avec marquage anti-TH Alexa594 avec deux types

d’illu-mination. La barre correspond à 1 mm. . . 57

3.14 Image HiLo d’un cerveau de souris P1 avec un marquage anti-TH et le

fluoro-phore Alexa594.. . . 58

3.15 Zoom sur des filaments axonaux avec l’illumination uniforme et HiLo, ainsi que

leur profile d’intensité correspondante. La barre équivaut à 500 micromètres.. . 59

3.16 Cerveau de souris P1 avec marquage anti-TH Alexa594 avec les deux types

d’illumination. La barre équivaut à 1 millimètre. . . 59

3.17 Image HiLo d’un cerveau de souris P1 avec un marquage anti-TH et le

fluoro-phone Alexa594. La barre équivaut à 1 millimètre. . . 60

3.18 Zoom sur une cellule dopaminergique située dans la région hypothalamique

antérieure avec son profil d’intensité. . . 60

3.19 Zoom sur une cellule dopaminergique située dans la substance noire avec son

profil d’intensité. . . 61

3.20 Vue d’un mésencéphale sur un hémisphère de cerveau de souris adulte en coupe

sagittal avec un marquage SHIELD anti-TH. . . 61

C.1 Données de variance lorsque le scrambler est allumé et éteint à une fréquence de 12.5Hz. On peut voir que les données descendent à zéro de variance, donc à

C.2 Données de variance lorsque le scrambler est allumé et éteint à une fréquence de 25Hz. On peut voir que les données ne descendent pas à zéro de variance,

There is no unique picture of reality

Remerciements

Je souhaite tout d’abord adresser toute ma gratitude à mon directeur de recherche Daniel Côté pour le temps qu’il m’a consacré malgré son horaire chargé. Mon séjour dans son labora-toire m’a beaucoup apporté, tant sur le plan scientifique que personnel. Ses nombreux conseils ont su nourrir mes réflexions et à pousser plus loin mes recherches. Il a su me guider dans cette grande aventure avec passion et rigueur. C’est avec cette même passion que je souhaite puiser mon inspiration dans le futur.

Je désire remercier mon codirecteur Martin Lévesque pour son écoute et sa disponibilité. Il m’a inclus dans son laboratoire même si je n’avais aucune connaissance en neurobiologie. Tou-tefois, je m’y suis toujours senti le bienvenu et m’a permis de mieux appréhender l’importante cohésion entre l’ingénierie et la science fondamentale. Les échantillons biologiques proviennent tous de son laboratoire et je n’aurais pas pu compléter ces deux projets sans son aide et celle de son équipe.

I would like to thank Damon DePaoli, my laboratory partner. This journey would not have been the same without him. His infinite curiosity and his intuition has always impressed me. His feedback on my results have been good checkpoints during the project development and were super helpful. Thanks you so much !

Un merci spécial à Véronique Rioux et Anne Sebilo pour leur aide avec les chirurgies des souris et la préparation des expériences in vivo. Travailler avec des prototypes de microscope est une chose, mais y impliquer des animaux vivants en est une autre. Leur aide fut fondamentale et très appréciée.

J’aimerais remercier les différents stagiaires du laboratoire à Daniel Côté pour l’énorme travail qu’ils ont fait pendant leur court passage. Ils ont fait progresser beaucoup de projets en suspens et plusieurs ont pu être finalisés. Je voudrais personnellement remercier Ludovick Bégin qui a programmé le logiciel d’acquisition du PIM (Aleph) en Python à partir de la librairie National Instruments. Il a relevé le défi à merveille et son aide fut primordiale pour le bon fonctionnement du projet.

Je voudrais exprimer ma reconnaissance envers les amis et collègues qui m’ont apporté leur support moral et intellectuel tout au long de ma démarche. Un grand merci à Charles Gora pour toutes ses heures passées ensemble au microscope HiLo et au lightsheet.

Enfin, merci à mes parents pour leur soutien inconditionnel et à mes trois soeurs pour leur encouragement.

Avant-propos

Ce mémoire est issu de ma maîtrise en biophotonique que j’ai réalisée dans les laboratoires des professeurs Daniel Côté et Martin Lévesque au centre de recherche CERVO à Québec. Mon projet portait sur le microscope à fibre PIM (« Panoramic Interstitial Microscope ») présenté au chapitre 2. Ce projet avait déjà été commencé par Joël Crépeau lors de sa maîtrise et a par la suite été repris par Nicolas Lapointe. Le but de mon projet était alors de rendre le système fonctionnel au laboratoire, de l’optimiser pour prendre des images in vivo dans des souris vivantes et de développer une méthode pour enregistrer l’activité calcique. Cette expérience m’a fait comprendre beaucoup de notions sur l’imagerie in vivo et sur l’ingénierie de système. Un article scientifique devrait sortir par rapport à ces résultats.

En commençant ma maîtrise, j’ai tout de suite été impliqué dans un second projet d’imagerie volumétrique avec sectionnement optique HiLo en utilisant un module à fibre optique. Le projet a bien fonctionné et nous avons pris la décision d’ajouter ce projet à mon mémoire. Le microscope a donc été optimisé pour l’imagerie volumétrique de cerveaux de souris. La transparisation des échantillons est nécessaire pour ces travaux, ce qui m’a apporté beaucoup de connaissances dans ce domaine d’étude. Ce projet devrait également mener à un article scientifique dans un futur proche.

Mon expérience sur la manipulation d’échantillons volumétriques transparents m’a permis d’être approché pour devenir responsable du microscope à feuillet de lumière du centre de recherche CERVO. Ce microscope a été développé par Cléophace Akitegetse pendant son doc-torat avec le professeur Daniel Côté en collaboration avec le professeur Martin Lévesque. Le microscope avait été utilisé principalement avec des échantillons idisco. Suite au départ de Cléophace à la fin de son projet, j’ai donc pris le relais de l’imagerie volumétrique avec ce microscope afin d’optimiser son utilisation avec d’autres méthodes de transparisation, comme clarity, SHIELD et « Expansion Microscope ». J’ai pris également soin de montrer son fonction-nement à quelques biologistes du groupe à Martin Lévesque pour que le microscope continue d’être utilisé suite à mon départ. Les résultats de ces expériences ne sont pas présents dans ce mémoire, mais feront l’objet d’une publication.

Ce passage au centre de recherche CERVO était une expérience enrichissante en termes de connaissances générales sur la microscopie et sur la recherche et développement. J’ai pu me forger une méthode de travail et développer des aptitudes en gestion de projet. La microscopie est un domaine fascinant qui oblige une certaine cohésion entre l’ingénierie et la science fonda-mentale. C’est un pont qui nous permet de jeter un regard direct sur les applications possibles des technologies que nous développons, ce qui nous encourage toujours à faire mieux.

Introduction

La microscopie a beaucoup évolué depuis les dernières décennies et ne cesse de susciter l’intérêt des chercheurs, tant dans les sciences de la vie que dans les sciences physiques. C’est un outil puissant qui permet de répondre à plusieurs questions, et ce, grâce à la lumière. L’optique est un domaine en constante expansion depuis la deuxième moitié du 20e siècle avec l’arrivée du laser. C’est grâce à la lumière et à ses propriétés que l’on doit la naissance de plusieurs outils telle que la microscopie par fluorescence, indispensable aujourd’hui en neurobiologie. En effet, la lumière peut être considérée à la fois comme une onde ou une particule que l’on appelle un photon. L’aspect ondulatoire est directement relié au concept de résolution à la microscopie par fluorescence avec le critère de Rayleigh, tandis que l’aspect particulaire aide à comprendre la détection avec les tubes photomultiplicateurs utilisés en microscopie confocal ou multi photon. Heureusement, les structures biologiques cellulaires et intracellulaires ont une grandeur de l’ordre du micron, soit environ le même ordre de grandeur que la lumière visible et proche infrarouge où la recherche dans le domaine a permis la création de plusieurs sources laser dans cette région du spectre. Il est ainsi possible d’élaborer des systèmes optiques à la fine pointe de la technologie utilisant ces sources pour résoudre des structures microscopiques, voir nanoscopique.

La synthèse et l’optimisation de la protéine GFP ("Green Fluorescent Protein") [18] ont fait naître un domaine d’étude qui à ce jour est vaste et toujours en expansion. La microscopie par fluorescence a littéralement révolutionné les façons de procéder dans les laboratoires recherches et la conception de nouveaux appareils est toujours une nécessité. Depuis sa création en 1994 par Roger Tsien, plusieurs dérivés ont fait leur apparition permettant l’utilisation de diverses longueurs d’onde d’excitation à travers le spectre visible. Il existe désormais une panoplie de ces marqueurs fluorescents sur le marché et il en existe même dont l’émission dépend de la concentration de calcium, comme le GCAMP6s et GCAMP6f [34]. Ce dernier est fort utile pour l’imagerie in vivo.

En neurobiologie, les protéines fluorescentes servent à tout moment dans de multiples appli-cations. Leur fréquente utilisation force parfois les chercheurs a créer des outils plus spécifiques à leurs besoins pour répondre aux questions qu’ils se posent. C’est le cas pour l’imagerie in vivo

ou l’imagerie profonde dans le cerveau où les outils étaient très limités par le passé. Encore aujourd’hui, beaucoup de défis restent à surmonter en ce qui concerne ce genre de technique, en raison du risque de la procédure et de la diffusion de la lumière dans le tissu augmentant la perte du signal d’excitation et de collection.

Un outil ayant révolutionné la recherche en neurosciences est sans doute la microscopie mul-tiphotonique [19,54]. Il est possible notamment avec cette technique d’observer et d’analyser l’activité neuronale dans un animal vivant. La microscopie par absorption 2-photon permet de prendre des images à plusieurs centaines de micromètres sous la surface du cortex sans être gêné par la diffusion de la lumière. L’arrivée de la microscopie 3-photons a fait grimper cette limite à près de 1,5 mm sans endommager le tissu. De plus, l’absorption multiphoto-nique procure un sectionnement optique de par sa nature non linéaire et sa faible probabilité de se manifester dans l’échantillon. Ce genre de microscopie permet notamment d’obtenir des résolutions spatiales de l’ordre d’une fraction de micromètre. De ce fait, la microscopie mul-tiphotonique a difficilement accès aux structures subcorticales. D’autres alternatives doivent être employées pour imager dans ces régions du cerveau.

C’est dans ce contexte que des techniques un peu plus invasives ont été inventées. Une de ces approches implique l’utilisation de lentilles GRIN ("gradient index") pour relayer le plan focal de l’objectif à un plan conjugué plus en profondeur. Ces lentilles ont la particularité d’avoir un changement d’indice de réfraction graduel et périodique sur leurs longueurs, ce qui permet d’obtenir relativement facilement un système de relais dans un barreau de verre. Il est possible de se procurer des lentilles GRIN relativement petites pour être utilisées dans un contexte chirurgical. Ainsi, ces lentilles peuvent être implantées dans le cerveau sans trop de dommage et relayer l’information d’un bout à l’autre de la lentille sur toute sa longueur jusqu’à un objectif et un système d’acquisition standard [44]. Éventuellement, ce genre de technique a gagné en popularité et a pu être utilisé pour enregistrer l’activité neuronale [44], effectuer de la photostimulation dans des souris libres de mouvement [51] ou simplement de l’imagerie 2-photon [2] en profondeur pour ne nommer que quelques exemples. La lentille GRIN a fait ses preuves en tant que solution viable pour l’imagerie en profondeur dans le cerveau sous différents modes d’opération. Or, il demeure que l’insertion d’un barreau de verre dans un cerveau de souris de cette taille (environ 0,5 millimètre pour les plus petits en diamètre) est dommageable et peut être problématique lors de la chirurgie. De plus, les performances de ce système sont souvent proportionnelles au diamètre de la lentille. Il y a donc forcément un équilibre à respecter entre les spécifications du système et le dommage qu’il va causer à l’animal, souvent irréversible.

Une autre méthode fort populaire est l’utilisation de composantes à fibre optique. Le princi-pal avantage des fibres optiques est leur petit diamètre. Ce dernier critère rend leur utilisation pour l’imagerie in vivo beaucoup plus permissive et facile à implémenter. La plupart

uti-lisent des fibres optiques multimodes ou des fibres multicoeurs et interprètent les résultats comme un système à grand champ de vue [39, 55]. Ces systèmes peuvent permettre une ré-solution allant jusqu’au micromètre avec évidemment un champ de vue proportionnel à leur diamètre. Ces fibres peuvent également permettre une analyse en photométrie de l’activité neuronale [17]. Toutefois, les fibres multimodes à un coeur peuvent être très difficiles à utiliser dans un contexte in vivo, puisque le phénomène d’interférence contenu dans le coeur doit être parfaitement maîtrisé et connu pour éventuellement reconstruire une image. Il est également possible d’enregistrer l’activité neuronale en photométrie avec des matrices de fibres.

Il est possible de combiner ces deux outils, les fibres optiques multimodes et les lentilles GRIN, pour obtenir des systèmes aussi performants [14,16]. Ce type d’endoscope est fortement utilisé en tomographie par cohérence optique [52,29,30].

Tous ces systèmes utilisent des fibres multimodes, mais les fibres monomodes sont très rarement utilisées. En effet, si on revient à un système à grand champ, une fibre monomode serait l’équivalent de l’enregistrement d’un pixel dans une image. Il serait possible d’utiliser ce système pour de la photométrie, mais l’efficacité de collection est trop faible comparativement à une fibre multimode beaucoup plus facile à appliquer dans ce genre d’application. Toutefois, en combinant la géométrie de la fibre optique avec un système approprié, il serait possible d’obtenir un endoscope semblable à un microscope confocal. Le fait que le laser sort sur le côté de la fibre optique rend le système très versatile et offre beaucoup d’avantages, notamment sur le champ de vue variable du système. Le système a été appelé le "Panoramic Interstitial Microscope" ou PIM et serait très prometteur pour l’imagerie profonde de neurones dans le cerveau.

Même si les expériences dans les animaux vivants peuvent procurer au chercheur une grande quantité d’information pertinente, toute la gestion autour de cette procédure est coûteuse et peut souvent être compliquée à se concrétiser. Souvent, il peut être beaucoup plus avantageux de travailler sur des échantillons ex vivo. C’est le cas lorsqu’on s’intéresse à des structures beaucoup plus volumineuses qui s’étendent sur plusieurs régions du cerveau, comme le système dopaminergique. En effet, acquérir un cerveau de souris complet procure une grande quantité d’information permettant de mieux comprendre le développement neurologique à l’échelle microscopique, mais également macroscopique. De plus, une image volumétrique d’un cerveau entier permet aux chercheurs de mieux conceptualiser les liens de causes à effets de différentes maladies qui affectent le cerveau comme un tout, plutôt que de s’interroger seulement des conséquences sur quelques régions.

La méthode la plus populaire à ce jour pour procéder à l’imagerie d’échantillons volumé-trique est sans doute la microscopie par feuillet de lumière. Elle a été utilisée en neurosciences pour la première fois en 2004 pour l’imagerie d’embryons [20] et n’a cessé de gagner l’intérêt

des groupes de recherche partout à travers le monde, de par sa simplicité d’utilisation et de la qualité des images qu’il est possible d’enregistrer. C’est un outil puissant permettant la visua-lisation du réseau de neurones dans un cerveau de souris entier [12]. Depuis, cette technique a fait place à plusieurs variantes comme le feuillet à balayage [23], une utilisation en excitation 2-photons [48], puis en 3-photons [13]. Un des défis majeurs de ce cette technique est la ré-solution axiale souvent moins performante que la réré-solution latérale. En raison des propriétés des faisceaux gaussiens, l’épaisseur du feuillet ne sera jamais uniforme. La résolution latérale peut atteindre des valeurs de quelques centaines de nanomètres, tandis que la résolution axiale varie normalement entre 4 et 20 µm [28]. Un compromis est inévitable, puisque la longueur de la feuille sera proportionnelle à l’inverse de la résolution axiale. Il est possible de remédier à cette situation en utilisant un faisceau de bessel à l’excitation plutôt que faisceau gaussien. Ce type de faisceau permet entre autres de former une longue ligne dont l’épaisseur est uniforme et peut atteindre un diamètre de l’ordre du micromètre. En utilisant cette ligne avec un sys-tème à balayage, il est possible d’obtenir un feuillet de lumière capable de fournir au syssys-tème d’imagerie une résolution isotropique.

Un cerveau de souris ayant un volume d’environ 250 mm3 _{peut générer près de 1 To de}

don-nées et demande plusieurs heures d’acquisition. Ce genre d’imagerie requiert donc un système de gestion et de traitement des données complet et robuste. Le temps entre la préparation de l’échantillon et l’analyse des images peut prendre plusieurs semaines. Les délais d’attente peuvent augmenter dans le cas où le marquage de l’échantillon n’a pas fonctionné ou si l’échan-tillon n’était pas assez de bonne qualité. Ce genre de situation peut devenir assez récurrent lorsque les chercheurs essayent de nouveaux protocoles. Ainsi, pour prévoir la qualité d’un échantillon, il peut être très pratique d’utiliser un système à grand champ de vue. C’est une méthode qui est rapide qui demande très peu de temps d’acquisition et qui génère très peu de données comparativement aux systèmes par feuillets de lumière. Cependant, ce genre de microscopie est très peu utilisé pour des échantillons volumétriques en raison de l’absence de sectionnement optique sur ces systèmes. Les images sont donc pour la plupart floues, puisque la lumière provenant de tout l’échantillon est enregistrée simultanément. Or, ce problème peut se résoudre grâce à la technique HiLo [56,27]. En combinant ces deux méthodes d’imagerie, on obtient un microscope capable d’acquérir un cerveau de souris entier rapidement de par son grand champ de vue de près de 35 mm2_{. Cet instrument serait un outil de choix pouvant}

prédire la qualité des échantillons volumétriques rapidement pour l’imagerie haute résolution. La microscopie par feuillet de lumière et la microscopie à grand champ de vue de volumes requièrent toutes deux que l’échantillon soit le plus transparent possible, sans quoi le laser ne pourrait pas pénétrer le tissu et exciter les protéines fluorescentes dans toutes les structures du cerveau. L’invention des méthodes de transparisation a permis d’améliorer grandement la qualité des images et d’améliorer la recherche en neurosciences en général. Il existe plu-sieurs protocoles ayant chacun leurs avantages et leurs inconvénients, les plus populaires étant

iDisco [45], clarity [10] et plus récemment l’« Expansion Microscopy » [7], ayant un intérêt grandissant en neurosciences. Cette dernière méthode fonctionne sur le principe de super-résolution en grossissant l’échantillon plutôt que de repousser les limites de super-résolution de la microscopie par fluorescence. Pour donner une idée de comparaison, un cerveau de souris adulte (ayant un volume d’environ 1,5 cm3_{) peut grossir jusqu’à un volume semblable à une}

balle de golf. Ainsi, toutes les structures qui composent le tissu peuvent grossir jusqu’à dix fois leur taille originale, ce qui revient à avoir une résolution dix fois meilleure. À ce jour, l’imagerie de tels échantillons s’effectue sur des tranches seulement, en raison du temps d’acquisition et la génération de donnée très élevés. La distance de travail des objectifs haute résolution en excitation et en collection des systèmes par feuillets de lumière limite l’imagerie à de petits volumes seulement, rendant impossible l’acquisition d’échantillons complets en « Expansion Microscopy ». C’est pour cette raison que l’on pense que le système à grand champ de vue jumelé à la technologie HiLo sera un candidat idéal pour ce genre d’imagerie.

Pour tester les systèmes dans une application biologique, on s’est intéressé particulièrement au système dopaminergique. L’impact de ces neurones est étudié en neurosciences sur plu-sieurs maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson. En effet, le principal lien de causalité avec cette maladie provient de la dégénérescence des neurones dopaminergiques de la substance noire dans le mésencéphale [1]. Ils ont un rôle primordial dans la locomotion, puisqu’ils sont impliqués dans la voie nigrostriée du système dopaminergique [11]. Leur dégé-nérescence amène alors une réduction de la dopamine jusque dans les régions du cerveau où ils projettent, soit le striatum, impliqué dans le contrôle moteur [9]. Les neurones dopaminer-giques peuvent donc être étudiés sous plusieurs formes. Tout d’abord, on peut examiner ces neurones localement dans le mésencéphale, ce qui requiert un système d’imagerie assez petit et versatile pour aller en profondeur dans le cerveau sans causer trop de dommage. Enfin, la globalité du système peut également être étudiée dans le cerveau, ce qui demande un micro-scope capable d’acquérir des images en trois dimensions rapidement sur un très grand champ de vue. Le système dopaminergique est donc un modèle d’étude idéal pour tester les deux microscopes qui seront discutés dans ce mémoire. Ces nouveaux outils pourront par la suite être utilisés en recherche fondamentale telle que la recherche sur maladie de Parkinson.

Chapitre 1

Imagerie par fluorescence en biologie

1.1

Principe de fluorescence

La fluorescence est un principe physique qui peut s’expliquer à partir des niveaux d’énergie des molécules. Le diagramme de Jablonski est souvent utilisé pour schématiser ce phénomène, comme on peut le voir à la figure1.1. De manière générale, la thermodynamique prédit qu’une molécule va demeurer à l’état stable électroniquement, puisque la différence d’énergie entre le niveau fondamental et les niveaux excités est beaucoup plus grande que le rayonnement thermique. Donc, pour passer du niveau fondamental à un niveau excité, les électrons doivent absorber de l’énergie. Ceci peut se concrétiser par l’absorption d’un ou plusieurs photons incidents dont l’énergie totale correspond à la différence d’énergie entre le niveau fondamental et le niveau excité. Les électrons excités vont tenter de revenir à un état stable en passant à des niveaux d’énergie inférieurs dans la molécule. Lorsque l’électron revient au niveau fondamental, celui-ci relâche son énergie sous forme de lumière en émettant un photon. Puisque l’énergie émise est moins élevée que l’énergie qui a été nécessaire pour l’excitation, le photon émis aura donc une longueur d’onde plus élevée, donc moins énergétique.

En biologie, la fluorescence est la méthode de contraste la plus répandue en recherche. Il est possible de créer des protéines fluorescentes qui peuvent se fixer sur des structures d’intérêt à l’aide d’anticorps spécifiques. Elle est surtout utilisée pour la microscopie à fluorescence par excitation monophotonique et multiphotonique. Dans le premier cas, un photon est absorbé pour exciter la molécule et un photon de moins grande énergie est relâché. En excitation multiphotonique, plusieurs photons sont absorbés et un photon est émis par la suite. Toutefois, la probabilité que plusieurs photons soient absorbés au même moment est très faible, d’où le fait que ce phénomène se produit seulement au point focal provenant d’un laser avec une grande irradiance, ce qui confère à cette technique son sectionnement optique. C’est pour cette raison que des lasers à impulsions sont couramment utilisés pour ce genre d’expérience. Pour la même molécule, le photon émis a la même énergie, qu’il ait été créé en excitation

Figure 1.1 – Diagramme de Jablonski démontrant le concept de fluorescence.[4] monophotonique ou en multiphotonique. De plus, l’énergie totale des photons absorbés lors de l’excitation doit correspondre à la différence d’énergie entre le niveau excité et le niveau fondamental.

1.2

Diffusion de la lumière

La diffusion de la lumière est un phénomène physique décrivant le changement de direction de la propagation de la lumière résultant de son interaction avec la matière. La diffusion peut se décrire de plusieurs façons. La première étant que la lumière interagit avec des particules ayant un indice de réfraction différent du milieu de propagation et la deuxième comme étant une propagation dans un milieu ayant un indice de réfraction continu, mais fluctuant[21]. La diffusion dépend de plusieurs composantes, comme la taille des particules diffusantes, la longueur d’onde ou la variation de l’indice de réfraction dans le tissu, etc.

Puisque la lumière diffusée va nécessairement changer de direction et ne va pas nécessaire-ment être captée par le détecteur, il existe une équation décrivant l’intensité non diffusée It

dans un échantillon d’épaisseur d alors qu’il est éclairé par une source d’intensité Io.

Id= Io· e−µsd (1.1)

diffuse par unité de longueur. Ainsi, au-delà une certaine épaisseur, toute la lumière sera diffusée dans l’échantillon.

1.3

Absorption de la lumière

Dans un milieu non diffusant, l’énergie des photons d’un faisceau lumineux est absorbée par les électrons des atomes qui composent le milieu. Cette énergie est alors transformée pour la plupart sous forme de chaleur dans milieu. Comme la diffusion, les matériaux absorbants sont caractérisés par un coefficient d’absorption µa. Il est possible de définir l’intensité lumineuse

transmise It dans un milieu d’épaisseur d avec une intensité initial Io.

Id= Io· e−µad (1.2)

1.4

Faisceau gaussien

Un faisceau gaussien est un faisceau qui est généré à la sortie d’une source laser. L’amplitude du champ électrique que possède ce faisceau peut être décrite comme une fonction gaussienne et possède donc une symétrie radiale très caractéristique. Ce type de faisceau est très bien connu du milieu scientifique, ce qui est très utile pour la simulation. De plus, les faisceaux lasers divergent très peu, ce qui signifie qu’il est acceptable d’utiliser l’approximation paraxiale. Siegman décrit l’amplitude du champ électrique d’un faisceau gaussien selon l’équation1.3[49] et le rayon de courbure complexe selon l’équation 1.4.

E(r, z) = E0 ω0 ω(z)e − r2 ω(z)2−jk r2 2R(z)_e−jkz+jψ(z) (1.3) 1 ˜ q(z) ≡ 1 R(z)− j λ πω2_(z) (1.4) où ω(z) = ω0 r 1 + (z zr )2 (1.5) R(z) = z +z 2 R z (1.6) ψ(z) = tan−1( z zR ) (1.7)

Figure 1.2 – Schéma d’un faisceau gaussien présentant ces caractéristiques.[5]

zR=

ω2_oπ

λ (1.8)

L’étranglement d’un faisceau gaussien est défini comme étant ωo. L’amplitude du faisceau

gaussien est sensiblement constante sur l’intervalle b, où b = 2 · zR. La position où la largeur

du faisceau équivaut à √2 · ωoest zR (figure 1.2).

1.5

Invariant optique

Le concept d’invariant optique est fondamental en conception optique. La surface d’une source par rapport à l’ouverture numérique de cette même source est un invariant dont il faut tenir compte dans l’élaboration du système d’illumination. Dans un système optique où une source produit une image, le produit de la surface de la source et de son cône d’émission est proportionnel au produit de la surface et le cône d’illumination de l’image (Figure 1.3). Cette dépendance peut se décrire par l’équation1.9. Ce concept sera très important lors de la conception de systèmes d’illumination.

AsΩs = AiΩi (1.9)

1.6

Microscopie à grand champ de vue

La microscopie à champ large est une méthode par fluorescence qui tient sa force dans la rapidité d’exécution. Une source lumineuse (habituelle une lampe au Xénon) est tout d’abord filtrée pour ne laisser passer que la longueur d’excitation des protéines fluorescentes de l’échan-tillon. Cette lumière est focalisée grossièrement par l’objectif qui permet habituellement d’illu-miner uniformément l’échantillon sur un grand champ de vue. Le signal fluorescent est alors capté par l’objectif et filtré par le miroir dichroïque et un filtre d’émission. Ce signal est ensuite

Figure 1.3 – Le produit de la surface de la source et son cône forme un invariant optique.[38] capté par un détecteur matriciel comme une caméra CCD. Ainsi, tout le champ de vue est acquis simultanément.

Malgré sa simplicité d’utilisation, la microscopie à champ large n’a pas de sectionnement optique, ce qui signifie que la lumière provenant de tout l’échantillon est captée par le détec-teur. La lecture devient alors difficile en raison du rapport signal sur bruit assez faible. C’est pour cette raison que ce type de microscopie est plus adapté aux échantillons minces. Le sec-tionnement optique provient du fait que le signal provient de quelques dizaines de micromètres d’épaisseur de tissu.

1.7

Microscopie à balayage laser

La microscopie à balayage laser consiste à focaliser un faisceau laser en un point pour y exciter des protéines fluorescentes. C’est en balayant ce point que l’on reconstruit une image pixel par pixel. Ce principe est au coeur de la microscopie confocal qui est très répandue dans les laboratoires de recherche. C’est un microscope à fluorescence qui utilise l’excitation mono-photonique comme agent de contraste. La puissance de cette méthode provient de l’utilisation d’un sténopé dans le parcours optique qui permet d’obtenir une résolution axiale de l’ordre du micromètre. En effet, le sténopé va bloquer la lumière ne provenant pas du plan focal. En utilisant des objectifs avec de grandes ouvertures numériques, il est donc possible d’obtenir également une résolution latérale très fine, proche de la limite de Rayleigh.

Le même principe de balayage est utilisé dans la microscopie multiphoton. Cependant, les sténopés ne sont plus nécessaires, puisque l’excitation multiphoton va se produire seulement au point focal du faisceau laser, là où la probabilité que plusieurs photons soient absorbés en même pour l’excitation est la plus élevée. C’est entre autres pour cette raison que les lasers utilisés pour ce genre de microscopie utilisent des impulsions ultra-brèves à haute puissance pour augmenter l’irradiance à l’illumination et ainsi les probabilités d’absorption.

Figure 1.4 – Microscopie de fluorescence à champ large.[6]

La microscopie à balayage est simple d’utilisation et très efficace, mais convient moins bien aux applications qui demandent une rapidité d’exécution. Le fait de balayer le faisceau demande beaucoup de temps de traitement et est donc moins bien adapté à l’imagerie de volume.

1.8

Microscopie par feuillet de lumière

La microscopie par feuillet de lumière utilise une feuille de lumière pour exciter seulement un plan d’intérêt dans l’échantillon. En illuminant un plan à la fois, il est donc certain que le signal capté par le détecteur proviendra nécessairement de ce plan, peu importe si la lumière a diffracté comment dans le tissu. Pour engendrer un feuillet de lumière, la méthode convention-nelle est d’utiliser un faisceau gaussien, de le filtrer spatialement en rectangle et de le focaliser à l’aide d’une lentille cylindrique. Une autre méthode consiste à focaliser un faisceau gaussien

Figure 1.5 – Principe de la microscopie confocal.[3]

sur une ligne et de balayer cette ligne dans un axe très rapidement pour recréer une feuille de lumière vue par la caméra.

Toutefois, ces techniques demandent que le faisceau laser pénètre en profondeur dans l’échan-tillon tout en gardant sa forme qui détermine la résolution axiale du système. Si la lumière venait à diffracter dans le tissu, il serait difficile de recréer une feuille de lumière uniforme pour l’excitation. C’est pour cette raison que cette technique requiert que l’échantillon soit transparent afin que le feuillet puisse se propager sans compromis à la résolution axiale.

Cette méthode est très efficace pour l’imagerie volumétrique, même s’il faut modifier les propriétés optiques des échantillons. Il existe maintenant dans la littérature plusieurs méthodes de transparisation des tissus qui seront discutées plus en détail à la section 1.9. Cependant, plusieurs facteurs limitent les performances de ce genre de système. La plus importante est sans doute l’uniformité du feuillet de lumière. En effet, la feuille ne peut pas être uniforme sur une très longue distance, en raison des propriétés des faisceaux gaussiens (section1.4).

1.9

Transparisation des tissus

La transparisation des tissus est une étape importante pour l’étude de cerveaux de mammi-fères dans leur entièreté. Quand vient le temps de reconstruire une image volumétrique d’un cerveau, la diffusion de la lumière dans le tissu rend la tâche impossible. En effet, le cerveau est composé de différentes structures ayant toutes leurs propriétés distinctes, dont les propriétés optiques. L’indice de réfraction va varier selon la structure et c’est ce qui fait que les cerveaux

Figure 1.6 – Feuillet de lumière créé à partir de lentilles cylindriques.[12]

Figure 1.7 – Feuillet de lumière créé par balayage d’un faisceau gaussien.[23]

sont opaques. Pour rendre le cerveau transparent, plusieurs techniques ont été développées. Certaines sont à base d’eau, de solvants organiques ou bien à base d’hydrogel.

La transparisation des tissus n’est pas seulement avantageuse pour l’imagerie, mais égale-ment pour le marquage en fluorescence. En effet, puisque les anticorps servant au marquage doivent pénétrer le tissu par diffusion, la transparisation enlève la majorité des structures pouvant affecter la propagation des anticorps, rendant ainsi le marquage plus efficace et plus spécifique.

1.9.1 iDisco

La technique iDisco a été inventée par Renier et ses collègues [45]. Le fait que le marquage en fluorescence soit effectué avant le processus de transparisation est un aspect qui différencie cette méthode par rapport aux autres. Tout d’abord, une déshydratation au méthanol est

effectuée sur le tissu pour augmenter la diffusion des anticorps lors de l’étape de marquage immunohistochimique en venant briser les liaisons des lipides dans l’échantillon. Une étape de lavage précède la réhydratation de l’échantillon pour ensuite procéder au marquage des structures d’intérêt avec des anticorps. Une seconde déshydratation au méthanol est effectuée avant un dernier lavage au dichlorométhane. Une importante étape de perméabilisation du tissu est effectuée avec du diméthylsulfoxyde. L’échantillon est enfin mis dans du dibenzyl éther pour finaliser l’étape de transparisation.

Cette méthode est facile à appliquer et peu coûteuse, puisqu’elle implique seulement le trempage successif de l’échantillon dans différentes solutions. Cependant, travailler avec des solvants peut être problématique. En effet, l’indice de réfraction de la solution est de 1,56 ce qui est très élevé pour un liquide. Acquérir l’échantillon avec un objectif à l’air peut avoir plusieurs répercussions sur la qualité de l’imagerie en raison du changement d’indice de réfrac-tion drastique. Les solvants et autres liquides avec le même indice de réfracréfrac-tion sont souvent toxiques et attaquent les matériaux utilisés avec les objectifs à immersion, rendant cette option difficile à appliquer en laboratoire.

1.9.2 Expansion Microscopy

Depuis de nombreuses années, la recherche dans le domaine de la microscopie n’a cessé de trouver des moyens d’augmenter le pouvoir de résolution des systèmes optiques. L’objectif étant toujours de tenter d’observer des structures de plus en plus petites afin de mieux com-prendre le fonctionnement du réseau complexe comme le cerveau. Ed Boyden et son équipe ont approché le problème différemment, soit en grossissant les structures avec sa technique appelée « Expansion Microscopy » [7].

Cette technique utilise un réseau de polymères dont les mailles, lorsque mises en contact avec de l’eau, vont s’éloigner, ce qui va provoquer un gonflement du tissu. Pour ce faire, le cerveau est perfusé avec une solution d’acrylamide et de paraformaldehyde. Cette solution va diffuser dans l’échantillon ce qui créer des points d’ancrage sur différentes structures dans le tissu. Puis, l’échantillon est immergé dans une solution de monomères. Ceux-ci s’agglomèrent entre eux pour former les polymères. Ces derniers viennent se lier aux points d’ancrage des acrylamides afin de solidifier la nouvelle matrice de polymère à la structure déjà existante. On pose l’échantillon dans l’eau, qui sera absorbée par osmolarité, venant ainsi gonfler le tissu en éloigner les différentes mailles du réseau de polymère. Un marquage immunohistochimique est effectué pour identifier les structures d’intérêt.

Boyden a démontré dans son article que les structures conservent leur configuration dans l’espace et qu’il est possible de gonfler un cerveau jusqu’à près de 10 fois sa taille réelle[7]. Ainsi, des neurones ayant un corps cellulaire de 5 µm de diamètre auraient à la fin du protocole un

diamètre de près de 50 µm. Il en serait de même pour leurs filaments dendritiques, permettant ainsi de les observer avec des microscopes ayant une résolution microscopique avec un facteur de grossissement relativement petit pour ce genre d’imagerie.

1.9.3 SHIELD

Le SHIELD ou en anglais « Stabilization under Harsh conditions via Intramolecular Epoxide Linkages to prevent Degradation » est une variante de la méthode Clarity [10]. Cette méthode vient retirer les lipides de l’échantillon, principal agent de diffusion dans le tissu, et ajoute une matrice d’hydrogel dans le tissu et finaliser sa transparisation. La matrice d’hydrogel est toutefois mélangée à un époxy, ce qui rend l’échantillon beaucoup plus rigide et facile à travailler pour le restant des manipulations. De plus, un des principaux avantages du SHIELD est sa capacité à conserver la fluorescence endogène des tissus, ce qui était problématique avec la méthode Clarity [40].

Chapitre 2

Imagerie longitudinale de neurones in

vivo en profondeur

Avec des marqueurs fluorescents dépendants du calcium comme GCAMP6, il est possible de mesurer l’activité neuronale partout dans le cerveau selon différents contextes. Il existe un fort intérêt en neurosciences pour l’imagerie calcique dans tout le cerveau, y compris les neurones dopaminergiques. Cependant, ces neurones étant particulièrement profonds dans le cerveau sont difficilement observables dans un contexte in vivo. Il n’existe pas de système d’imagerie efficace pouvant atteindre ces neurones sans causer de dommages importants au tissu. Il y a donc un besoin pour développer un système très fin capable de prendre des images de ces neurones et d’enregistrer un signal calcique dans le temps. Les fibres monomodes sont de bons candidats pour ce genre d’application en raison de leur petite taille, de la recherche abondante qui existe dans le domaine et de leurs propriétés optiques.

2.1

Imagerie par fibre optique

Trois types de fibres sont utilisées dans le domaine de l’imagerie : les fibres monomodes, multimodes et les fibres multicoeurs. Les fibres optiques sont généralement composées d’un verre de gaine et d’un verre de coeur. Dans le cas des fibres à saut d’indice, l’indice de réfraction du verre de coeur doit être légèrement supérieur à celui de la gaine pour obtenir un phénomène de réflexion totale interne. Le coeur des fibres monomodes est relativement petit, soit en moyenne 4 µm de diamètre comparativement à un diamètre total de 125 µm de diamètre pour la fibre. Un seul mode est guidé en son coeur, ce qui facilite de beaucoup le traitement des données par la suite. Toutefois, en raison du petit diamètre du coeur, l’injection de la lumière doit être parfaitement centrée et alignée par rapport à l’axe de la fibre. Les fibres monomodes sont plus utilisées en photométrie où l’on caractérise l’intensité lumineuse émise par la source, soit les neurones dans le cas qui nous intéresse. Cependant, dans un contexte d’imagerie, la fibre monomode à elle seule ne peut être utilisée pour construire une image en fluorescence,

Figure 2.1 – Comparaison entre 3 types de fibre optique pour l’imagerie et la microscopie. puisqu’un seul point dans le tissu est ainsi illuminé et acquis.

Les fibres multimodes sont basées sur le même concept que les fibres monomodes, mis à part le coeur qui est beaucoup plus grand en diamètre. Plus le coeur est grand, plus le nombre de modes permis dans la fibre augmente et plus il est possible de collecter de la lumière facilement. Le nombre de modes permis dans le coeur est caractérisé par la fréquence normalisée V,

V = 2πa

λo NA (2.1)

où a est le rayon de la fibre optique et NA est son ouverture numérique. Pour l’imagerie, les fibres multimodes sont moins utilisées en raison de la complexité du traitement des données. En effet, puisque la lumière de tout le champ de vue est collectée en même temps et que les chemins optiques dans la fibre sont variés, il y aura énormément d’interférence à l’intérieur de la fibre avant que ce signal ne soit réinterprété par le système d’acquisition. De plus, le diamètre du coeur est directement proportionnel au champ de vue du système, ce qui signifie qu’il faut un diamètre de fibre relativement grand pour avoir un large champ de vue. Un large coeur va aussi augmenter forcément le nombre de modes permis et le niveau d’interférence dans la fibre optique. Alors, pour utiliser ce genre de fibre, il faut comprendre comment la lumière va interagir dans son coeur. Pour ce faire, la manière la plus simple est de fonctionner par itération et de laisser passer quelques modes à la fois dans la fibre et de comparer l’entrée avec la sortie. Cela peut prendre beaucoup de temps et demande beaucoup d’itérations pour s’approcher d’un modèle de fibre acceptable pour finalement l’utiliser dans un contexte d’imagerie [55]. Or, le moindre mouvement de la fibre change les paramètres de l’algorithme et rend le précédent modèle obsolète. Prendre des images dans un cerveau de souris sans que la fibre bouge n’est pas évident et n’est surtout pas robuste.

Pour remédier au précédent problème de fibre multimode, il existe des fibres à plusieurs coeurs. Chaque coeur a environ le même diamètre qu’une fibre monomode. Cependant, de l’interférence entre les coeurs voisins peut apparaître lors de leur utilisation. On peut facilement comparer son utilisation à un microscope à grand champ de vue où chaque coeur capte le signal de 1 pixel dans l’image finale. C’est donc une intégration rapide et simple pour un contexte d’imagerie. Toutefois, comme dans le cas de la fibre multimode, le champ de vue est directement proportionnel au diamètre de la fibre, soit le nombre de coeurs sur son diamètre. Si la fibre est trop grande en diamètre, on engendre beaucoup de dommage au tissu lors de son insertion dans le cerveau de la souris et ce dommage est irréversible. Pour une utilisation en profondeur, le champ de vue du système doit donc être restreint.

2.2

Montage optique

L’endoscope est composé d’une fibre optique monomode dont le bout a été modifié selon plusieurs spécifications. Comme il a été mentionné plus haut, une telle fibre doit être uti-lisé comme un microscope confocal pour obtenir un système imageant. Il faut donc s’assurer d’obtenir un point focal à la sortie de la fibre pour exciter les protéines fluorescentes dans l’échantillon. À la sortie de la fibre optique, le faisceau laser va naturellement diverger suivant l’ouverture numérique de la fibre. Pour faire focuser le faisceau, une fibre à gradient d’indice ou "GRIN" est utilisé tel un objectif au bout de la fibre (voir section2.3). Il s’agit en fait d’un barreau de verre dont l’indice de réfraction varie selon la position dans le verre. Ainsi, il est possible de contrôler l’angle de sortie des faisceaux en mesurant une taille de GRIN spécifique. La longueur de la GRIN est déterminée en fonction de la distance focale désirée. Un barreau de verre est utilisé en premier lieu pour laisser diverger le laser jusqu’à ce que son diamètre soit équivalent au diamètre de la GRIN utilisée. Un autre barreau de verre est utilisé en second lieu après cette GRIN pour permettre une clive sans endommager la fibre à gradient d’indice. Toutes ces composantes fibrées peuvent facilement se trouver commercialement à bas prix et ont pratiquement la même composition chimique, ce qui facilite grandement leur fusion pour former l’endoscope. Des fibres de 125 micromètres de diamètre en silice ont été choisies pour la suite du projet en raison de leur faible coût et de leur facilité d’utilisation.

Une fois les composantes à fibre fusionnées, un laser CO2est utilisé pour couper ou « cleaver »

le second barreau de verre à un angle de 45 degrés. Un miroir est posé sur le bout de la clive par déposition de couche mince d’aluminium d’environ 100 nanomètres d’épaisseur1_{. Le faisceau}

laser est alors réfléchi à 90 degrés sur le côté de la fibre.

Le système de balayage est basé sur des coordonnées cylindriques et a été construit spéciale-ment pour répondre aux besoins du projet. Un tube de métal est collé à environ une douzaine

Figure 2.2 – De la micro-optique est ajoutée au bout de la fibre pour permettre son utilisation dans un système à balayage imageant.

Figure 2.3 – Schéma du montage optique du PIM

de centimètres du bout de la fibre. Le système de balayage peut donc ainsi maintenir la fibre solidement à l’aide d’une vis sans l’endommager. Une fois attaché, un moteur pivote la fibre sur son axe de rotation sur un intervalle de 5 à 30 Hz, vitesse déterminée par l’utilisateur. Un bras de levier assure la rotation de la fibre sur un angle de 90o_{. Puis, un actuateur}

pié-zoélectrique permet la translation verticale de la fibre avec une précision microscopique sur un intervalle de 400 µm. Le reste du système d’acquisition ressemble à celui d’un microscope confocal. Un miroir dichroïque laisse passer la lumière fluorescente jusqu’au tube photomulti-plicateur. Chacun des instruments est branché sur une carte d’acquisition National Instrument

PCIe-6250. Le tout est contrôlé par un logiciel Python dont la description peut se retrouver à la section 2.4.

Pour reconstruire une image, le point focal à la sortie de la fibre est balayé autour de l’axe de rotation de la fibre. La carte d’acquisition lit simultanément le voltage du tube photomul-tiplicateur, l’angle de rotation, ainsi que la hauteur de la fibre à une fréquence de 1MHz. En effectuant une moyenne des données, un intervalle d’angle est attribué à un pixel dans l’image et une valeur de tension est traduite en valeur de pixel. Lorsque la ligne d’intérêt est acquise, l’actuateur piézoélectrique descend la fibre d’un incrément (habituellement 1 micromètre pour conserver la meilleure résolution possible) et l’acquisition continue jusqu’à ce que toute l’image soit enregistrée. Puisque le mouvement de la fibre peut faire bouger l’échantillon, 3 images sont obtenues suite à une acquisition : une image lorsque la fibre tourne vers la gauche, une deuxième image lorsque la fibre tourne vers la droite et une troisième image qui correspond à la moyenne entre les deux directions.

Un des principaux avantages de cette approche est la versatilité du champ de vue permis. En effet, le champ de vue du système n’est plus dépendant du diamètre de la fibre comme c’est le cas pour la plupart des systèmes endoscopiques dans la littérature. Le champ de vue dépend maintenant de l’angle de rotation de la fibre, de la distance focale et de l’étendue de la translation verticale (figure 2.5).

2.3

Simulations

Les simulations ont été effectuées à l’aide d’un programme MATLAB développé dans le laboratoire du professeur Daniel Côté. Le programme consiste en un ensemble de fonctions dont le but est de fournir un tracé de rayon aux travers différents interfaces déterminées par l’utilisateur. Le script fournit alors la position du "Field Stop" et du "Aperture Stop" du système et donne un aperçu de la trajectoire des rayons dans le système complet. Tous les calculs se font à l’aide de matrices ABCD, méthode simple et bien connue dans le domaine de l’optique géométrique. La figure 2.6 correspond à une simulation d’un laser sortant du coeur d’une fibre monomode, se propageant dans un barreau de verre d’indice de réfraction n, dans une fibre à gradient d’indice, dans un second barreau de verre, puis dans l’air.

Le but de la simulation était de déterminer la longueur nécessaire de chaque composante (barreaux de verre et la fibre à gradient d’indice) pour obtenir un point focal à environ 60 micromètres du bord de la fibre. Dépassé cette distance, la diffusion de la lumière dans le tissu devient trop importante pour collecter un signal de fluorescence. De plus, cette distance focale permet d’obtenir un champ de vue du système relativement grand pour les applications reliées au projet.

Figure 2.4 – Représentation schématique de la reconstruction de l’image

Puisque les fibres ont un diamètre de 125 micromètres et qu’il faut effectuer une clive à 45 degrés d’angle, on se retrouve donc avec une distance minimale de 125 micromètres pour le deuxième barreau de verre pour ne pas endommager la GRIN. Connaissant le diamètre du coeur de la GRIN, il est possible de déterminer la longueur du premier barreau de verre après la fibre monomode, soit environ 372 micromètres. Comme il est montré à la figure 2.6, on s’assure de remplir complètement le coeur de la fibre à gradient d’indice, même si cela signifie une légère perte d’intensité dans le verre de gaine. On arrive à une longueur de GRIN de 132 µm pour cette simulation.

Une seconde simulation a été effectuée considérant le fait que l’endoscope imagera au travers un capillaire de verre lors de l’imagerie in vivo. Le capillaire utilisé aura un diamètre interne de 150 micromètres et un diamètre externe de 250 micromètres. Avec le même script MATLAB les longueurs de chaque composante fibrée ont pu être déterminées suivant cette méthode. Les longueurs sont de 372 micromètres pour le premier barreau de verre, 122 micromètres pour la GRIN et 125 micromètres pour le deuxième barreau de verre. On considère que le faisceau focalise 10 µm passé le capillaire de verre.

Tout le code source servant au tracé de rayons est sur GitHub dans le groupe DCCLAB sous le nom de dcclab-matlab-toolbox. Voir àhttps://github.com/DCC-Lab/dcclab-matlab-toolbox.

Figure 2.5 – Le champ de vue du système n’est plus dépendant du diamètre de la fibre, mais de son système de balayage et de sa distance focale.

Figure 2.6 – Tracer de rayons depuis la sortie de la fibre optique jusqu’au point focal, passant par les 2 barreaux de verre et la GRIN.

Le code des simulations se trouve dans « Optical-Utilities ». Voirhttps://github.com/DCC-Lab/ Optics-Utilities. Le nom du fichier est « fiberMicCapillaire.m »

Figure 2.7 – Tracer de rayons depuis la sortie de la fibre optique jusqu’au point focal, passant par les 2 barreaux de verre et la GRIN en considérant un capillaire de verre de 150 micromètres de diamètre interne et 250 micromètres de diamètre externe.

2.4

Logiciel

Le logiciel d’acquisition de microscope a été programmé entièrement en Python avec la librairie de National Instruments NI-DAQmx[36]. Cette librairie permet à un programme Python de reconnaître une carte d’acquisition National Instruments et de communiquer avec ses fonctions internes, ainsi que ses ports d’entrées/sorties pour effectuer l’acquisition. Le logiciel est divisé en plusieurs sections. En ouvrant le logiciel, l’utilisateur doit déterminer les paramètres d’ac-quisition du système. Ces paramètres permettent non seulement de connecter les instruments aux bons ports de la carte, mais déterminent également les caractéristiques de l’acquisition et du traitement de signal. Il est possible par exemple de déterminer :

— la fréquence d’acquisition

— le nombre de répétitions pour acquérir la même ligne de pixels — l’incrément d’angle correspondant à un pixel dans l’image — le nombre de lignes à acquérir pour compléter une image — la plage dynamique du tube photomultiplicateur

— la vitesse de rotation du moteur — la distance focale de la fibre

Figure 2.8 – Diagramme fonctionnel du logiciel d’acquisition du microscope.

Une fois les paramètres entrés dans le logiciel, l’acquisition peut alors débuter. L’utilisateur peut prendre une image où chaque ligne de pixel s’affiche pendant l’acquisition. Il est possible de modifier le contraste pour mieux discerner les structures dans l’image. Une fois l’image acquise, il est possible de passer à un mode d’imagerie calcique.

Il est difficile de retrouver les coordonnées exactes d’un corps cellulaire après avoir prise une image dans un volume. La adoptée pour enregistrer le signal calcique est de procéder à l’acquisition sur une ligne complète de pixel. Le moteur faisant tourner la fibre étant capable de tourner jusqu’à une vitesse de 30 Hz (1800 rpm), il est possible d’enregistrer un signal d’une protéine GCAMP6f sans trop de difficulté suivant le théorème de Nyquist. Avant l’acquisition, le logiciel demande à l’utilisateur de sélectionner une ligne de pixel d’intérêt. Sur cette ligne, l’utilisateur sélectionne par la suite les pixels correspondant à la structure d’intérêt (exemple un corps cellulaire). Le système positionne l’actuateur piézoélectrique à la ligne sélectionnée au préalable. Avant l’enregistrement, le système acquiert la ligne en continu et la projette sur l’interface pour s’assurer que la fibre est à la bonne position par rapport à l’échantillon. L’utilisateur peut déplacer l’actuateur piézoélectrique par incrément de 500 nanomètres pour retrouver la ou les structures d’intérêt. Une fois bien positionné, le logiciel commence l’acqui-sition et affiche l’intensité du signal de fluorescence (F) en fonction du temps. Une fois la trace calcique enregistrée, le signal ∆F/F est calculé automatiquement.

Tout le logiciel est sur GitHub dans le groupe DCCLAB sous le nom de PIM-App. Voir à

Figure 2.9 – Microbilles fluorescentes de 3-4 micromètres en diamètre. Image acquise par le microscope à fibre PIM. La barre correspond à 30 micromètres.

2.5

Caractérisation

La caractérisation d’un système fait nécessairement partie de sa création. Cette étape est très importante, puisqu’elle va être déterminante pour l’analyse d’échantillons biologiques. Pour ce faire, une méthode fréquemment utilisée est l’utilisation de billes fluorescentes. L’avantage de ces billes est qu’il est possible de s’en procurer pour différente longueur d’onde d’excitation et avec différents diamètres. Normalement, il serait possible de caractériser la résolution et la profondeur de champ avec les billes. Cependant, en raison de la configuration du système, la profondeur de champ ne pourra pas être mesurée ainsi. Il faudra donc trouver une autre solution pour déterminer cette mesure.

2.5.1 Résolution

Des billes fluorescentes de 3-4 micromètres de diamètre ont été utilisées pour la caractéri-sation. Ces billes peuvent être excitées à plusieurs longueurs d’onde, dont 488nm, 594nm et 633 nm. Les billes sont mélangées dans un gel d’agarose 2% à basse température de fusion. La figure2.9montre une image acquise par l’endoscope dans un échantillon de billes fluorescentes.