L’endoscope est composé d’une fibre optique monomode dont le bout a été modifié selon plusieurs spécifications. Comme il a été mentionné plus haut, une telle fibre doit être uti- lisé comme un microscope confocal pour obtenir un système imageant. Il faut donc s’assurer d’obtenir un point focal à la sortie de la fibre pour exciter les protéines fluorescentes dans l’échantillon. À la sortie de la fibre optique, le faisceau laser va naturellement diverger suivant l’ouverture numérique de la fibre. Pour faire focuser le faisceau, une fibre à gradient d’indice ou "GRIN" est utilisé tel un objectif au bout de la fibre (voir section2.3). Il s’agit en fait d’un barreau de verre dont l’indice de réfraction varie selon la position dans le verre. Ainsi, il est possible de contrôler l’angle de sortie des faisceaux en mesurant une taille de GRIN spécifique. La longueur de la GRIN est déterminée en fonction de la distance focale désirée. Un barreau de verre est utilisé en premier lieu pour laisser diverger le laser jusqu’à ce que son diamètre soit équivalent au diamètre de la GRIN utilisée. Un autre barreau de verre est utilisé en second lieu après cette GRIN pour permettre une clive sans endommager la fibre à gradient d’indice. Toutes ces composantes fibrées peuvent facilement se trouver commercialement à bas prix et ont pratiquement la même composition chimique, ce qui facilite grandement leur fusion pour former l’endoscope. Des fibres de 125 micromètres de diamètre en silice ont été choisies pour la suite du projet en raison de leur faible coût et de leur facilité d’utilisation.
Une fois les composantes à fibre fusionnées, un laser CO2est utilisé pour couper ou « cleaver »
le second barreau de verre à un angle de 45 degrés. Un miroir est posé sur le bout de la clive par déposition de couche mince d’aluminium d’environ 100 nanomètres d’épaisseur1. Le faisceau
laser est alors réfléchi à 90 degrés sur le côté de la fibre.
Le système de balayage est basé sur des coordonnées cylindriques et a été construit spéciale- ment pour répondre aux besoins du projet. Un tube de métal est collé à environ une douzaine
Figure 2.2 – De la micro-optique est ajoutée au bout de la fibre pour permettre son utilisation dans un système à balayage imageant.
Figure 2.3 – Schéma du montage optique du PIM
de centimètres du bout de la fibre. Le système de balayage peut donc ainsi maintenir la fibre solidement à l’aide d’une vis sans l’endommager. Une fois attaché, un moteur pivote la fibre sur son axe de rotation sur un intervalle de 5 à 30 Hz, vitesse déterminée par l’utilisateur. Un bras de levier assure la rotation de la fibre sur un angle de 90o. Puis, un actuateur pié-
zoélectrique permet la translation verticale de la fibre avec une précision microscopique sur un intervalle de 400 µm. Le reste du système d’acquisition ressemble à celui d’un microscope confocal. Un miroir dichroïque laisse passer la lumière fluorescente jusqu’au tube photomulti- plicateur. Chacun des instruments est branché sur une carte d’acquisition National Instrument
PCIe-6250. Le tout est contrôlé par un logiciel Python dont la description peut se retrouver à la section 2.4.
Pour reconstruire une image, le point focal à la sortie de la fibre est balayé autour de l’axe de rotation de la fibre. La carte d’acquisition lit simultanément le voltage du tube photomul- tiplicateur, l’angle de rotation, ainsi que la hauteur de la fibre à une fréquence de 1MHz. En effectuant une moyenne des données, un intervalle d’angle est attribué à un pixel dans l’image et une valeur de tension est traduite en valeur de pixel. Lorsque la ligne d’intérêt est acquise, l’actuateur piézoélectrique descend la fibre d’un incrément (habituellement 1 micromètre pour conserver la meilleure résolution possible) et l’acquisition continue jusqu’à ce que toute l’image soit enregistrée. Puisque le mouvement de la fibre peut faire bouger l’échantillon, 3 images sont obtenues suite à une acquisition : une image lorsque la fibre tourne vers la gauche, une deuxième image lorsque la fibre tourne vers la droite et une troisième image qui correspond à la moyenne entre les deux directions.
Un des principaux avantages de cette approche est la versatilité du champ de vue permis. En effet, le champ de vue du système n’est plus dépendant du diamètre de la fibre comme c’est le cas pour la plupart des systèmes endoscopiques dans la littérature. Le champ de vue dépend maintenant de l’angle de rotation de la fibre, de la distance focale et de l’étendue de la translation verticale (figure 2.5).
2.3
Simulations
Les simulations ont été effectuées à l’aide d’un programme MATLAB développé dans le laboratoire du professeur Daniel Côté. Le programme consiste en un ensemble de fonctions dont le but est de fournir un tracé de rayon aux travers différents interfaces déterminées par l’utilisateur. Le script fournit alors la position du "Field Stop" et du "Aperture Stop" du système et donne un aperçu de la trajectoire des rayons dans le système complet. Tous les calculs se font à l’aide de matrices ABCD, méthode simple et bien connue dans le domaine de l’optique géométrique. La figure 2.6 correspond à une simulation d’un laser sortant du coeur d’une fibre monomode, se propageant dans un barreau de verre d’indice de réfraction n, dans une fibre à gradient d’indice, dans un second barreau de verre, puis dans l’air.
Le but de la simulation était de déterminer la longueur nécessaire de chaque composante (barreaux de verre et la fibre à gradient d’indice) pour obtenir un point focal à environ 60 micromètres du bord de la fibre. Dépassé cette distance, la diffusion de la lumière dans le tissu devient trop importante pour collecter un signal de fluorescence. De plus, cette distance focale permet d’obtenir un champ de vue du système relativement grand pour les applications reliées au projet.
Figure 2.4 – Représentation schématique de la reconstruction de l’image
Puisque les fibres ont un diamètre de 125 micromètres et qu’il faut effectuer une clive à 45 degrés d’angle, on se retrouve donc avec une distance minimale de 125 micromètres pour le deuxième barreau de verre pour ne pas endommager la GRIN. Connaissant le diamètre du coeur de la GRIN, il est possible de déterminer la longueur du premier barreau de verre après la fibre monomode, soit environ 372 micromètres. Comme il est montré à la figure 2.6, on s’assure de remplir complètement le coeur de la fibre à gradient d’indice, même si cela signifie une légère perte d’intensité dans le verre de gaine. On arrive à une longueur de GRIN de 132 µm pour cette simulation.
Une seconde simulation a été effectuée considérant le fait que l’endoscope imagera au travers un capillaire de verre lors de l’imagerie in vivo. Le capillaire utilisé aura un diamètre interne de 150 micromètres et un diamètre externe de 250 micromètres. Avec le même script MATLAB les longueurs de chaque composante fibrée ont pu être déterminées suivant cette méthode. Les longueurs sont de 372 micromètres pour le premier barreau de verre, 122 micromètres pour la GRIN et 125 micromètres pour le deuxième barreau de verre. On considère que le faisceau focalise 10 µm passé le capillaire de verre.
Tout le code source servant au tracé de rayons est sur GitHub dans le groupe DCCLAB sous le nom de dcclab-matlab-toolbox. Voir àhttps://github.com/DCC-Lab/dcclab-matlab-toolbox.
Figure 2.5 – Le champ de vue du système n’est plus dépendant du diamètre de la fibre, mais de son système de balayage et de sa distance focale.
Figure 2.6 – Tracer de rayons depuis la sortie de la fibre optique jusqu’au point focal, passant par les 2 barreaux de verre et la GRIN.
Le code des simulations se trouve dans « Optical-Utilities ». Voirhttps://github.com/DCC-Lab/ Optics-Utilities. Le nom du fichier est « fiberMicCapillaire.m »
Figure 2.7 – Tracer de rayons depuis la sortie de la fibre optique jusqu’au point focal, passant par les 2 barreaux de verre et la GRIN en considérant un capillaire de verre de 150 micromètres de diamètre interne et 250 micromètres de diamètre externe.
2.4
Logiciel
Le logiciel d’acquisition de microscope a été programmé entièrement en Python avec la librairie de National Instruments NI-DAQmx[36]. Cette librairie permet à un programme Python de reconnaître une carte d’acquisition National Instruments et de communiquer avec ses fonctions internes, ainsi que ses ports d’entrées/sorties pour effectuer l’acquisition. Le logiciel est divisé en plusieurs sections. En ouvrant le logiciel, l’utilisateur doit déterminer les paramètres d’ac- quisition du système. Ces paramètres permettent non seulement de connecter les instruments aux bons ports de la carte, mais déterminent également les caractéristiques de l’acquisition et du traitement de signal. Il est possible par exemple de déterminer :
— la fréquence d’acquisition
— le nombre de répétitions pour acquérir la même ligne de pixels — l’incrément d’angle correspondant à un pixel dans l’image — le nombre de lignes à acquérir pour compléter une image — la plage dynamique du tube photomultiplicateur
— la vitesse de rotation du moteur — la distance focale de la fibre
Figure 2.8 – Diagramme fonctionnel du logiciel d’acquisition du microscope.
Une fois les paramètres entrés dans le logiciel, l’acquisition peut alors débuter. L’utilisateur peut prendre une image où chaque ligne de pixel s’affiche pendant l’acquisition. Il est possible de modifier le contraste pour mieux discerner les structures dans l’image. Une fois l’image acquise, il est possible de passer à un mode d’imagerie calcique.
Il est difficile de retrouver les coordonnées exactes d’un corps cellulaire après avoir prise une image dans un volume. La adoptée pour enregistrer le signal calcique est de procéder à l’acquisition sur une ligne complète de pixel. Le moteur faisant tourner la fibre étant capable de tourner jusqu’à une vitesse de 30 Hz (1800 rpm), il est possible d’enregistrer un signal d’une protéine GCAMP6f sans trop de difficulté suivant le théorème de Nyquist. Avant l’acquisition, le logiciel demande à l’utilisateur de sélectionner une ligne de pixel d’intérêt. Sur cette ligne, l’utilisateur sélectionne par la suite les pixels correspondant à la structure d’intérêt (exemple un corps cellulaire). Le système positionne l’actuateur piézoélectrique à la ligne sélectionnée au préalable. Avant l’enregistrement, le système acquiert la ligne en continu et la projette sur l’interface pour s’assurer que la fibre est à la bonne position par rapport à l’échantillon. L’utilisateur peut déplacer l’actuateur piézoélectrique par incrément de 500 nanomètres pour retrouver la ou les structures d’intérêt. Une fois bien positionné, le logiciel commence l’acqui- sition et affiche l’intensité du signal de fluorescence (F) en fonction du temps. Une fois la trace calcique enregistrée, le signal ∆F/F est calculé automatiquement.
Tout le logiciel est sur GitHub dans le groupe DCCLAB sous le nom de PIM-App. Voir à
Figure 2.9 – Microbilles fluorescentes de 3-4 micromètres en diamètre. Image acquise par le microscope à fibre PIM. La barre correspond à 30 micromètres.
2.5
Caractérisation
La caractérisation d’un système fait nécessairement partie de sa création. Cette étape est très importante, puisqu’elle va être déterminante pour l’analyse d’échantillons biologiques. Pour ce faire, une méthode fréquemment utilisée est l’utilisation de billes fluorescentes. L’avantage de ces billes est qu’il est possible de s’en procurer pour différente longueur d’onde d’excitation et avec différents diamètres. Normalement, il serait possible de caractériser la résolution et la profondeur de champ avec les billes. Cependant, en raison de la configuration du système, la profondeur de champ ne pourra pas être mesurée ainsi. Il faudra donc trouver une autre solution pour déterminer cette mesure.
2.5.1 Résolution
Des billes fluorescentes de 3-4 micromètres de diamètre ont été utilisées pour la caractéri- sation. Ces billes peuvent être excitées à plusieurs longueurs d’onde, dont 488nm, 594nm et 633 nm. Les billes sont mélangées dans un gel d’agarose 2% à basse température de fusion. La figure2.9montre une image acquise par l’endoscope dans un échantillon de billes fluorescentes.
Figure 2.10 – Profile d’intensité de 10 billes fluorescentes acquises avec un microscope confocal Zeiss LSM 710 et avec le PIM.
Les mêmes billes ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal Zeiss LSM 710 pour faciliter la comparaison. La figure 2.10montre une moyenne du profil d’intensité de 10 billes acquise avec chaque microscope. On peut constater que le signal de fluorescence des deux courbes est presque similaire. Étant donné que le "point spread function" de l’endoscope est d’environ 3 µm de diamètre et que celui du confocal est d’environ 1 µm, il est normal que le profil de l’endoscope semble légèrement plus étendu. La résolution va dépendre de la qualité de la fibre utilisée avec l’ensemble de ces composantes fibrées qui y sont fusionnées.
2.5.2 Profondeur de champ
Une façon courante de mesurer la profondeur de champ est d’acquérir des images de billes fluorescentes sur plusieurs plans et reconstruire une image en trois dimensions. Avec l’intensité du signal en fonction de la profondeur, non seulement la profondeur de champ est mesurée, mais par le fait même le « point spread function ». Cependant, en raison de la configura- tion particulière du système, il est impossible d’effectuer une acquisition en 3 dimensions en imageant plusieurs plans à différentes profondeurs sans changer la fibre. En effet, il faudrait pouvoir modifier la distance à laquelle le point est focalisé sur le côté de la fibre, tout en main- tenant la position de la fibre dans l’échantillon. En d’autres mots, il faudrait alors changer de manière consécutive la longueur de la GRIN, ce qui est physiquement impossible.
Pour mesurer la profondeur de champ, une lame uniformément fluorescente [53] est utilisée comme source d’émission. En approchant la lame fluorescente de la fibre et en mesurant l’intensité de fluorescence captée par le système d’acquisition, il est possible de retrouver un
Figure 2.11 – Amplitude normalisée en fonction de la distance séparant la fibre optique de la lame fluorescente.
profil d’intensité dont la largeur à mi-hauteur correspondrait à la profondeur de champ du système. La figure 2.11présente les résultats de cette expérience. Le système aurait donc une profondeur de champ d’environ 50 micromètres. Le fait que la courbe ne commence pas à zéro provient du fait que le point focal commence dans la lame fluorescente et y ait présente jusqu’à ce que sa position soit d’environ 60 µm où le point focal se retrouve donc à la surface. Cependant, la courbe devrait contenir un plateau plutôt qu’une forme gaussienne pour les 60 premiers micromètres de par cette configuration. Cela est probablement causé par une réflexion du laser sur la surface de la lame et qui est acquise par le système d’acquisition, malgré la présence des filtres d’émission et du miroir dichroïque. La deuxième moitié de la courbe donne toutefois une excellente approximation de la profondeur de champ.