L’endoscopie par fibre optique est une méthode fiable et peu coûteuse pour l’imagerie dans des tissus en profondeur. L’utilisation de la fibre optique monomode dans ce contexte semble
2. La chirurgie a été effectuée par Anne Sebilo au Centre de Recherche CERVO. CPAUL Protocole 2014- 138-1.
Figure 2.16 – Microglies dans le mésencéphale d’une souris CX3-CR1-GFP.
être une solution viable et prometteuse. En déterminant la longueur de fibre à gradient d’in- dice au bout de la fibre, il est possible de modifier la distance focale de l’endoscope sur plusieurs dizaines de micromètres. Il est possible de visualiser des structures d’environ 2 µm de diamètres, soit assez pour visualiser des corps cellulaires ou des filaments axonaux. La pro- fondeur de champ est cependant plus grande qu’un microscope confocal standard, soit 50 µm en épaisseur. Cela n’affecte pas la qualité des images obtenues et cette spécification facilite en réalité son utilisation dans le tissu. En effet, plus de lumière est captée par le système d’acquisition, ce qui augmente sa rapidité et sa facilité d’utilisation, puisque cela procure au système une meilleure vue d’ensemble sur les structures à visualiser en trois dimensions.
Avec cette technique, il a été démontré que l’endoscope était assez petit en diamètre pour qu’une souris adulte survive facilement à son insertion lors de la chirurgie. Des images en fluorescence ont pu être acquises en peu de temps suite à l’opération. Le capillaire de verre faisant 250 µm de diamètre semble causer peu de dommages au tissu en comparaison avec d’autres endoscopes dans la littérature. Ce capillaire est très utile lors de l’imagerie, en premier lieu pour son rôle de guide dans le cerveau. Utiliser seulement la fibre augmenterait rapidement
Figure 2.17 – Microglies dans le mésencéphale d’une souris CX3-CR1-GFP.
l’usure de celle-ci et dégraderait la couche mince d’aluminium, rendant l’imagerie instable. En second lieu, la distance parcourue par la lumière directement dans le tissu est beaucoup plus courte avec le capillaire, diminuant l’effet de diffusion tout en conservant un champ de vue raisonnable. Les fibres ont été conçues pour que la lumière soit focaliser environ 60 µm passer la bordure de la fibre pour limiter l’effet de diffusion lors de la collection du signal de fluorescence. La diffusion occasionne beaucoup de perte dans le tissu, surtout en raison de la présence de lipide dans le cerveau. Avec le capillaire de verre, la lumière est focalisée environ à 70 µm de la fibre optique. Sur cette distance, environ 63 µm sont du verre et de l’air dont l’effet de diffusion est quasiment inexistant. La collection du signal en est donc améliorée, puisque la lumière n’aura diffusé que sur une dizaine de micromètres ou moins. Toutefois, il est certain que l’ajout d’un capillaire ajoute de l’astigmatisme comme aberration optique au système d’imagerie, de par sa forme cylindrique. Or, l’astigmatisme est déjà présent dans le système avec la lumière sortant sur le côté de la fibre optique. Le capillaire va augmenter son importance dans le système, mais sa contribution est alors négligeable comparativement à celle de la fibre en raison de son plus grand rayon de courbure. Caractériser l’astigmatisme dans le système serait une amélioration à apporter dans de futurs travaux.
Figure 2.18 – Microglies dans le mésencéphale d’une souris CX3CR1-GFP.
Dans un contexte d’imagerie in vivo, le PIM peut seulement être utilisé que lorsque la tête de l’animal est fixée. Il serait assez complexe d’adapter le système pour des animaux libres de leur mouvement lors de l’imagerie. Il existe des systèmes d’endoscopie complète en fluorescence spécialisés en neuroscience. L’endoscope de Doric Lenses en est un bon exemple. Cet endoscope utilise une GRIN d’un demi-millimètre en diamètre pour reporter le plan image du système plus en profondeur dans le tissu. Il s’agit d’un système d’imagerie à champ large (label chap 1) miniaturisé qui demeure en permanence sur la tête de l’animal. Cette technologie est très utile pour étudier différents phénomènes biologiques qui s’étalonnent sur plusieurs heures, voir plusieurs jours. L’animal peut être libre de ses mouvements pendant la séance d’imagerie. Ce système a été utilisé plusieurs fois dans le passé pour des applications en recherche en lien avec l’activité neuronale et l’imagerie calcique [15,47]. Toutefois, ce système possède plusieurs limites. En outre, puisque le système utilise une méthode à champ large (sectionnement optique inexistant), le contraste des objets en fluorescence est donc assez bas. Il est assez difficile avec ce système de distinguer clairement des dendrites ou des axones. Ce système est par contre très performant pour détecter des corps cellulaires et autres objets fluorescents relativement de la même taille.
Néanmoins, il est certain que ce ne sont pas toutes les recherches en neuroscience qui requiert un système d’imagerie in vivo avec des animaux libre de mouvement. En effet, il peut arriver que quelques séances d’imagerie distinctes étalonnées sur plusieurs semaines soient suffisantes. Pour ce type d’expérience, fixer la tête de l’animal peut être préférable et permet plus de liberté quant à l’imagerie, puisque le plan focal n’est pas limité à une position dans le tissu. Il est possible de prendre des images à plusieurs endroits avec le même animal. De plus, il est certain que la taille de l’endoscope dans le tissu aura nécessairement un énorme impact sur la santé de l’animal où un petit système en diamètre est préférable à long terme. Toutes les images prises in vivo dans ce mémoire ont été prises avec une souris sous anesthésie. Il serait nécessaire dans le futur de tester le système avec une souris éveillée dont la tête a été fixée. Il existe par ailleurs différentes approches pour ce genre d’expérience utilisant la réalité augmentée ou des coussins d’air pour donner l’impression à l’animal qu’il se déplace dans l’espace [58,35]. Ces techniques permettent d’étudier le comportement animal et son impact sur différents phénotypes neuronaux tout en utilisant des systèmes d’imagerie fixe. Ce genre de technologie serait donc parfaitement adapté au système PIM, puisqu’il permet de fixer la tête de l’animal tout en "simulant" une liberté de mouvement. Ce genre de système de fixation est largement utilisé avec des systèmes de microscopie en excitation 2-photons, qui ne sont pas adaptés non plus pour l’imagerie in vivo avec des animaux libre de leur mouvement.
Ce qui distingue le plus le PIM du reste des endoscopes dans la littérature est sans aucun doute son large champ de vue variable suite à son insertion dans l’animal. En effet, le champ de vue du système d’imagerie ne dépend pas du diamètre de la lentille GRIN, mais de l’angle de rotation de la fibre sur son axe, sa distance focale, ainsi que la translation de la fibre le long de l’axe de pénétration. Il est donc possible de combiner des images le long du capillaire guide dans le tissu pour former une image ayant un plus grand champ de vue effectif que ce que le système à balayage peut couvrir normalement. De plus, puisque la fibre se déplace verticalement avec un actuateur piézoélectrique, l’utilisateur peut choisir de balayer à la même hauteur constamment pour obtenir une image ayant une ligne de pixel (c’est avec ce mode de balayage que s’effectue l’imagerie calcique). Alors, il est possible de modifier le champ de vue de l’endoscope selon la taille désirée. Dans le cas où l’utilisateur voudrait obtenir la plus grande image possible dans un cerveau de souris adulte, celui-ci pourrait donc théoriquement combiner des images entre elles, couvrant une région effective de 800 µm x 4000 µm. De plus, il serait également possible d’utiliser des fibres optiques avec différentes longueurs de GRIN pour acquérir des images à différents niveaux d’épaisseur dans le tissu si la position dans le capillaire peut être conservée. Changer la longueur de la GRIN va modifier la position du point focal par rapport à la fibre.
Certaines compagnies vendent des systèmes ou des pièces dédiées à prendre des images à 90 degrés de l’axe d’un endoscope. Exemple, des prismes en verre avec un angle généralement de 45 degrés peuvent être collés au bout d’un endoscope, permettant ainsi de visualiser les
structures sur le côté de l’axe de pénétration du système optique, et non pas sous l’endoscope où les structures sont vraisemblablement endommagées par l’insertion du système. De plus, l’angle du prisme facilite son insertion dans l’échantillon. Ces outils sont fréquemment uti- lisés, puisqu’ils sont faciles à installer et offres plusieurs avantages au système endoscopique standard. Cependant, son installation dans l’échantillon est unique, c’est-à-dire qu’il n’est pas possible de le replacer ailleurs dans le tissu, contrairement au système PIM où la position du plan image peut varier une fois positionnée dans le capillaire.
L’imagerie calcique dans un animal vivant n’a pu être testée par manque de temps. La façon dont le logiciel a été configuré permet de rapidement installer l’endoscope pour l’enregistrement de l’activité calcique. Le logiciel permet de rapidement balayer une ligne à une vitesse de rotation de 30 Hz, donc interroger le même pixel à 60 Hz, ce qui est amplement suffisant pour l’utilisation de marqueurs fluorescents comme le GCAMP6f dont le temps de décroissance après un pic calcique varie autour de 200 ms [8]. Des tests sur des tranches organotypiques ont pu être utilisés pour effectuer une preuve de concept. Ces expériences ont montré qu’il était possible d’enregistrer une variation de signal sur une ligne de pixel dans une image prise avec l’endoscope. Les tests sur les tranches ont été effectués sans le capillaire de verre, augmentant ainsi l’instabilité du système. En considérant que les futures expériences se feront avec le capillaire et que les résultats montrent plusieurs bénéfices à son utilisation, tout porte à croire que l’enregistrement de signaux calciques dans un animal vivant fonctionnerait. D’autres expériences doivent être effectuées avec des animaux vivants pour valider son utilisation et son bon fonctionnement.
Bien entendu, le système ne peut être utilisé avec des souris en mouvement, puisque la fibre n’est pas fixée à la tête. Or, il existe des montages où la tête de la souris est fixe tout en permettant à la souris de se déplacer sur une sphère immobile dans l’espace. Ce genre de mon- tage pourrait être utile pour étudier par exemple les régions impliquées dans la récompense avec le PIM. Il existe même des marqueurs fluorescents dépendant de la dopamine, comme dlight1 [41]. Il pourrait être intéressant d’enregistrer les fluctuations de l’intensité de la fluo- rescence suite à l’éjection de la dopamine dans les régions où les neurones dopaminergiques projettent leurs axones, comme le striatum.
Chapitre 3
Imagerie volumétrique rapide avec
sectionnement optique HiLo
3.1
Objectifs
L’imagerie à grand champ de vue par fluorescence est une technique très utile en microscopie, puisqu’elle est rapide, simple et peu coûteuse. En raison de sa simplicité d’exécution, cette technique d’imagerie est largement utilisée dans le monde scientifique, surtout en biologie. De plus, cette technique est favorable en endoscopie, puisqu’il est possible de miniaturiser les pièces qui composent le microscope. Il est également possible d’utiliser cette technique avec des fibres optiques multicoeurs ou multimodes, comme mentionnée à la section 2.1 [39,
55]. Toutefois, comme il a été mentionné dans la section 1.6, ce type de microscopie n’a pas de méthode de sectionnement optique, ce qui signifie que tous les plans de l’échantillon illuminés par le laser vont émettre de la lumière et seront détectés par le système d’acquisition. Dans le cas de tranches minces sur lames de microscope (tranches de quelques dizaines de micromètres d’épaisseur), le sectionnement optique n’est pas nécessaire pour avoir une bonne qualité d’image. Cependant, dans le cas d’échantillons volumétriques comme des cerveaux de souris entiers ou des tranches épaisses, l’imagerie à grand champ de vue peut s’avérer problématique et la qualité d’image peut en être affectée.
C’est dans ce contexte que le HiLo a fait son apparition. L’algorithme HiLo est un procédé mathématique qui, à l’aide de deux types d’illumination, permet d’obtenir un sectionnement optique sur des images prises sur un microscope à fluorescence à champ large [56, 57, 26]. L’algorithme HiLo est simple d’utilisation et peut être rapidement implanté sur des systèmes de microscopie commerciaux déjà en place. La rapidité d’exécution permet d’acquérir un cerveau de souris en quelques minutes au lieu de plusieurs heures avec une résolution cellulaire.
(a) Illumination par granulation laser (b) Illumination uniforme
Figure 3.1 – L’algorithme HiLo utilise deux types d’illumination laser pour fonctionner. Cette technique a déjà attiré beaucoup d’intérêt dans le passé. Il est possible d’utiliser cet algorithme pour l’imagerie in vivo [27] et même pour l’endoscopie [46]. L’imagerie volumétrique a déjà été pratiquée dans le passé [33], mais cette approche comportait certaines limites [32] et rendait presque la technique inutilisable dans des tissus épais. En effet, il faut se rappeler que les techniques de transparisation comme le iDisco [45] et clarity [10] n’étaient pas encore à la mode. La transparisation des tissus réduit la diffusion de la lumière et permet ainsi d’acquérir beaucoup plus facilement des échantillons de grand volume.
Puis, une nouvelle technique de transparisation appelé « Expansion Microscopy » [7] per- mettait de non seulement clarifier les tissus, mais également de les faire grossir de manière homogène. Ainsi, toutes les structures gagnent en volume de près de 10 fois leur taille ini- tiale tout en gardant leur configuration dans l’espace. Il est donc possible d’effectuer de la microscopie à super-résolution avec des systèmes à grand champ de vue conventionnels. La combinaison de ces deux technologies, le HiLo et l’« Expansion Microscopy », permettrait d’amener la microscopie à grand champ de vue à un nouveau standard en ce qui concerne l’imagerie d’échantillons volumétrique.