3.6.1 Taille des grains laser
Afin de s’assurer de l’efficacité du microscope et de l’algorithme HiLo, il est important de mesurer la taille des grains laser. Leur taille va déterminer l’efficacité du sectionnement optique
(a) Image avec illumination par grains laser. (b) Image en a) suivi d’un filtre passe-bas.
Figure 3.5 – Les grains sont visibles après avoir appliqué un filtre passe-bas sur l’image prise avec une lame de microscope fluorescente.
obtenu suite au traitement d’image, soit la résolution axiale. Cependant, puisque les tavelures laser proviennent d’un phénomène ondulatoire statistique, il est très difficile de mesurer pré- cisément leur taille. Plusieurs méthodes ont été développées pour réaliser cette mesure, mais la plupart proviennent de simulations ou bien utilisent des grains laser relativement grands en diamètre comparativement à la taille des pixels du système d’acquisition.
Dans le cas qui nous intéresse, les échantillons utilisés seront principalement volumétriques. Or, retrouver les grains laser après diffusion dans un volume peut être difficile, surtout s’il faut obtenir un bon contraste pour que l’algorithme fonctionne selon les attentes. C’est pour cette raison qu’il est habituellement conseillé d’illuminer les échantillons volumétriques (plus que 150 µm en épaisseur) avec de grosses tavelures laser pouvant aller jusqu’à une vingtaine de pixels en diamètre [32,43]. Cependant, puisque les échantillons d’intérêt dans ce projet sont transparents, les grains diffuseront très peu dans le tissu et il sera plus facile de les imager avec le système d’acquisition tout en étant capable d’obtenir un bon contraste. Ainsi, la granulation doit être la plus petite possible, soit environ 2 pixels par grain laser [43] dans le but d’obtenir un bon sectionnement optique.
Une image des tavelures a été prise avec le microscope à l’aide d’une lame uniformément fluorescente de la compagnie Ted Pella inc [53]. Les tavelures laser, étant relativement pe- tites, sont difficilement observables sur l’image originale. Il est possible de les voir si un filtre passe-bande est appliqué sur l’image pour isoler les fréquences qui les génèrent (figure 3.5). En effectuant la même opération sur les images avec une illumination uniforme, on constate rapidement que les tavelures ne sont plus visibles (figure 3.6).
La transformée de Fourier permet de passer d’un espace spatial à un espace fréquentiel. Les tavelures, provenant d’un phénomène d’interférence (section 3.2), vont nécessairement
(a) Image avec illumination uniforme. (b) Image en a) suivi d’un filtre passe-bas.
Figure 3.6 – Les grains laser ne sont pas visibles sur l’image avec une illumination uniforme, comme il est souhaité, même après avoir passé un filtre passe-bas.
avoir différentes tailles dont la distribution sera normale sur l’échantillon. En appliquant la transformée de Fourier sur l’image, il est possible de retrouver cette distribution et de la quantifier.
La figure3.7présente les transformées de Fourier d’images prises avec une illumination par tavelures provenant de différentes fibres optiques. Il est possible de constater un étalement du spectre vers les hautes fréquences lorsque l’ouverture numérique de la fibre est plus élevée. Ce phénomène suit la théorie selon l’équation 3.1. De plus, lorsque les tavelures sont hors focus, ceux-ci prennent de l’expansion vue par la caméra et leur niveau de contraste diminue jusqu’à ce que le système ne puisse plus distinguer. C’est ce phénomène qui permet à l’algorithme HiLo de fonctionner. On constate à la figure3.7d que le spectre est majoritairement composé de basses fréquences (grosses structures dans le domaine spatial) et que le spectre diffère complètement de la figure 3.7c où la même fibre a été utilisée pour imager des tavelures au focus.
Une simulation par régression a permis de déterminer la taille moyenne des tavelures sur l’échantillon à partir de la figure3.7e. Les fibres ayant 0.22, 0.39 et 0.63 d’ouverture numérique ont été testées, ce qui donne des tailles moyennes d’environ 11,4 µm, 11,1 µm et 8,8 µm respectivement.
3.6.2 Résolution
Une cible a été utilisée pour caractériser la résolution du système (R1DS1N, Thorlabs,figure3.8). Ces cibles sont fréquemment utilisées dans le domaine de la microscopie, car elles sont très précises et permettent une caractérisation rapide du pouvoir de résolution. Sur ces cibles sont gravés plusieurs groupes de trois lignes horizontales et verticales. Si les lignes sont suffisam- ment éloignées les unes par rapport aux autres, il sera possible de les différencier avec les pixels
de la caméra. Dans le cas où les lignes sont trop rapprochées, la caméra sera incapable de les différencier, c’est-à-dire que 2 pixels collés vont chacun capter le signal de deux lignes côtes à côtes, laissant apparaître une seule source de signal s’étirant sur deux pixels sur l’image finale. L’espace vide entre ces deux lignes sera alors non visible sur l’image acquise.
Comme il est possible de le constater à la figure3.8, toutes les lignes du groupe 6 sur la cible sont facilement distinguables à la caméra. Il est encore possible de distinguer 3 maximums sur le profil d’intensité des éléments 3 du groupe 7 ayant la même intensité. Les éléments 4 du groupe 7 sont difficilement résolus (Figure3.9). Deux maxima sont visibles à la même intensité, ce qui suggère un recouvrement de la troisième ligne sur la cible.
Suite à ces résultats, il est possible conclure que la plus petite structure que le microscope peut résoudre fait environ 2.07 micromètres avec une illumination uniforme, sachant que les éléments 3 du groupe 7 correspondaient à un espacement de 161 paires de lignes par millimètre. Il est à noter que cette valeur correspond à la taille de pixel de la caméra (4.54 µm de diamètre) suivant un grossissement de 2.22x (3.4). À cette précision, les résultats peuvent varier si les lignes de la cible ne sont pas parfaitement alignées avec les pixels de la caméra, ce qui demande un ajustement de grande précision.
La résolution axiale de l’objectif est dépendante de sa résolution latérale. Il est possible de calculer la résolution latérale théorique de l’objectif par la formule d’Airy (équation 3.13), ce qui donne une résolution théorique de 1.449 µm. On peut donc conclure que la caméra est limitante dans le système. Puis, la résolution axiale selon l’équation 3.14, où n est l’indice de réfraction entre l’échantillon et l’objectif (ici l’air, 1.0000) et e est la plus petite distance qu’un détecteur peut résoudre au plan image de l’objectif, ici la résolution latérale de l’objectif [24].
∆x,y = 1.22λ NA = 1449nm@594nm (3.13) ∆z= λ · n NA2 + n · e M · NA∆z = 0.594 · 1 0.52 + 1 · 1.449 2 · 0.5 = 3.825µm (3.14) Il est important de distinguer résolution axiale et sectionnement optique. Ce dernier ne fait que garder la lumière sur une couche d’intérêt dans l’échantillon. La résolution axiale définit la plus petite structure pouvant être détectée par le système. Le sectionnement optique HiLo est directement dépendant de la taille des pixels. L’épaisseur du plan focal a pu être effectuée expérimentalement avec des billes fluorescentes. Les mêmes billes fluorescentes que précédemment ont été utilisées (2.5.1). Une lame avec 4 µL de solution de billes a été préparée et acquise par le microscope. Cinquante images ont été prises par incrément de 5 µm. La figure3.10montre qu’une bille peut se retrouver sur une seule image parmi trois consécutives.
Ainsi, il est possible d’affirmer que l’épaisseur du plan HiLo après le traitement est d’environ 5±4 µm, ce qui concorde avec la résolution axiale calculée à l’équation 3.14.