Estimation de position par des techniques d’impédancemétrie : applications aux puces microfluidiques

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d’impédancemétrie : applications aux puces

microfluidiques

Benoit Brazey

To cite this version:

Benoit Brazey. Estimation de position par des techniques d’impédancemétrie : applications aux puces

microfluidiques. Mécanique des fluides [physics.class-ph]. Université Bourgogne Franche-Comté, 2019.

Français. �NNT : 2019UBFCD011�. �tel-02313938�

´

Ecole doctorale n

°

37

Sciences Pour l’Ing ´enieur et Microtechniques

Doctorat d’Automatique

par

B

ENOIT

B

RAZEY

Estimation de position par des techniques d’imp ´edancem ´etrie :

applications aux puces microfluidiques.

Th `ese soutenue le 6 juin 2019 Composition du Jury :

FERREIRAANTOINE Professeur des Universit ´es, INSA Centre Val de Loire Rapporteur

PRELLECHRISTINE Professeur des Universit ´es, Universit ´e de Technologie

de Compi `egne

Rapporteur BIDEAUXERIC Professeur des Universit ´es, INSA Lyon (Pr ´esident du

jury)

Examinateur CHOLLETFRANCK Professeur des Universit ´es, Universit ´e Bourgogne

Franche-Comt ´e

Examinateur BOLOPIONAUDE Charg ´e de recherche CNRS, Institut FEMTO-ST Encadrant

GAUTHIERMICHAEL Directeur de recherche CNRS, Institut FEMTO-ST Directeur de th `ese

Universit ´e Bourgogne Franche-Comt ´e 32, avenue de l’Observatoire 25000 Besanc¸on, France

Introduction g ´en ´erale 1

1 Le tri cellulaire 5

1.1 Les techniques usuelles de tri cellulaire . . . 5

1.2 Les laboratoires sur puce . . . 6

1.2.1 Pr ´esentation g ´en ´erale . . . 6

1.2.2 Fabrication . . . 7

1.2.2.1 Fabrication et fermeture des canaux fluidiques . . . 8

1.2.2.2 Fabrication d’actionneurs et de capteurs `a l’aide de d ´ep ˆots de couches m ´etalliques. . . 9

1.2.2.3 Connexion des puces au monde ext ´erieur . . . 10

1.3 Actionnement et perception dans les LOCs . . . 11

1.3.1 Actionnement . . . 11

1.3.1.1 La microfluidique . . . 11

1.3.1.2 Les pinces optiques . . . 13

1.3.1.3 Actionnement magn ´etique . . . 13

1.3.1.4 La force d’acoustophor `ese . . . 16

1.3.1.5 La force de di ´electrophor `ese . . . 17

1.3.1.6 Comparatif des diff ´erentes m ´ethodes d’actionnement . . . 19

1.3.2 D ´etection . . . 20

1.4 Conclusion . . . 20

2 Imp ´edancem ´etrie : ´etat de l’art sur l’observation de position 23 2.1 G ´en ´eralit ´es sur la mesure d’imp ´edance . . . 23

2.2 La spectroscopie d’imp ´edance ´electrique . . . 24

2.2.1 Repr ´esentation classique d’une cellule en spectroscopie d’imp ´edance . . . . 25

2.2.2 Cadre applicatif . . . 27

2.2.3 Mesure de position et de vitesse dans les LOCs par imp ´edancem ´etrie . . . . 28

2.2.4 Sensibilit ´e de la mesure d’imp ´edance `a la position d’une cellule . . . 29

2.2.5 Conclusion . . . 30

2.3 La tomographie d’imp ´edance ´electrique . . . 30

2.3.1 Principe et formulation du probl `eme direct . . . 30

2.3.2 R ´esolution . . . 32

2.3.3 Conclusion . . . 33

2.4 L’observation d’ ´etat . . . 34

2.4.1 Principe . . . 34

2.4.2 Cadre applicatif . . . 35

2.4.3 Les filtres de Kalman . . . 36

2.4.4 Principe d’utilisation et r ´eglages du EKF . . . 38

2.5 Conclusion . . . 40

3 Conception et fabrication pour la mesure d’imp ´edance 43 3.1 Etude fonctionnelle de la plateforme de d ´etection de position par imp ´edancem ´etrie . 43 3.2 Environnement de test . . . 44

3.3 Conception de l’actionnement . . . 45

3.3.1 L’actionnement longue distance . . . 46

3.3.2 L’actionnement pr ´ecis et r ´ep ´etable par di ´electrophor `ese . . . 47

3.3.2.1 Design d’ ´electrodes pour le cas 1D . . . 47

3.3.2.2 Design d’ ´electrodes pour le cas 2D . . . 49

3.3.3 Actionnement en milieu ouvert pour le banc d’essai . . . 52

3.4 Conception de la partie d ´etection de position . . . 53

3.4.1 Electrodes int ´egr ´ees `a la puce fluidique pour la mesure d’imp ´edance . . . 54

3.4.2 Mesure de r ´ef ´erence pour l’ ´etalonnage . . . 58

3.5 Fabrication des puces fluidiques et connexions . . . 58

3.5.1 Fabrication des puces fluidiques . . . 58

3.5.1.1 Mat ´eriaux . . . 58

3.5.1.2 Proc ´ed ´es de fabrication des puces fluidiques . . . 59

3.5.2 Alimentation, contr ˆole et connexion des puces . . . 64

3.5.2.1 Alimentation pour l’actionnement . . . 64

3.5.2.2 Instrumentation pour la mesure par imp ´edancem ´etrie . . . 66

3.5.2.3 La vision . . . 67

3.5.2.4 Le World-to-Chip : connexions ´electriques et fluidiques . . . 69

3.6.1 Routage des signaux . . . 70

3.6.2 Acquisition . . . 72

3.7 Pr ´esentation de la plateforme finale . . . 73

3.8 Conclusion . . . 74

4 Mod `ele de la variation d’imp ´edance 75 4.1 D ´efinition de l’imp ´edance du syst `eme . . . 75

4.1.1 Hypoth `eses . . . 75

4.1.2 Influence relative des param `etres sur l’imp ´edance . . . 77

4.1.3 Formulation g ´en ´erale de l’imp ´edance du syst `eme . . . 78

4.1.4 Formulation du mod `ele direct . . . 79

4.2 Identification du mod `ele direct de position pour un cas 1D . . . 80

4.2.1 Extraction des signaux . . . 81

4.2.2 Analyse du bruit de mesure . . . 83

4.2.3 Analyse de la d ´erive . . . 83

4.2.4 Mod `ele direct . . . 84

4.3 Identification du mod `ele direct de position pour un cas 2D . . . 85

4.3.1 Analyse du bruit de mesure . . . 87

4.3.2 Analyse de la d ´erive . . . 88

4.3.3 Etalonnage du capteur . . . 88

4.3.3.1 Le probl `eme de l’isolation des voies . . . 88

4.3.3.2 Protocole . . . 89

4.3.3.3 Mod `ele direct de simulation . . . 91

4.4 Conclusion . . . 95

5 Estimation de position par imp ´edancem ´etrie 97 5.1 Utilit ´e d’un observateur de Kalman pour l’estimation de position . . . 97

5.2 Equations et mod `eles . . . 98

5.2.1 D ´efinition du probl `eme d’estimation d’ ´etat . . . 98

5.2.2 Mod `ele d’ ´etat . . . 100

5.2.2.1 Forme compl `ete . . . 100

5.2.2.2 Forme r ´eduite . . . 101

5.2.3 Mod `ele d’observation . . . 102

5.2.3.1 Forme compl `ete . . . 102

5.2.3.2 Forme r ´eduite . . . 103

5.3.1 Mise en place du suivi des billes . . . 103

5.3.2 Mise en œuvre exp ´erimentale de l’estimation de position d’une bille . . . 106

5.4 Simulations d’estimation de position en temps-r ´eel : cas 2D . . . 108

5.4.1 Pr ´esentation du cas d’ ´etude . . . 108

5.4.2 Simulation de r ´ef ´erence : cas id ´eal du milieu `a conductivit ´e constante et p ´eriode d’ ´echantillonnage des mesures nulle . . . 111

5.4.3 Influence des erreurs de mod `ele . . . 115

5.4.4 Etude de l’impact de la d ´erive thermique . . . 116

5.4.5 Prise en compte des contraintes technologiques de s ´equentialit ´e . . . 118

5.5 Conclusion . . . 123

Conclusion g ´en ´erale et perspectives 123 A Proc ´ed ´es de fabrication complets des puces 149 A.1 Fabrication des ´electrodes : lift-off . . . 149

A.2 Fabrication des canaux : photolithographie simple . . . 152

B Plans de la carte de routage HF2MUX 153 C Influence de l’actionnement 161 C.1 Ordres de grandeur . . . 161

Cette th `ese pr ´esente une m ´ethode de d ´etection de position d’un objet sph ´erique dans un canal mi-crofluidique bas ´ee sur des mesures de variation d’imp ´edance. Elle s’inscrit dans un cadre applicatif g ´en ´eral qui est celui du tri de cellules biologiques dans des puces microfluidiques.

Les cellules biologiques peuvent ˆetre consid ´er ´ees comme les ´el ´ements constitutifs ´el ´ementaires des ˆetres vivants. Leur ´etude est donc essentielle `a l’analyse, la compr ´ehension et le traitement de nombreuses maladies (VIH, tuberculose, paludisme, h ´epatite, cancers, etc.). Les cellules consti-tuent des tissus ou circulent `a l’int ´erieur du corps, on parle alors de cellules circulantes (lympho-cytes, h ´ematies, etc.). De nombreux dispositifs et m ´ethodes ont ´et ´e d ´evelopp ´ees pour assurer la caract ´erisation, la quantification ou le tri de cellules circulantes. Les analyses cellulaires, en particu-lier sanguines, sont particuli `erement d ´emocratis ´ees et interviennent dans de nombreux processus th ´erapeutiques. Les cellules, et en particulier les lymphocytes responsables de la r ´eponse immuni-taire, peuvent ´egalement ˆetre consid ´er ´ees comme des agents th ´erapeutiques, on parle alors d’im-munoth ´erapie bas ´ee sur des_{cellules m ´edicaments. Les principes de l’immunoth ´erapie ont ´et ´e}

identifi ´es au cours du XX `eme si `ecle en particulier par Coley et Old, consid ´er ´es comme les p `eres historiques de cette th ´erapie1,2. La mise en application de ces principes dans le cadre de th ´erapies maˆıtris ´ees a connu un essor au d ´ebut du XXI `eme si `ecle3 et a conduit `a de tr `es bons r ´esultats. L’immunoth ´erapie soul `eve ainsi beaucoup d’espoirs et s’affiche d ´esormais comme la th ´erapie du futur. Les co ˆuts typiques de ces traitements sont toutefois tr `es ´elev ´es et d ´epassent g ´en ´eralement 100 000 euros par patient3. Les m ´ethodes de fabrication de ces m ´edicaments doivent ainsi ˆetre repens ´ees afin de les rendre accessibles au plus grand nombre. Un des enjeux tient au fait que les m ´ethodes de tri d ´evelopp ´ees historiquement ne s’av `erent parfois pas suffisamment performantes pour l’immunoth ´erapie. Certains traitements d’immunoth ´erapie n ´ecessitent, en effet, l’identification de lymphocytes sp ´ecifiques dans un ´echantillon dont la concentration (typiquement 1/10000) est inf ´erieure au seuil de d ´etection actuel. FEMTO-ST d ´eveloppe actuellement de nouvelles m ´ethodes de tri ultra-s ´electif bas ´ees sur le contr ˆole en boucle-ferm ´ee dans des puces microfluidiques per-mettant de trier un ´echantillon, cellule par cellule, `a une cadence ´elev ´ee.

La th `ese pr ´esent ´ee ici s’int `egre dans ce programme de recherche et vise au d ´eveloppement de la partie sensorielle, en partenariat avec l’ ´equipe du Professeur P. Renaud de l’EPFL. La m ´ethode propos ´ee pour la mesure de position dans les puces est bas ´ee sur le principe physique de la mesure d’imp ´edance. Le principe g ´en ´eral de cette m ´ethode consiste `a exploiter la variation de l’imp ´edance entre deux ´electrodes induite par la pr ´esence d’une cellule afin d’en d ´eterminer la po-sition. Il s’agit l `a d’une alternative originale `a la r ´etroaction par vision classiquement utilis ´ee. En effet, comme illustr ´e sur la vue conceptuelle Figure 1, les capteurs classiques bas ´es sur la vision ont un champ de vision limit ´e. Avec un fort grossissement, le champ de vision est r ´eduit compa-rativement `a la taille de l’objectif optique. En raison de l’ ´enorme ratio entre le champ de vision et la taille de l’objectif, seules quelques parties de la surface de la puce sont visibles simultan ´ement avec des cam ´eras. Les mesures d’imp ´edance sont quant `a elles effectu ´ees `a l’aide d’ ´electrodes qui peuvent ˆetre facilement int ´egr ´ees `a des dispositifs microfluidiques en vue d’une d ´etection

sites de tri

encombrement d’un objectif de caméra

FIGURE1 Vue conceptuelle de trieurs de cellules pour l’analyse de cellules individuelles. A gauche, un

trieur conventionnel exploitant la vision pour la perception. A droite, un trieur hautement multiplex ´e exploitant la perception par imp ´edancem ´etrie.

rall ´elis ´ee, `a haute cadence, et ce dans des dizaines de bior ´eacteurs sur une surface plus restreinte. Plusieurs points doivent ˆetre abord ´es afin de valider cette approche. Notamment, les ´electrodes doivent ˆetre conc¸ues de mani `ere `a assurer la sensibilit ´e du capteur par rapport `a la position d’une cellule. ´Egalement, contrairement `a la plupart des applications bas ´ees sur la mesure d’imp ´edance, le traitement du signal doit ˆetre effectu ´e en ligne et en cons ´equence ne doit donc pas entraˆıner de retards, malgr ´e le fort bruit de mesure et la d ´erive inh ´erente `a ce type de dispositif. Enfin, une plateforme doit ˆetre d ´evelopp ´ee afin d’assurer la mise en œuvre exp ´erimentale.

La description de la mani `ere dont ces diff ´erents challenges sont adress ´ee est donn ´ee `a travers les cinq chapitres de d ´eveloppement du pr ´esent manuscrit.

Le Chapitre 1 comprend un ´etat de l’art g ´en ´eral sur les trieurs conventionnels. Plus sp ´ecifiquement, les techniques usuelles de tri et caract ´erisation cellulaire macroscopique y sont pr ´esent ´ees. Dans un second temps, un descriptif des laboratoires sur puce est donn ´e. Ceci a pour fin d’une part de positionner les pr ´esents travaux vis- `a-vis de l’ ´etat de l’art, mais ´egalement d’introduire les tech-niques et technologies usuelles de ce domaine tr `es sp ´ecifique que repr ´esentent les laboratoires sur puce.

Le Chapitre 2 est ´egalement un chapitre d’ ´etat de l’art. Diff ´erents domaines connexes `a la probl ´ematique de l’estimation de position dans des puces fluidiques par imp ´edancem ´etrie y sont d ´ecrits, en vue de se munir d’outils m ´ethodologiques et techniques `a partir de travaux ant ´erieurs. Ainsi, des r ´esultats importants en spectroscopie d’imp ´edance ´electrique, en tomogra-phie d’imp ´edance ´electrique, et enfin en estimation d’ ´etat sont pr ´esent ´es. La combinaison de divers ´el ´ements de ces domaines apporte notamment de la connaissance technique pour la fabrication et l’utilisation des puces, et pour l’estimation de position `a l’aide de mesures d’imp ´edance dans un environnement bruit ´e par une utilisation judicieuse des outils math ´ematiques et physiques `a dispo-sition.

Le Chapitre 3 porte sur la r ´ealisation physique et l’impl ´ementation informatique de la plateforme instrumentale d ´edi ´ee `a l’utilisation des puces microfluidiques d ´evelopp ´ees. Des designs de puces

sont propos ´es et associ ´es `a un proc ´ed ´e de fabrication. Celles-ci s’int `egrent dans le reste de la plateforme et sont associ ´ees `a un ensemble complet d’outils pour l’actionnement et la mesure per-mettant l’ ´etalonnage de capteurs et la validation exp ´erimentale de la m ´ethode.

Dans le Chapitre 4, un mod `ele de la r ´eponse des capteurs, c’est `a dire la variation de l’imp ´edance en fonction de la position, est d ´efini. La formulation analytique de ce mod `ele tient compte de la position de l’objet mais ´egalement d’autres sources de variation inh ´erentes `a ce type de dispositif. Ce chapitre comprend ´egalement une partie exp ´erimentale destin ´ee `a l’ ´etalonnage de capteurs `a l’aide de la plateforme d ´evelopp ´ee.

Le Chapitre 5 clos ces travaux `a travers la mise en oeuvre de l’estimation de position. En premier lieu, une m ´ethode permettant d’estimer la position dans les puces en temps-r ´eel est propos ´ee. Cette m ´ethode tient compte de diverses contraintes techniques, technologiques et physiques li ´ees au dispositif utilis ´e tel que le bruit de mesure par exemple. La m ´ethode est ensuite ´eprouv ´ee exp ´erimentalement. Enfin, des simulations donnent un aperc¸u de proc ´ed ´es d’estimation pour des capteurs plus avanc ´es.

Une conclusion g ´en ´erale vient enfin donner un r ´ecapitulatif des travaux effectu ´es et ouvre sur un panel de perspectives diverses.

Le tri cellulaire

Cette th `ese s’inscrit dans le contexte g ´en ´eral de la d ´etection de position dans les puces de tri cellulaire pour am ´eliorer les techniques d’immunoth ´erapie. A travers ce tout premier chapitre de d ´eveloppement, l’objectif est de fournir un ´etat de l’art du tri cellulaire. Les principales m ´ethodes et technologies de tri y sont ´evoqu ´ees, ainsi que leurs avantages et limitations. Un accent particulier est mis sur une technologie ´emergente, les dispositifs miniaturis ´es. Cet ´etat de l’art met en avant la n ´ecessit ´e de d ´etecter les cellules au sein d’une puce fluidique, et les limitations des solutions existantes. Une ´etude des diff ´erents ph ´enom `enes physiques utilis ´es pour l’actionnement et/ou la d ´etection dans les puces fluidiques met en avant l’int ´er ˆet des champs ´electriques. Cette approche sera d ´evelopp ´ee dans le chapitre suivant.

1.1/

Les techniques usuelles de tri cellulaire

Actuellement, il existe plusieurs m ´ethodes de tri des cellules. Les plus couramment utilis ´ees sont le tri cellulaire activ ´e par fluorescence, le tri magn ´etique, la centrifugation et le tri activ ´e par flottabilit ´e. La centrifugation est l’une des techniques les plus utilis ´ees. Il s’agit d’un proc ´ed ´e de s ´eparation des compos ´es d’un m ´elange en fonction de leur diff ´erence de densit ´e et de leur taille en les soumettant `a une force centrifuge. Les applications de centrifugation sont nombreuses et peuvent comprendre la s ´edimentation de cellules et de virus4, la s ´eparation d’organelles sub-cellulaires et l’isolation de macromol ´ecules comme l’ADN, l’ARN, les prot ´eines et les lipides5. Cette m ´ethode est relativement peu co ˆuteuse et rapide. Toutefois sa s ´electivit ´e est faible, et elle ne permet pas d’isoler des po-pulations rares. En cons ´equence, elle est principalement utilis ´ee pour le tri de vastes popo-pulations, comme par exemple lors d’un don de plaquettes.

Le tri cellulaire activ ´e par fluorescence, ou Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS), utilise la cytom ´etrie en flux pour fournir une mesure rapide et quantitative des propri ´et ´es cellulaires (voir Figure 1.1). Il s’agit de l’une des techniques les plus courantes pour caract ´eriser qualitativement et quantitativement une population cellulaire et / ou pour la trier. La cytom ´etrie en flux est une tech-nique permettant de faire d ´efiler des particules, mol ´ecules ou cellules `a grande vitesse dans le faisceau d’un laser, en les comptant et en les caract ´erisant. C’est la lumi `ere r ´e ´emise (par diffusion ou fluorescence) qui permet de classer la population suivant plusieurs crit `eres et de les trier. Cepen-dant, elle souffre de plusieurs inconv ´enients parmi lesquels son co ˆut, ses dimensions importantes et le manque de sensibilit ´e pour trier les ´ev ´enements rares en dessous de 0,1% de fr ´equence. A titre d’exemple sur la technique de cytom ´etrie de flux, le trieur cellulaire Genotoul6permet d’isoler et de r ´ecup ´erer une ou plusieurs population(s) cellulaire(s) selon des crit `eres de taille, de

losit ´e (contenu cellulaire) et/ou de fluorescence (r ´ecepteur, transformation g ´en ´etique, phase cellu-laire. . . ). Le tri cellulaire peut aller de l’enrichissement d’une population jusqu’ `a la s ´election d’un type cellulaire donn ´e. Les cellules pr ´elev ´ees peuvent ainsi ˆetre analys ´ees de fac¸on biochimique ou remises en culture.

(a) Sch ´ema de principe7 (b) Caract ´erisation de bact ´eries8

FIGURE1.1 Pr ´esentation d’un trieur FACS. (a) Sch ´ema de principe : la lumi `ere r ´e ´emise (par diffusion ou

fluorescence) permet de classer la population suivant plusieurs crit `eres et de les trier.(b) Exemple d’une

caract ´erisation de bact ´eries en oc ´eanographie `a l’aide d’un trieur FACS.

Le tri magn ´etique de cellules permet d’enrichir un m ´elange h ´et ´erog `ene de cellules sur la base de propri ´et ´es extracellulaires, typiquement des prot ´eines de surface cellulaire (antig `enes). En effet, les particules magn ´etiques (paramagn ´etiques le plus souvent) sont attach ´ees `a des anticorps sen-sibles `a la population de cellules cibles. Lors du m ´elange des particules magn ´etiques, ces derni `eres se fixent sur les cellules, ce qui leur conf `ere des propri ´et ´es magn ´etiques. Il existe plusieurs types de tris magn ´etiques de cellules. Le tri cellulaire `a activation magn ´etique (MACS) est une technique de s ´eparation o `u les cellules sont pass ´ees `a travers une colonne magn ´etique9. La s ´election po-sitive/n ´egative est une technique de s ´eparation cellulaire sans colonne dans laquelle un tube de cellules marqu ´ees est plac ´e `a l’int ´erieur d’un champ magn ´etique10. Les cellules s ´electionn ´ees po-sitivement sont retenues dans le tube tandis que les cellules s ´electionn ´ees n ´egativement restent dans la suspension liquide. Comme le tri par cytom ´etrie en flux, le tri magn ´etique est sp ´ecifique car il repose sur l’utilisation d’anticorps pour s ´electionner la population cible. Par contre, `a la diff ´erence du tri par FACS, la s ´election d’une population de cellules viables par tri cellulaire magn ´etique est tr `es rapide. Les cellules tri ´ees sont ´egalement vivantes et fonctionnelles. Un article r ´ecent confronte les trieurs par fluorescence et magn ´etiques11.

Enfin, plus r ´ecemment la start-up Akadeum Life Sciences commercialise en 2014 le tri cellulaire activ ´e par flottabilit ´e (BACS)12,13. Il s’agit d’une technique de s ´eparation dans laquelle des micro-bulles se lient aux cellules par l’interm ´ediaire d’anticorps se liant `a la surface des cellules. Les cellules cibl ´ees sont ensuite retir ´ees d’un ´echantillon biologique par flottation.

1.2/

Les laboratoires sur puce

1.2.1/

Pr ´esentation g ´en ´erale

Au cours des derni `eres ann ´ees, des dispositifs de caract ´erisation cellulaire miniaturis ´es, com-mun ´ement qualifi ´es de Laboratoires sur puce (Lab-on-a-chip, LOC), ont commenc ´e `a ´emerger. Ces dispositifs sont issus de la microfabrication. Ils poss `edent le plus souvent des connexions

´electriques qui permettent d’envoyer des signaux d’excitation et/ou de mesure, ainsi que des connexions fluidiques pour l’acheminement de fluides. L’objectif est de faire de petits appareils portables dans lesquels un ´echantillon de cellules peut ˆetre charg ´e, et toutes les informations de-mand ´ees extraites. Les cellules et particules en suspension sont d ´eplac ´ees par un contr ˆole du d ´ebit ou de la pression entre l’entr ´ee et la sortie du canal microfluidique d’un LOC, en passant par un ou plusieurs ´etages d’analyse et/ou de tri. Une illustration est donn ´ee Figure 1.2 et repr ´esente un exemple typique de dispositif microfluidique. Ces dispositifs exploitent des ph ´enom `enes physiques et techniques divers pour le tri et la caract ´erisation, et n ´ecessitent des m ´ethodes particuli `eres de fabrication, qui seront d ´ecrites dans les sections qui suivent.

(a) Illustration d’un LOC.

IBM Research GmbH14 .

(b) Un LOC poss ´edant un grand nombre

d’ ´electrodes.

Harvard Institute of Technology15

(c) Un LOC poss ´edant diff ´erents canaux

fluidiques. Cherry Biotech16

FIGURE1.2 Exemples de laboratoires sur puce (Lab-on-a-chip, LOC) : diff ´erentes couches superpos ´ees

permettent de faire transiter du fluide et des ´echantillons dans un canal afin de les caract ´eriser.

1.2.2/

Fabrication

La fabrication de ces dispositifs microfluidiques est souvent bas ´ee sur des technologies de mi-crofabrication en salle blanche. Ils sont ensuite reli ´es `a diff ´erents appareils d’actionnement et de mesure par l’interm ´ediaire de connexions fluidiques et ´electriques. Malgr ´e la diversit ´e de ces LOCs certaines ´etapes de fabrication se retrouvent dans la majorit ´e des dispositifs. Le d ´ep ˆot de couches minces structur ´ees et de m ´etaux permet la r ´ealisation de capteurs et d’actionneurs, et des couches

´epaisses de polym `eres sont utilis ´ees pour r ´ealiser des canaux fluidiques. Une ´etape de capotage permet d’assurer l’ ´etanch ´eit ´e du dispositif.

Plusieurs articles sont disponibles pour une description d ´etaill ´ee de ces m ´ethodes14,17–20.

1.2.2.1/ Fabrication et fermeture des canaux fluidiques

Les LOCs exploitent des canaux issus de la microfabrication afin de faire transiter les ´echantillons `a caract ´eriser. Les dimensions de ces canaux d ´ependent de la taille des ´echantillons qui y sont in-troduits, mais sont g ´en ´eralement de quelques dizaines de microm `etres de largeur et de hauteur, et quelques centim `etres de longueur. Les mat ´eriaux utilis ´es sont le plus souvent biocompatibles, chi-miquement modifiables, faciles `a fabriquer et peu on ´ereux. Ils sont ´egalement g ´en ´eralement trans-parents, ce qui permet une observation au microscope. On peut notamment citer le borosilicate, le verre, le silicium, et les polym `eres de poly-dim ´ethylsiloxane (PDMS), le poly-m ´ethyl-m ´ethacrylate (PMMA), la r ´esine photosensible SU-8 et le polyimide.

Canaux d ´epos ´es La premi `ere m ´ethode pour obtenir un canal consiste `a r ´ealiser des murs en r ´esine `a l’aide de m ´ethodes de photolithographie. Des m ´ethodes alternatives mentionnent l’utili-sation de moules, ou encore de lasers. Le choix du mat ´eriau et de la m ´ethode de fabrication des canaux va avant tout d ´ependre du type de fermeture envisag ´e et des mat ´eriaux qui doivent ˆetre d ´epos ´es sur le substrat. Eux-m ˆemes d ´ependent du type d’application pr ´evu pour la puce.

Les r ´esines n ´egatives telles que la SU-8 sont couramment utilis ´ees pour la fabrication des ca-naux17. Contrairement `a la plupart des r ´esines positives, il est possible d’obtenir facilement des canaux de l’ordre de la centaine de microm `etres d’ ´epaisseur. Le proc ´ed ´e est de plus tr `es simple, et il s’agit d’un mat ´eriau bio-compatible. Toutefois, certaines alternatives sont parfois pr ´ef ´er ´ees `a l’utilisation de cette r ´esine, notamment en raison du fait qu’une fois recuite, il est difficile d’obtenir une adh ´esion suffisante entre celle-ci et le capot permettant une fermeture herm ´etique de la puce. Afin de contourner ce probl `eme, de nombreux mat ´eriaux polym `eres peuvent ˆetre utilis ´es tels que le PDMS. Le PDMS est devenu de loin le mat ´eriau le plus populaire dans la communaut ´e microflui-dique acad ´emique car il est peu co ˆuteux, facile `a fabriquer par la r ´eplication des moules en utilisant le prototypage rapide ou d’autres techniques, flexible, transparent, biocompatible et sa fabrication ne n ´ecessite pas des conditions de salle blanche.

Canaux grav ´es Une deuxi `eme m ´ethode d’obtention de canaux consiste `a les graver dans un substrat. Le micro-usinage de Si et de verre est attrayante pour certaines applications qui peuvent n ´ecessiter des structures microfluidiques `a la fois robustes, chimiquement stables et qui peuvent potentiellement int ´egrer des ´electrodes interdigit ´ees et/ou des ´el ´ements de d ´etection actifs. Les puces de silicium sont non transparentes, de sorte que l’observation n’est possible qu’ `a travers le capot. Toutefois, ces substrats sont compatibles avec des circuits ´electroniques. La technique la plus courante pour ce type de fabrication est la gravure de substrats par des m ´ethodes de gravure profonde comme la DRIE21(Deep Reactive Ion Etching). Cette technologie permet de graver des structures de rapport d’aspect ´elev ´e tr `es profondes. De nombreuses puces microfluidiques ayant des structures extr ˆemement pr ´ecises et dont la profondeur peut atteindre plusieurs centaines de microm `etres peuvent ˆetre fabriqu ´ees sur une tranche compl `ete (avec des vitesses de gravure allant g ´en ´eralement de 5 `a 10

µ

m.min−1). Des proc ´ed ´es plus r ´ecents permettent ´egalement d’exploiter un usinage par laser de substrats de verre.

Fermeture La plupart des LOCs sont ferm ´es herm ´etiquement `a l’aide de capots. Diff ´erentes m ´ethodes de fermeture en fonction de divers crit `eres tels que leur complexit ´e et la qualit ´e du r ´esultat sont possibles18. On peut notamment citer les m ´ethodes suivantes :

— Utilisation de PDMS14

Diverses techniques ont ´et ´e adapt ´ees pour fabriquer des structures microfluidiques en PDMS, y compris la gravure humide et s `eche, la photolithographie d’un PDMS photosen-sible, l’ablation laser et la_{lithographie douce. Cependant, le PDMS pr ´esente quelques}

inconv ´enients tels que l’adsorption des mol ´ecules hydrophobes, sa stabilit ´e `a court-terme apr `es un traitement de surface, il a tendance `a gonfler en pr ´esence de solvants organiques... — Utilisation de thermoplastiques

Les thermoplastiques poss `edent une grande vari ´et ´e de propri ´et ´es attrayantes pour les ap-plications de LOC, notamment leur ´elasticit ´e, leur r ´esistance m ´ecanique, leur transparence optique, leur stabilit ´e chimique, et/ou leur biocompatibilit ´e. Des structures aux motifs de taille sub-microm ´etrique peuvent ˆetre obtenus, et la fermeture peut ˆetre effectu ´ee notamment `a l’aide de 4 m ´ethodes : par fusion thermique, `a l’aide de solvants22,23, `a l’aide d’ultrasons, ou encore par adh ´esion24–26.

— Fusion directe de substrats en verre ou silicium

La fusion Si-Si permet d’obtenir des forces d’adh ´esion entre les substrats extr ˆemement ´elev ´ees. Toutefois, l’utilisation du verre (collage anodique Si-verre27 ou collage par fusion verre-verre28) est souvent pr ´ef ´er ´ee en raison du co ˆut moins ´elev ´e du verre et de sa trans-parence optique.

Les m ´ethodes de fabrication des canaux, et des capots associ ´es sont donc tr `es diverses et d ´ependent des fonctionnalit ´es attendues du laboratoire sur puce.

1.2.2.2/ Fabrication d’actionneurs et de capteurs `a l’aide de d ´ep ˆots de couches m ´etalliques.

Comme cela sera d ´ecrit dans les sections suivantes, les laboratoires sur puce incluent g ´en ´eralement des capteurs et/ou des actionneurs, qui peuvent notamment ˆetre fabriqu ´es `a l’aide de techniques de d ´ep ˆots m ´etalliques en couche mince. C’est le cas par exemple lors de la r ´ealisation d’ ´electrodes pour la g ´en ´eration de champs ´electriques ou la mesure d’imp ´edance.

Deux grandes techniques sont utilisables pour r ´ealiser ces d ´ep ˆots, la gravure humide et le lift-off comme montr ´e Figure 1.3. Elles sont bas ´ees sur des ´etapes de d ´ep ˆots de couches minces, et de photolithographie. La photolithographie consiste `a insoler s ´electivement des r ´esines photosensibles `a travers un masque, de mani `ere `a cr ´eer des motifs sur les substrats.

Le proc ´ed ´e de lift-off est pr ´esent ´e Figure 1.3 (sous-figure (a)). Une r ´esine photosensible est ap-pliqu ´ee sur le substrat. Celui-ci est ensuite align ´e sur un masque ne laissant traverser la lumi `ere que de mani `ere s ´elective. Une exposition aux UV suivie par un d ´eveloppement permet d’obtenir des motifs correspondants aux ´electrodes. La r ´esine est ici positive : les r ´egions expos ´ees aux UV sont retir ´ees du substrat. Le processus suivant consiste `a d ´eposer une fine couche m ´etallique (par exemple l’or, le platine et le chrome) sur l’ensemble du substrat en utilisant la technique de pulv ´erisation cathodique ou l’ ´evaporation. Dans le cas o `u le d ´ep ˆot se fait par ´evaporation, le sub-strat est plac ´e dans une chambre `a vide dans laquelle un morceau de mat ´eriau m ´etallique est chauff ´e, ´evapor ´e et d ´epos ´e sur la partie sup ´erieure du substrat. Dans la pulv ´erisation cathodique, des atomes ou groupements sont ´eject ´es `a partir d’un mat ´eriau cible, puis dirig ´es vers le sub-strat. Apr `es que le m ´etal ait ´et ´e d ´epos ´e, le substrat est immerg ´e dans un solvant (par exemple l’ac ´etone), ce qui a pour effet de dissoudre la couche de r ´esine photosensible et donc de retirer

FIGURE1.3 Deux proc ´ed ´es de fabrication d’ ´electrodes coplanaires : (a) le lift-off et (b) la gravure17.

la couche m ´etallique qui est d ´epos ´ee sur sa partie sup ´erieure. Ce proc ´ed ´e de lift-off permet donc d’obtenir des motifs m ´etalliques identiques `a ceux du masque.

Le proc ´ed ´e de gravure humide est pr ´esent ´e Figure 1.3 (sous-figure (b)). Ce proc ´ed ´e est relative-ment similaire `a celui du lift-off, `a ceci pr `es que la couche m ´etallique est d ´epos ´ee avant la couche de r ´esine photosensible. Celle-ci n’est donc plus sacrificielle mais sert de protection aux motifs m ´etalliques. S’en suit l’ ´etape de gravure afin d’ ´eliminer s ´electivement le m ´etal non prot ´eg ´e du sub-strat, puis la r ´esine r ´esiduelle. Dans ce proc ´ed ´e, le temps de gravure doit ˆetre d ´efini avec pr ´ecision afin de limiter la sous-gravure, c’est- `a-dire la gravure du m ´etal en dessous de la r ´esine par attaque isotrope du produit de gravure.

Ces deux m ´ethodes de r ´ealisation d’ ´electrodes sont majoritairement utilis ´ees pour la fabrication d’actionneurs dans les puces fluidiques. Le lift-off sera toutefois pr ´ef ´er ´e lorsque la r ´esolution des motifs est un crit `ere essentiel, car il n’induit pas de sous-gravure.

1.2.2.3/ Connexion des puces au monde ext ´erieur

Une fois les puces fabriqu ´ees, il est n ´ecessaire de les connecter fluidiquement et ´electriquement aux appareils ext ´erieurs. Ces interfaces sont commun ´ement appel ´ees _{fluidic interconnect, world-to-chip oumacro-to-micro. Id ´ealement}14_{, une connexion fluidique doit avoir un}

vo-lume mort minimal, ´eviter la contamination crois ´ee des ´echantillons, ˆetre facile `a brancher, ˆetre amovible et r ´eutilisable, ˆetre fiable `a des pressions ´elev ´ees, avoir un volume suffisamment faible pour permettre des connexions `a haute densit ´e, est faite en utilisant des techniques peu co ˆuteuses et simples, ˆetre chimiquement inerte et ˆetre compatible avec les tuyaux et les raccords commer-ciaux. Les connexions ´electriques doivent quant `a elles assurer un bon contact ´electrique avec la puce.

La connexion des puces au monde ext ´erieur n ´ecessite donc un r ´eel travail de conception au pr ´ealable afin de faciliter les exp ´erimentations et limiter les pertes inutiles d’ ´echantillons.

1.3/

Actionnement et perception dans les LOCs

1.3.1/

Actionnement

FIGURE1.4 Principales techniques d’actionnement dans les LOCS19_.

Diff ´erentes techniques permettent de d ´eplacer les ´echantillons et de les trier dans les LOCs. La Figure 1.4 r ´epertorie les principales m ´ethodes utilis ´ees. Dans la suite de cette partie, nous revien-drons bri `evement sur les m ´ethodes passives, puis sur chaque m ´ethode active, domaine d’int ´er ˆet de cette th `ese.

1.3.1.1/ La microfluidique

L’utilisation d’un fluide dans les LOCs sert au transport des ´echantillons vers une zone de tri, mais celui-ci peut ´egalement ˆetre utilis ´e pour le tri en lui-m ˆeme. En effet, les caract ´eristiques des ph ´enom `enes d’ ´ecoulement `a l’ ´echelle microscopique et notamment le profil de vitesse au sein d’un canal, sont exploitables pour s ´eparer des microparticules de mani `ere continue. Ces tech-niques passives pr ´esentent l’avantage par rapport aux techtech-niques actives qu’aucun champ externe n’est requis pour le processus de tri. Cependant, l’efficacit ´e du tri des particules et le d ´ebit sont g ´en ´eralement moins ´elev ´es que pour des techniques actives.

Huit principales m ´ethodes de tri microfluidique sont utilisables, chacune ayant ses sp ´ecifit ´es et performances. Le tri ´etant dans ces cas exclusivement effectu ´e `a l’aide du fluide, les param `etres physiques servant de crit `ere discriminant sont donc exclusivement m ´ecaniques et g ´eom ´etriques : taille29, poids30, raideur31et densit ´e32des particules. On peut notamment citer le fractionnement en flux pinc ´e (Pinched Flow Fractionnation, PFF), qui exploite deux fluides diff ´erents, associ ´es `a des effets inertiels pour le tri par taille et densit ´e32, ou encore la manipulation par micro vortex

(Micro-Vortices Manipulation, MVM), permettant une s ´eparation par poids30. A titre illustratif, le d ´eplacement lat ´eral d ´eterministe (Deterministic Lateral Displacement, DLD), dont un sch ´ema est pr ´esent ´e Figure 1.5 permet un tri par taille d’ ´echantillons sph ´eriques. Le DLD est une technolo-gie qui utilise la disposition sp ´ecifique de poteaux dans un canal pour contr ˆoler avec pr ´ecision la trajectoire et faciliter la s ´eparation des particules plus grandes et plus petites qu’un diam `etre cri-tique, avec une r ´esolution pouvant descendre jusqu’ `a 10 nm33. Des variantes r ´ecentes du DLD appliquent ce principe pour le cas de particules non sph ´eriques34.

FIGURE1.5 Illustration du tri de cellules par taille par DLD35.

Le tri d’objets de taille microm ´etrique dans un flux continu est n ´ecessaire pour une grande vari ´et ´e d’applications, dont les synth `eses chimiques, le traitement des min ´eraux et les analyses biolo-giques. A titre d’exemple, Hur37 propose un dispositif exploitant les effets dynamiques du fluide dans un laboratoire sur puce afin de s ´eparer des cellules par taille et d ´eformabilit ´e. Ce syst `eme exploite le fait que les cellules canc ´ereuses sont plus larges et poss `edent une plus grande d ´eformabilit ´e que les cellules saines pour proposer un outil de diagnostic int ´eressant pour l’on-cologie. Holmes36exploite le DLD afin de filtrer des parasites contenus dans le sang gr ˆace `a leur diff ´erence de taille et de forme par rapport aux cellules sanguines. Une photographie d’un prototype est propos ´ee Figure 1.6. Le rayon effectif, c’est `a dire le rayon_{´equivalentau cas d’une cellule}

sph ´erique, des cellules du sang ´etant plus faible que celui des parasites. R ´eguli `erement, les cel-lules sanguines ( `a gauche sur l’image), une fois en collision avec un plot, contournent celui-ci par sa partie gauche en raison de leur faible rayon. En revanche, les parasites ( `a droite) contournent syst ´ematiquement les plots par leur partie droite. Les parasites peuvent ainsi ˆetre isol ´es, aboutis-sant `a une purification de l’ ´echantillon initial.

FIGURE1.6 S ´eparation de parasites contenus dans du sang humain `a l’aide du DLD36. Les cellules sanguines ( `a gauche) ont un rayon effectif plus faible que les parasites ( `a droite), ce qui permet la purification du sang.

En conclusion, la microfluidique est donc un domaine bien maˆıtris ´e des laboratoires sur puces, permettant un tri statistique `a haut d ´ebit et selon plusieurs param `etres d’objets.

1.3.1.2/ Les pinces optiques

Principe

Le principe de la pince optique est de pi ´eger une particule de petite dimension (mol ´ecule, cellule...) `a l’aide d’un faisceau laser. On peut montrer sous certaines conditions qu’une particule a tendance `a se d ´eplacer vers la zone de plus forte intensit ´e lumineuse. Les particules ont donc tendance `a se d ´eplacer au centre du faisceau laser. Un d ´eplacement pr ´ecis d’une particule est alors permis par simple d ´eplacement du faisceau laser de pi ´egeage, comme illustr ´e Figure 1.7. Les forces exerc ´ees sont g ´en ´eralement de l’ordre du picoNewton.

Applications

La fonctionnalit ´e premi `ere des pinces optiques est la manipulation38 d’objets aux dimensions mi-crom ´etriques. Elles sont notamment utilis ´ees afin de les d ´eplacer et/ou de les isoler. Ces op ´erations peuvent ˆetre effectu ´ees sur des cellules telles que des bact ´eries, des virus, des spermatozo¨ıdes39, ou `a une ´echelle plus petite, sur des brins d’ADN par exemple40,41. A titre d’exemple, ces pinces ont ´et ´e utilis ´ees afin d’isoler et de caract ´eriser la d ´eformabilit ´e d’ ´erythrocytes, un crit `ere d ´eterminant le flux sanguin dans la microcirculation42. Un faisceau de plus grande intensit ´e lumineuse peut ´egalement ˆetre utilis ´e pour cr ´eer des<sub>ciseaux optiques, c’est `a dire un instrument d’ablation</sub>43_.

D’autres applications mentionnent le pi ´egeage simultan ´e de plusieurs particules. Il est possible d’utiliser un r ´eseau de lasers pour cr ´eer une matrice de sites de pi ´egeage44. Il est ´egalement pos-sible de cr ´eer une s ´erie de pi `eges en balayant un seul faisceau laser sur diff ´erents emplacements. Bien que chaque site ne soit ´eclair ´e qu’ `a temps partiel dans cette approche de partage du temps, le puits de potentiel moyen est assez fort pour pi ´eger un objet microscopique `a condition que le laser parcourt chaque emplacement de pi `ege assez souvent pour surmonter tous les probl `emes d ˆus `a la diffusion des particules. Cependant, l’approche actuelle la plus r ´epandue pour la cr ´eation de pi `eges multiples implique l’utilisation d’ ´el ´ements optiques diffractifs pour r ´ealiser des pinces op-tiques holographiques, dont un exemple est donn ´e Figure 1.8. Les pinces opop-tiques holographiques utilisent des hologrammes g ´en ´er ´es par ordinateur pour cr ´eer des configurations tridimensionnelles arbitraires de pi `eges optiques `a faisceau unique. Des descriptifs plus approfondis de cette m ´ethode sont disponibles dans la litt ´erature45–48.

La pince optique est donc un outil efficace de manipulation et de d ´ecoupe d’objets de taille mi-crom ´etrique, en particulier en t ´el ´eop ´eration. Elle n ´ecessite toutefois des moyens importants pour la mise en oeuvre, et n’est pas utilisable pour une manipulation `a haute cadence en raison des faibles forces exerc ´ees sur les objets.

1.3.1.3/ Actionnement magn ´etique

Principe Le principe de la manipulation magn ´etique consiste `a utiliser des aimants perma-nents ou des bobines pour d ´eplacer des particules paramagn ´etiques, diamagn ´etiques ou ferro-magn ´etiques. A titre d’exemple, des forces comprises entre 10 et 100 pN peuvent ˆetre exerc ´ees sur des billes paramagn ´etiques ayant un diam `etre de l’ordre du microm `etre en utilisant des aimants permanents qui sont commod ´ement positionn ´es `a l’ext ´erieur de la chambre d’ ´ecoulement. L’action-nement magn ´etique n’est pas sp ´ecifique aux LOCs, mais plus g ´en ´eralement `a la micromanipulation sans contact.

(a) Principe d’une pince optique49. (b) Origine physique50.

FIGURE1.7 Pr ´esentation d’une pince optique. (a) Sch ´ema de principe : un faisceau laser est focalis ´e au

niveau de la particule `a d ´eplacer.(b) Origine physique : un gradient d’intensit ´e lumineuse cr ´ee une force

totale non nulle exerc ´ee sur la particule.

FIGURE1.8 Deux vues d’un icosa `edre en rotation de sph `eres collo¨ıdales cr ´e ´ees avec des pinces optiques

holographiques dynamiques51.

Applications Les particules magn ´etiques (voir Figure 1.9) sont particuli `erement utilis ´ees pour les tests de diagnostic dans les LOCs. Concernant la manipulation d’un grand nombre d’objets en simultan ´e, des particules magn ´etiques ont ´et ´e utilis ´ees pour m ´elanger des fluides, capturer s ´electivement des analytes sp ´ecifiques (les biomarqueurs `a d ´etecter), concentrer des analytes, en transf ´erer d’une solution `a une autre, effectuer des analyses de stringence et les ´etapes de lavage, ainsi enfin que pour sonder les propri ´et ´es biophysiques des analytes. Diff ´erents articles passent en revue les diff ´erents domaines d’applications et m ´ethodes53,54. On peut notamment citer le contr ˆole en boucle ferm ´ee `a l’aide de quatre bobines55, la manipulation `a l’aide de microsph `eres magn ´etiques52, la manipulation haptique `a l’aide de microrobots56,57 ou encore l’utilisation de micronageurs58. L’actionnement se fait g ´en ´eralement `a l’aide de bobines de taille centim ´etrique plac ´ees sur l’ext ´erieur d’une plate-forme. Des actionneurs magn ´etiques de taille microm ´etrique,

FIGURE1.9 Capture de cibles par affinit ´e d ´ependant des propri ´et ´es de surface r ´eactives des particules

magn ´etiques52.

FIGURE1.10 Petit robot `a corps mous avec locomotion multimodale56.

moins courant, sont ´egalement ´evoqu ´es dans la litt ´erature59,60. L’utilisation de la force magn ´etique peut ´egalement ˆetre associ ´ee `a d’autres effets physiques pour l’isolation de cellules rares61. Parmi les dispositifs et m ´ethodes cit ´es, deux sont ici pr ´esent ´es `a titre illustratif. van Reenen et al.52 quantifient et comparent les taux de r ´eaction de la capture de cibles `a base de particules avec diff ´erents types d’actionnement, `a savoir (i) le transport thermique passif, (ii) l’agitation des fluides par m ´elange vortex et (iii) les particules en rotation active, les deux derni `eres ´etant effectu ´ees `a l’aide d’un actionnement magn ´etique.

Hu et al. pr ´esentent des robots magn ´eto- ´elastiques `a l’ ´echelle millim ´etrique qui peuvent nager `a l’int ´erieur et `a la surface des liquides, escalader des m ´enisques de liquides, rouler et marcher sur des surfaces solides, sauter par-dessus des obstacles et ramper dans des tunnels ´etroits (voir Figure 1.10). Ces robots peuvent transiter de mani `ere r ´eversible entre diff ´erents terrains liquides et solides et basculer entre les modes de locomotion. Ils peuvent en outre ex ´ecuter des t ˆaches de pick-and-place .

L’actionnement magn ´etique permet une manipulation `a haute cadence d’objets dans des espaces restreints, mais autorise ´egalement des mouvement complexes d’objets, certains auteurs allant jusqu’ `a proposer le d ´eplacement et la d ´eformation d’objets compliants. Cette m ´ethode d’action-nement n’est toutefois `a ce jour que rarement miniaturis ´ee, et est restreinte `a des objets de type paramagn ´etique, propri ´et ´e que ne poss `edent pas les mat ´eriaux biologiques conventionnels. La manipulation directe d’objets biologiques est donc impossible.

1.3.1.4/ La force d’acoustophor `ese

FIGURE1.11 Sch ´ema de principe illustrant la manipulation acoustophor ´etique de gouttelettes par onde

stationnaire ultrasonique62.

Principe L’acoustophor `ese est une m ´ethode d’actionnement utilisant la pression de radiation `a partir d’ondes sonores intenses. Cela est possible en raison des effets de non lin ´earit ´e des ondes sonores, comme pr ´esent ´e Figure 1.11. En acoustophor `ese, une onde sonore induit une diff ´erence de vitesse p ´eriodique entre le milieu continu et les particules en suspension, `a condition que leur densit ´e respective ne soit pas identique. Les syst `emes de s ´eparation et de pi ´egeage acoustiques ont pour avantage de proposer un mode de fonctionnement continu, une utilisation relativement facile et sans risque de d ´egradation des ´echantillons biologiques.

FIGURE1.12 Illustration d’une suspension de particules passant sur un transducteur o `u les particules sont

d ´eplac ´ees vers le centre du canal de s ´eparation `a une vitesse d ´etermin ´ee par leurs propri ´et ´es acoustiques63.

Applications Les forces acoustiques ont ´et ´e largement utilis ´ees pour s ´eparer les particules en suspension de taille microm ´etrique, de leur milieu ou d’autres particules, ainsi que pour pi ´eger des particules. La s ´eparation peut notamment se faire par densit ´e64, taille63,65 ou encore compressi-bilit ´e66. La m ´ethode peut ´egalement ˆetre utilis ´ee `a l’ ´echelle mol ´eculaire pour des applications de chromatographie67.

Afin d’illustrer le contexte applicatif, des travaux de Peterson63 sont pr ´esent ´es Figure 1.12. Ces travaux pr ´esentent une m ´ethode capable de s ´eparer en continu des suspensions de particules

m ´elang ´ees en plusieurs fractions `a la sortie. Les forces acoustiques sont utilis ´ees pour s ´eparer les particules en fonction de leur taille et de leur densit ´e. Il a ´et ´e d ´emontr ´e que la m ´ethode convient aux particules en suspension biologiques et non biologiques. La manipulation du milieu, en combi-naison avec les acides gras libres, a ´egalement ´et ´e utilis ´ee pour permettre le fractionnement des globules rouges, des plaquettes et des leucocytes. Les r ´esultats montrent que l’acoustophor `ese `a ´ecoulement libre peut ˆetre utilis ´ee pour effectuer des t ˆaches complexes de s ´eparation.

L’acoustophor `ese est donc une force dont la mise en oeuvre est simple, et permettant un tri effi-cace d’objets selon diff ´erents crit `eres. Les forces appliqu ´ees sont toutefois monodirectionnelles et relativement faibles, ce qui limite la dynamique.

1.3.1.5/ La force de di ´electrophor `ese

Principe La force de di ´electrophor `ese (DEP) fait r ´ef ´erence au mouvement d’une particule polari-sable (ou d’une cellule) dans un liquide, soumise `a champ ´electrique non uniforme. La force de DEP est couramment utilis ´ee dans les LOCs. En effet, sa simplicit ´e de mise en oeuvre est attrayante puisque les champs ´electriques sont g ´en ´er ´es `a l’aide d’ ´electrodes m ´etalliques aliment ´ees par un g ´en ´erateur de tension alternative. Elles sont donc facilement int ´egrables aux LOCs. D’autre part, les ´echantillons biologiques sont polarisables, il est donc possible de leur appliquer une force de DEP. Cette force peut ˆetre utilis ´ee pour le guidage des ´echantillons dans un canal, ou encore pour le tri, puisque l’amplitude de la force exerc ´ee va d ´ependre de certains param `etres physiques des ´echantillons, comme leur taille et leurs propri ´et ´es ´electriques notamment.

FIGURE1.13 Principe de l’actionnement par DEP68. Lorsqu’une particule polarisable est soumise `a un champ ´electrique, un dip ˆole se cr ´ee. Si de plus ce champ est non uniforme, des forces d’amplitudes diff ´erentes sont exerc ´ees sur le dip ˆole, r ´esultant en une force non nulle.

Une particule soumise `a un champ ´electrique se polarise. Bien que globalement ´electriquement neutre, des dip ˆoles sont cr ´e ´es `a la surface de la particule. Si le champ ´electrique appliqu ´e est non-uniforme, c’est `a dire qu’il varie en amplitude dans la r ´egion occup ´ee par le dip ˆole, alors les forces de Coulomb cr ´e ´ees sur les deux c ˆot ´es de la particule sont diff ´erentes, ce qui donne une force r ´esultante non nulle, comme illustr ´e Figure 1.13. Ce ph ´enom `ene est `a l’origine de la force de di ´electrophor `ese.

Applications Les applications de la di ´electrophor `ese sont : le guidage, la s ´eparation, le pi ´egeage et le contr ˆole actif.

(a) Tri69 (b) Guidage70

(c) Pi ´egeage71 _{(d) Contr ˆole actif}72

FIGURE1.14 Visuels de dispositifs LOCs exploitant la force de DEP `a diff ´erentes fins : (a) Tri : La DEP

permet un tri par taille de particules.(b) Guidage : la DEP est ici utilis ´ee pour centrer des objets dans la

section d’un microcanal et maˆıtriser leur orientation.(c) Pi ´egeage : la DEP maintient la particule au centre

du cercle.(d) Contr ˆole actif : associ ´ee `a un retour de position par vision, la trajectoire d’une particule

actionn ´ee par DEP est maˆıtris ´ee.

Figure 1.14a69, la force de DEP est utilis ´ee en vue de trier des ´echantillons biologiques. La force de DEP exerc ´ee ´etant d ´ependante de la taille des cellules, les ´electrodes permettent d’exercer sur les ´echantillons un d ´eplacement lat ´eral dont l’amplitude varie en fonction de leur taille. Plusieurs sorties plac ´ees en aval permettent de r ´ecup ´erer les cellules ainsi tri ´ees.

Un exemple de guidage de particules dans un microcanal est le concept d’ ´electrodes dites 

li-quides_{, d ´evelopp ´e par Demierre et al}73_{donn ´e Figure 1.14b}70_{. Les ´electrodes liquides sont des}

´electrodes planaires fabriqu ´ees sur le fond de chambres situ ´ees `a l’extr ´emit ´e du c ˆot ´e du canal principal. La couche d’isolant (la r ´esine utilis ´ee pour former le canal) guide les lignes de champ dans le liquide s’ ´ecoulant dans le canal principal et d ´etermine la distribution du champ ´electrique `a l’int ´erieur de la microstructure. Un potentiel en opposition de phase appliqu ´e sur les ´electrodes en opposition permet d’une part le guidage des cellules : celles-ci sont guid ´ees vers le centre du canal, c’est `a dire l `a o `u le potentiel est le plus faible. La position verticale des cellules peut ´egalement ˆetre contr ˆol ´ee en jouant sur l’amplitude du signal d’excitation. Enfin, dans le cas d’ob-jets non sph ´eriques, l’orientation peut ´egalement ˆetre maˆıtris ´ee.

permet d’obtenir un puits de champ ´electrique dont le centre est le centre des cercles form ´es par les ´electrodes. Ainsi, une force dirig ´ee vers le centre du cercle est appliqu ´ee sur la particule. L’am-plitude de la force d ´ecroˆıt lorsque l’on se rapproche du centre du cercle.

La Figure 1.14d donne un exemple de contr ˆole actif d’une particule sph ´erique exploitant un action-nement par DEP72. Le fait de jouer sur le potentiel de 4 ´electrodes distinctes permet d’exercer une force dont il est possible de maˆıtriser avec une bonne pr ´ecision l’amplitude et l’orientation dans le plan. La position est corrig ´ee `a l’aide d’une loi de commande en boucle ferm ´ee.

Enfin, la manipulation contr ˆol ´ee est ´egalement utilis ´ee dans le dispositif industrialis ´e DEPArray, qui permet de contr ˆoler, manipuler et collecter des cellules. Une cartouche microfluidique `a usage unique contient un ensemble d’ ´electrodes individuellement contr ˆolables, chacune avec des cap-teurs int ´egr ´es. Ce circuit permet la cr ´eation de cages di ´electrophor ´etiques autour des cellules. Apr `es imagerie, les cellules individuelles d’int ´er ˆet sont d ´eplac ´ees vers une chambre pour l’iso-lement et la r ´ecup ´eration. Ce type de technologie permet d’isoler des cellules rares avec une s ´electivit ´e importante. La cadence du tri est toutefois limit ´ee.

Sur le plan de la fabrication, les ´electrodes peuvent ˆetre r ´ealis ´ees `a l’aide de techniques de salle blanche, telles que la photolithographie, le d ´ep ˆot de couches minces, la gravure, la galvanoplastie ou la lithographie douce. La m ´ethode de fabrication retenue d ´epend du type d’ ´electrode souhait ´ees, et a fortiori du type d’application. Le mat ´eriau retenu quant `a lui d ´epend des caract ´eristiques sou-hait ´ees. On peut citer l’or pour sa bonne conductivit ´e ´electrique, le platine pour sa tenue aux fortes tensions, ou encore l’ITO pour sa transparence.

L’utilisation de la force de DEP est tr `es r ´epandue dans les LOCs. Celle-ci permet le tri d’objets selon plusieurs param `etres physiques, autorise de hautes cadences, et est multidirectionnelle. Des proc ´ed ´es de fabrication `a des co ˆuts peu ´elev ´es ont ´et ´e propos ´es. Certaines limitations sont ´egalement inh ´erentes aux techniques exploitant la DEP. Notamment, la force diminue rapidement lorsque l’on s’ ´eloigne des ´electrodes, les ´electrodes peuvent g ˆener la visualisation de la zone, se d ´ecoller sous l’effet de fortes tensions, ou encore provoquer un ´echauffement du milieu.

1.3.1.6/ Comparatif des diff ´erentes m ´ethodes d’actionnement

R ´ecapitulatif des caract ´eristiques des principales m ´ethodes d’actionnement

Fluidique DEP Magn ´etique Acoustique Optique

Propri ´et ´e d’objet - Di ´electrique Magn ´etique - Transparent Taille d’objet 1-100

µ

m 1-100

µ

m 1-1000

µ

m 1-100

µ

m 1-10

µ

m Champ d’action Important Faible Important Important Important

Gamme des

forces exerc ´ees Importante Faible Importante Importante Tr `es faible

Degr ´es de libert ´e 1D 2.5D 3D 1D 3D

TABLE1.1 Principales caract ´eristiques des actionneurs dans les LOCs.

Les diff ´erentes m ´ethodes d’actionnement cit ´ees ci-dessus pr ´esentent chacune leurs sp ´ecificit ´es. L’amplitude et l’orientation des forces mises en jeu, la plage d’action et la simplicit ´e de mise en œuvre sont les principaux crit `eres permettant d’orienter le choix d’une m ´ethode d’actionnement en fonction du contexte applicatif. Ces crit `eres, d ´ecrits pour les principales m ´ethodes d’actionnement dans les sections pr ´ec ´edentes, sont r ´esum ´es dans le Tableau 1.1.

L’amplitude des forces appliqu ´ees ´etant d ´ependante de nombreux param `etres tels que les dimen-sions de l’objet ou son positionnement par rapport `a l’actionneur, l’amplitude des forces appliqu ´ees est tr `es variable. On se contentera ici de donner des ordres de grandeur.

1.3.2/

D ´etection

Diff ´erentes m ´ethodes d’actionnement dans les LOCs ont ´et ´e d ´ecrites pr ´ec ´edemment. Toutefois, dans le cadre du contr ˆole en boucle ferm ´ee notamment, une partie perception doit ´egalement ˆetre pr ´esente.

La vision est actuellement de la seule m ´ethode permettant une mesure continue et temps-r ´eel de la position de particules dans les LOCs. Le mouvement des particules est g ´en ´eralement projet ´e sur un plan d ´efini par le foyer de l’objectif. Pour de nombreuses applications (par exemple mi-crom ´elangeurs ou dispositifs de focalisation de particules), la visualisation du mouvement dans la troisi `eme dimension est n ´ecessaire pour comprendre pleinement la trajectoire des particules74. A cet effet, des approches multi-cam ´eras (par exemple imagerie st ´er ´eoscopique, imagerie tomogra-phique) et monocam ´eras (par exemple microscopie confocale, imagerie anamorphique / astigma-tique, microscopie holographique num ´erique, d ´econvolution et d ´efocalisation) ont ´et ´e propos ´ees. Pour une description et analyse, il est possible de se r ´ef ´erer `a diff ´erentes revues75–77.

A titre d’exemple, Kharboutly72 dans ses travaux pr ´ec ´edemment cit ´es pr ´esente le contr ˆole en boucle ferm ´ee de sph `eres de rayon de l’ordre de quelques dizaines de microm `etres. L’actionne-ment se fait par DEP `a l’aide de 4 ´electrodes plac ´ees en cercle autour de la zone de contr ˆole, et d’une cam ´era rapide (1000 images par seconde) munie d’un objectif. La rapidit ´e de la cam ´era as-soci ´ee `a une d ´etection par r ´egion d’int ´er ˆet (ROI) contribuent `a l’efficacit ´e de la d ´etection et donc de la boucle ferm ´ee. Jiang et al.78pr ´esentent des travaux similaires dans lesquels la di ´electrophor `ese est utilis ´ee afin de mettre en rotation des sph `eres, associ ´ee ici ´egalement `a un retour par vision pour le contr ˆole en boucle ferm ´ee.

Les r ´esultats de ces travaux montrent que les capteurs bas ´es sur la vision offrent une solution int ´eressante pour le contr ˆole, permettant de d ´etecter la position lin ´eaire et angulaire avec pr ´ecision, avec une cadence pouvant ˆetre sup ´erieure `a 1000 Hz. Cependant, avec un fort grossissement le champ de vision est r ´eduit par rapport `a la taille de l’objectif optique. En raison du rapport ´enorme entre la plage de vision et la taille de l’objectif, seules quelques parties de la surface de la puce sont visibles simultan ´ement avec la cam ´era. En utilisant des cam ´eras, la densit ´e des zones de test sur la puce est donc fortement limit ´ee par la taille de l’objectif optique.

1.4/

Conclusion

Dans ce chapitre d’introduction, le besoin dans le domaine du tri cellulaire a ´et ´e mis en ´evidence. Les trieurs conventionnels, ainsi qu’une technologie r ´ecente de dispositifs portables dit LOCs, sont `a l’origine de nombreux d ´eveloppements dans ce domaine, permettant de trier et caract ´eriser des ´echantillons biologiques selon un grand nombre de crit `eres comme la forme, la taille, les propri ´et ´es ´electriques... Toutefois, ces trieurs manquent encore de s ´electivit ´e, en particulier pour le d ´eveloppement de l’immunoth ´erapie. La mise en place de m ´ethodes de tri cellule par cellule dans des laboratoires sur puces est une voie pour permettre d’am ´eliorer la s ´electivit ´e du tri. Elle n ´ecessite toutefois d’effectuer le tri `a haute vitesse afin de traiter des ´echantillons de cellules de taille raisonnable (typiquement quelques millions de cellules). La mise en place de trieur rapide n ´ecessite l’utilisation de m ´ethode de contr ˆole de trajectoire de ces cellules bas ´ees sur une

com-mande en boucle ferm ´ee. Nous proposons de mesurer la position de la cellule dans le trieur en exploitant les principes de l’imp ´edancem ´etrie.

Le chapitre suivant d’ ´etat de l’art s’attache donc `a ´evaluer les potentialit ´es des mesures d’imp ´edance, g ´en ´eralement utilis ´ees pour la caract ´erisation des cellules, comme technique de d ´etection de position.

Imp ´edancem ´etrie : ´etat de l’art sur

l’observation de position

Dans le chapitre pr ´ec ´edent, l’int ´er ˆet d’int ´egrer un capteur de position de micro-particules direc-tement dans les puces de tri cellulaire a ´et ´e mis en ´evidence. L’id ´ee est d’exploiter les champs ´electriques, largement utilis ´es pour l’actionnement, notamment par les techniques impliquant la di ´electrophor `ese, afin de r ´ealiser une mesure de position. A cette fin, la mesure d’imp ´edance semble prometteuse. Dans ce chapitre, diff ´erentes th ´ematiques pr ´esentant un int ´er ˆet pour la mise en oeuvre de la d ´etection par imp ´edancem ´etrie seront d ´ecrites.

2.1/

G ´en ´eralit ´es sur la mesure d’imp ´edance

Une imp ´edance est une grandeur complexe servant `a caract ´eriser l’opposition d’un syst `eme `a l’application d’une grandeur physique. Pour le cas particulier o `u cette grandeur est une grandeur ´electrique, l’imp ´edance repr ´esente le ratio entre la diff ´erence de potentiel appliqu ´ee aux bornes du syst `eme et le courant :

Z

=

U

I

(2.1)

o `u Z , U et I repr ´esentent respectivement l’imp ´edance, la tension et le courant sous leur forme com-plexe. La partie r ´eelle de Z est appel ´ee r ´esistance et sa partie imaginaire r ´eactance. La r ´esistance caract ´erise l’opposition du syst `eme au passage d’un courant continu. La r ´eactance caract ´erise quant `a elle le d ´ephasage induit par le passage du courant dans le syst `eme. Lorsque les ca-ract ´eristiques du milieu varient, par exemple par l’ajout d’une cellule dans le milieu, l’imp ´edance est modifi ´ee. Cette variation d’imp ´edance est li ´ee non seulement aux diff ´erences de propri ´et ´es entre l’objet introduit dans le milieu et le milieu lui-m ˆeme, mais ´egalement `a sa position par rapport au capteur utilis ´e.

L’objectif de ces travaux de th `ese est d’utiliser ces informations, et notamment cette grandeur qu’est l’imp ´edance afin de fournir une mesure de position d’une cellule dans un canal micro-fluidique. La mesure de position est indirecte, il s’agit d’un probl `eme d’observation d’ ´etat. Il faut donc combiner les connaissances de trois domaines : observation d’ ´etat, imp ´edancem ´etrie et mod ´elisation physique du syst `eme, afin d’obtenir le capteur souhait ´e. En vue de cet objectif, trois

grandes th ´ematiques seront abord ´ees, comme illustr ´e Figure 2.1 pour fournir les outils de r ´esolution n ´ecessaires : EIS EIT Mesure d’impédance Capteur de position cellulaire

EIS : Electrical Impedance Spectroscopy EIT : Electrical Impedance

Tomography

FIGURE2.1 Diagramme de Venn illustrant le recoupement des 3 grandes th ´ematiques de l’ ´etude.

— La mod ´elisation physique du syst `eme coupl ´ee `a la mesure d’imp ´edance

La spectroscopie d’imp ´edance ´electrique est une technique permettant de caract ´eriser une cellule en fonction de sa r ´eponse `a l’application d’une tension ´electrique, `a diff ´erentes fr ´equences d’excitation.

— L’observation d’ ´etat coupl ´ee `a la mesure d’imp ´edance

La tomographie d’imp ´edance ´electrique est une technique utilis ´ee `a l’ ´echelle macroscopique afin de donner une cartographie de la r ´esistivit ´e d’un milieu. Le probl `eme d’observation d’ ´etat associ ´e `a des mesures d’imp ´edance y est ´etudi ´e.

— L’observation d’ ´etat

Diff ´erents outils de ce domaine seront pr ´esent ´es afin d’apporter de la connaissance sur le type de probl `eme qu’il faudra r ´esoudre, et d’en maˆıtriser les outils de r ´esolution.

La suite pr ´esente un ´etat de l’art de ces diff ´erents domaines.

2.2/

La spectroscopie d’imp ´edance ´electrique

La spectroscopie d’imp ´edance ´electrique est une technique dont le principe est d’appliquer une tension alternative aux bornes d’ ´electrodes, et de mesurer le courant r ´esultant. Il est ainsi possible de connaˆıtre l’imp ´edance du milieu d’ ´etude pour la fr ´equence d’excitation utilis ´ee. Un balayage fr ´equentiel ou un multiplexage de diff ´erentes fr ´equences permet de connaˆıtre cette imp ´edance `a diff ´erentes fr ´equences. Il est alors possible de caract ´eriser le milieu ´etudi ´e. Lorsqu’un objet dont les propri ´et ´es ´electriques diff `erent de celui du milieu liquide de transport est situ ´e entre les ´electrodes utilis ´ees pour la mesure, le champ ´electrique s’en trouve modifi ´e. Pour le cas particulier de la caract ´erisation cellulaire, certaines hypoth `eses peuvent ˆetre faites, notamment sur la g ´eom ´etrie sph ´erique des cellules, permettant d’en donner un mod `ele dont plusieurs param `etres sont `a iden-tifier. La mesure de la variation du champ ´electrique, associ ´ee `a ce mod `ele, permet d’identifier ces param `etres et ainsi de caract ´eriser la cellule.

Seront ´evoqu ´es dans cette section le principe g ´en ´eral de la spectroscopie d’imp ´edance ´electrique, son cadre applicatif ainsi que les cas ´etudi ´es dans la litt ´erature de sensibilit ´e au positionnement d’une particule dans ce domaine. L’objectif est ici de mettre en ´evidence le comportement ´electrique d’une particule dans un milieu ´electrolytique microfluidique afin d’en d ´eduire des informations pourl’ ´elaboration d’un capteur de position. Diff ´erents articles d ´ecrivent dans le d ´etail ces diff ´erents points79–81. La section suivante en pr ´esente l’essentiel.

2.2.1/

Repr ´esentation classique d’une cellule en spectroscopie d’imp ´edance

Le mod `ele le plus couramment utilis ´e pour repr ´esenter le comportement ´electrique d’une cellule est celui d ´evelopp ´e par Hywel Morgan82. Une cellule y est mod ´elis ´ee comme un syst `eme compos ´e d’un cytoplasme sph ´erique et majoritairement r ´esistif, entour ´e d’une fine membrane de quelques nanom `etres d’ ´epaisseur, majoritairement capacitive. La Figure 2.2 donne une repr ´esentation de ce mod `ele. Electrode Electrode

U

I

Milieu électrolytique R_m C_m RDL CDL RI Rmem Cmem Membrane Cytoplasme (σmem, εmem) (σ_i, ε_i) R d (σm, εm) Milieu électrolytique RDL CDL

FIGURE2.2 Repr ´esentation d’une cellule pour la mod ´elisation de son comportement ´electrique. Le

cytoplasme, majoritairement r ´esistif, est entour ´e d’une fine membrane aux propri ´et ´es capacitives. Le syst `eme compos ´e d’une cellule, du milieu fluide et des ´electrodes de mesure peut alors ˆetre repr ´esent ´e comme un circuit ´electrique comprenant divers condensateurs et r ´esistors.

Ce mod `ele se base sur l’approximation de Maxwell83et le mod `ele de Fricke84. En nommant la per-mittivit ´e relative et la conductivit ´e ´electriques respectivement du milieu ´electrolytique, de la mem-brane et du cytoplasme

(ε

m

, σ

m

)

,

(ε

mem

, σ

mem

)

et

(ε

i

, σ

i

)

, le rayon du cytoplasme

R

et l’ ´epaisseur

de la membrane

d

, la formulation analytique de la valeur de chaque composant ´equivalent est donn ´ee ci-dessous :

R

m

=

1

σ

m

(1 − 3φ/2)lκ

C

m

= ε

∞

κl

Capacit ´e du milieu liquide

,

(2.3)

C

mem

=

9φRC

mem,0

4

κl

Capacit ´e de la membrane

,

(2.4)

R

i

=

4(

_2σ1 m

+

1 σi

)

9φlκ

R ´esistance du cytoplasme

,

(2.5)

C

mem,0

= ε

mem

/d

Capacitance par unit ´e de surface de la membrane

,

(2.6)

ε

∞

=

2ε

m

+ ε

i

− 2φ(ε

m

− ε

i

)

2ε

m

+ ε

i

+ φ(ε

m

− ε

i

)

Permittivit ´e du syst `eme `a fr ´equence infinie

,

(2.7)

o `u

φ

repr ´esente le ratio entre le volume de la particule et celui de la zone de d ´etection,

l

la longueur des ´electrodes et

κ

une constante d ´ependante des dimensions du syst `eme et de la g ´eom ´etrie des

´electrodes.

L’imp ´edance d’une cellule immerg ´ee d ´epend de la fr ´equence du signal d’excitation, comme pr ´esent ´e sur le diagramme Figure 2.3. Le diagramme pr ´esente d’une part la tension mesurable par un appareil de mesure. Cette tension est repr ´esentative du courant traversant le syst `eme, et donc de son admittance (inverse de l’imp ´edance)1. D’autre part, l’axe vertical de droite pr ´esente la phase, c’est- `a-dire le d ´ecalage dans le temps du passage `a z ´ero des signaux, induit dans le cas pr ´esent par des effets capacitifs. A basse fr ´equence, une cellule sera isolante. Sa membrane sera ´equivalente `a une capacit ´e qui va emp ˆecher les lignes de champ ´electrique de p ´en ´etrer la cellule. Il sera possible d’obtenir des information sur sa taille et sa forme. A haute fr ´equence, la capacit ´e de la membrane est court-circuit ´ee. On peut alors en d ´eduire des propri ´et ´es internes telle que la r ´esistance du cytoplasme.

FIGURE2.3 Spectre de l’imp ´edance d’un ´echantillon biologique avec les zones de dispersion85.

Une fr ´equence minimale du signal d’excitation doit cependant ˆetre utilis ´ee, en raison d’un ph ´enom `ene nomm ´e effet double couche. L’effet double couche apparaˆıt pour de mesures

´electriques lorsque les ´electrodes sont immerg ´ees en milieu liquide, la surface se chargeant `a cause de la dissociation des mol ´ecules de surface. L’effet double couche peut ˆetre mod ´elis ´e par