Effets des acides gras oméga-3 à longue chaîne et de la biotine sur le métabolisme des acides gras et de l'insuline, les performances de reproduction, la qualité et la conservation de la semence de verrat

EFFETS DES ACIDES GRAS OMEGA-3 A LONGUE

CHAÎNE ET DE LA BIOTINE SUR LE

MÉTABOLISME DES ACIDES GRAS ET DE

L'INSULINE, LES PERFORMANCES DE

REPRODUCTION, LA QUALITÉ ET LA

CONSERVATION DE LA SEMENCE DE VERRAT

Thèse présentée

à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval dans le cadre du programme de doctorat en sciences animales

pour l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)

DEPARTEMENT DE SCIENCES ANIMALES

FACULTÉS DE SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION UNIVERSITÉ LAVAL

QUÉBEC

2010

Résumé

Le présent travail avait pour but principal de déterminer si l'enrichissement de la l'alimentation avec des acides gras oméga-3 (AGPI n-3), présents en quantités importantes dans les huiles de poisson, modifie le profil lipidique du sang et des spermatozoïdes tout en améliorant les performances de production des verrats, la qualité du sperme et ses propriétés de conservation; ces effets dépendraient aussi du statut en biotine, une vitamine impliquée dans l'élongation des acides gras. Un autre aspect de ce travail a été d'établir si un apport important d'acides gras n-3 pendant une longue période pouvait modifier le métabolisme post-prandial de l'insuline. Au cours d'une première expérience, 64 verrats ont reçu pendant 28 semaines une alimentation de base supplémentée avec l'un des 4 traitements suivants: 1) 62 g de gras animal hydrogéné (AF); 2) 60 g d'huile de menhaden (MO); 3) 60 g d'huile de thon (TO); 4) 60 g d'huile de menhaden et 2 ppm de biotine (MO+B). Outre les données quantitatives et qualitatives, des échantillons de sang et de semence ont été récoltés afin d'évaluer la composition en acides gras et en certaines vitamines. Une seconde expérience visait à évaluer, dans des conditions dites « commerciales », les performances de production de 222 verrats recevant pendant six mois l'un des traitements alimentaires suivants : AF, MO ou TO. À l'issue de ces expériences, une évaluation de la qualité de la semence, après conservation à 17°C pendant plusieurs jours et congélation en paillettes de 0,5 ml, a été effectuée, ainsi qu'un test oral de tolérance

au glucose. L'ajout d'huiles de poisson à la ration alimentaire des animaux a modifié efficacement la composition en acides gras du plasma sanguin et des spermatozoïdes, ceci indépendamment du type d'huile de poisson utilisée (MO ou TO) ou du statut en biotine. En revanche, cet apport alimentaire en AGPI n-3 n'a donné aucun effet sur la libido, les caractéristiques quantitatives ou qualitatives de l'éjaculat, la résistance des spermatozoïdes à la conservation ou le métabolisme de l'insuline.

Abstract

The aim of the present work was to determine if a dietary supplementation of fish oils (rich in long chain omega-3 fatty acids, n-3 PUFA) alters the profile of fatty acids in blood plasma and spermatozoa and improves reproductive performances of boar, semen quality and its properties for conservation. Those effects are dependent upon biotin status, this vitamin being a critical factor in the elongation of long-chain fatty acids. Another aspect of this smdy was to evaluate the influence of n-3 PUFA on post-prandial insulin metabolism. For Experiment 1, 64 boars were fed a basal diet at 2.5 kg/day top dressed with 0.3 kg/day of one of the following treatment mixtures: 1) 62 g of hydrogenated animal fat (AF); 2) 60 g of menhaden oil (MO); 60 g of tuna oil (TO); 4) 60 g of menhaden oil and with 2 ppm of biotin (MO+B). All diets were isoenergetics. For this experiment, semen production and quality were measured. Blood and spermatozoa samples were also collected to measure composition of fatty acid and of some vitamins. In Experiment 2, 222 animals raised in "commercial conditions" were fed one of the 3 treatments (AF, MO or TO) during six months. Furthermore, an evaluation of sperm quality during storage at 17°C and cryopreservation was also performed. The addition of fish oils to boar diet had an effect on the composition of fatty acid in blood plasma and sperm. This effect was affected by the fish oil type (MO or TO) and the biotin status (MO or MO+B). Dietary supplementation with n-3 PUFA did not have any effect on sexual behaviour, quantitative and qualitative characteristics of the boar semen, and sperm capacity to conservation as well as insulin secretion/sensitivity.

Avant-propos

Mes plus sincères remerciements sont adressés tout d'abord à messieurs Jean-Paul Laforest et Jacques Matte, mes deux directeurs de recherche, qui se sont toujours montrés à l'écoute et très disponibles tout au long de ces années de doctorat, ainsi que pour l'inspiration, l'aide et le temps qu'ils ont chacun bien voulu me consacrer et sans lesquels cette thèse n'aurait jamais pu être réalisée. Leur grande culture scientifique et leur passion pour la recherche ont été pour moi très motivantes et formatrices.

Je tiens à remercier sincèrement les membres du jury de cette thèse :

Monsieur le vice-doyen Guy Allard qui m'a fait l'honneur de présider ce jury,

Madame Elisabeth Blesbois (INRA) ainsi que Messieurs Jean-Paul Laforest (Université Laval), Jacques Matte (Agriculture Canada), Yvan Chouinard (Université Laval) et Frédéric Guay (Université Laval) qui ont accepté de participer à ce jury,

Je leur suis très reconnaissant pour le temps et l'énergie consacrés à l'évaluation de ce travail ; leurs commentaires pertinents ont grandement amélioré la qualité de la présente thèse.

Mes remerciements s'adressent également à tous les co-auteurs impliqués dans la réalisation de cette thèse :

À Isabelle Audet, dont l'expertise, le sérieux et la profonde gentillesse m'ont beaucoup apporté. Je suis heureux d'avoir eu l'opportunité de collaborer avec elle à ce travail,

À Janice Bailey et Yvan Chouinard, pour le temps consacré et pour leurs nombreuses suggestions.

Mes remerciements vont à l'Université Laval ainsi qu'à l'ensemble des organismes et entreprises impliqués dans ce projet : Agriculture et Agroalimentaire Canada, le Centre d'insémination porcine du Québec, la Coop Fédérée, Oméga Protein Inc. et Bluecina Inc. Je remercie Janice Bailey pour son accueil dans son laboratoire et tout particulièrement Christian Lessard pour son aide précieuse dans la mise en place et la réalisation du volet congélation de mon projet. Je tiens également à remercier tout le personnel travaillant au CIPQ de St Lambert et de Roxton Falls pour avoir permis l'accomplissement de ce projet.

du porc du Québec pour son soutien financier qui m'a permis de poursuivre en toute sérénité mon doctorat.

Je voudrais exprimer mes remerciements à l'ensemble du personnel scientifique, technique et administratif travaillant au centre de R&D sur le bovin laitier et le porc de Lennoxville (Agriculture et Agroalimentaire Canada) pour leur accueil chaleureux et les bons moments passés ensemble. En particulier, aux personnes du laboratoire 218, je tiens à exprimer le plaisir que j'ai eu à travailler avec elles. Merci à Michelle Guillette pour ses conseils techniques, ses talents culinaires et sa bonne humeur ainsi qu'à Antoine Grannec et Marie-Edith Coté-Robitaille pour avoir pris une part active à ce projet. Merci également à Aurélie Preynat et Déborat Santschi pour les bons moments passés ensemble. À tout le personnel de la porcherie, Edouard Bérubé, Charles Boudreau, Joël Boudreau, France Champagne, Justin Marois, Claude Mayrand, Dominique Morissette, Cassandra Perreault, Julie Phaneuf et Mélanie Turcotte un grand merci pour votre sérieux et pour avoir su créer une ambiance de travail chaleureuse et bon enfant. À l'ensemble du personnel de recherche, étudiants, stagiaires post-doctoraux et stagiaires, parmi lesquels Frédéric Beaudoin, Bertrand Cressier, Philippe Bernier-Daudier, Karoline Lauzon, Séverine Oilier, Céline Ster et Guillaume Tremblay, merci pour votre entrain et votre amitié. Et à la fine équipe du Club Social parmi lesquels Luis Balboceda, Cristano Cortes, Mario Dion, Alain Dubreuil, Fadi Hassanah et Jean-Nicola Silvestro, merci pour cette dernière année.

Dans une vie, avoir de véritables amis est quelque chose de rare et précieux. Je voudrais donc remercier chaleureusement Manu, Cécile, Cyril, Laetitia, Claire, Alex, Pat et Vincent pour leur amitié sincère et authentique. J'ai une pensée tendre pour mon ami Sébastien.

J'aimerais souligner l'importance de ma famille, mes grands-parents, mes parents et mes sœurs. Je les remercie pour l'appui moral qu'ils m'ont donné tout au long de ces années. Je tiens à profondément remercier mon père et ma mère, pour leur soutien total et indéfectible ainsi que pour leur encouragement. Chaque jour je mesure la chance que j'ai de les avoir comme parents. Enfin, je dédie cette thèse à ma moitié Nancy. Je la remercie pour sa patience, sa compréhension, ses belles attentions, ses conseils, sa sincérité et son sourire. Chaque moments de ma vie sont rendus plus doux à ses côtés.

« Si on commence avec des certitudes, on finit avec des doutes. Si on commence avec

des doutes, on finit avec des certitudes ». Bacon, 1605

Table des matières

Résumé ii

Avant-propos iv

Table des matières vii

Liste des tableaux xiii

Liste des figures xvi

Liste des abréviations anglaises et françaises xvii

CHAPITRE I INTRODUCTION :1

CHAPITRE II REVUE DES TRAVAUX ANTÉRIEURS 4

2.1 La reproduction chez le verrat 5 2.1.1 L'appareil génital mâle 5 2.1.2 La spermatogenèse 14 2.1.3 Acquisition du pouvoir fécondant 17

2.1.4 La semence de porc 18 2.2 Les acides gras et la semence 24

2.2.1 Définitions 24 2.2.2 Nomenclature 27 2.2.3 Les acides gras essentiels 31

2.2.4 Le métabolisme des AGPI n-3 et n-6 32 2.2.5 Les différents rôles des acides gras dans la semence 35

2.3 La qualité de la semence 49 2.3.1 Facteurs influençant la production et la qualité spermatique 49

2.3.2 Évaluation de la qualité 52 2.4 La conservation de la semence 58

2.4.1 Conservation de la semence fraîche 58 2.4.2 Conservation de la semence congelée 59 2.4.3 Facteurs affectant la conservation de la semence 60

2.5 L'insuline et les acides gras 68

2.5.1 Définitions 68 2.5.2 Rôles des acides gras oméga-3 70

2.6 Hypothèses et objectifs 71 CHAPITRE III PRÉSENTATION DU TRAVAIL EXPÉRIMENTAL 72

3.1 Justification du choix expérimental 73 3.2 Expérience 1 : Étude des aspects métaboliques 74

3.2.1 Animaux 74 3.2.2 Alimentation 74 3.2.3 Protocole expérimental 77

3.2.4 Paramètres mesurés 77 3.2.5 Problèmes rencontrés au cours de l'étude au centre de R&D 81

3.3 Expérience 2 : Étude en conditions commerciales 82

3.3.1 Protocole expérimental 82 3.3.2 Paramètres mesurés 82 3.3.3 Problèmes rencontrés au cours de l'étude en conditions commerciales 83

CHAPITRE IV EFFETS D'UN APPORT ALIMENTAIRE EN ACIDES GRAS OMÉGA-3 SUR LES PERFORMANCES DE REPRODUCTION ET LA QUALITÉ DE

LA SEMENCE DE VERRAT 84

4.1 Résumé 85 4.2 Abstract 86 4.3 Introduction 87 4.4 Material and Methods 88

4.4.1 Experiment 1 - Metabolic aspects and semen quality 88 4.4.2 Experiment 2 - Semen production in commercial conditions 91

4.4.3 Statistical analyses 91

4.5 Results 92 4.5.1 Experiment 1- Metabolic aspects and semen quality 92

4.5.2 Experiment 2 - Semen production in commercial conditions 94

4.6 Discussion 95 4.6.1 Fatty acids profile 95

4.6.2 Boar libido 96 4.6.3 Semen production 97 4.6.4 Semen quality 97 4.6.5 Antioxidant sperm activity 98

4.7 Conclusion 99 4.8 Aknowledgements 99

OMÉGA-3 SUR LA CONSERVATION DE LA SEMENCE DE VERRAT 115

5.1 Résumé 116 5.2 Abstract 117 5.3 Introduction 118 5.4 Materials and methods 119

5.4.1 Animals 119 5.4.2 Diets... 120 5.4.3 Experimental design 120 5.4.4 Analytical procedures 123 5.4.5 Statistical analysis 125 5.5 Results 125 5.5.1 Experiment 1 - liquid storage during 9 days 125

5.5.2 Experiment 2 - liquid storage during 15 days 126 5.5.3 Experiment 3 - semen cryopreservation 126

5.6 Discussion , 127 5.6.1 Sperm liquid storage 127 5.6.2 Sperm cryopreservation 128

5.7 Conclusion 129 5.8 Acknowledgements 130

CHAPITRE VI EFFETS D'UNE ALIMENTATION RICHE EN ACIDES GRAS OMÉGA-3 SUR LE MÉTABOLISME DE L'INSULINE CHEZ LE PORC ADULTE EN

SANTÉ 142 6.1 Résumé 143

6.2 Abstract 144 6.3 Introduction 145 6.4 Experimental methods 146

6.4.1 Animals and diets 146

6.4.2 Analyses 147 6.4.3 Statistics 148 6.5 Results 149

6.5.1 Body condition (BW, P2 and Total Fat) 149

6.5.2 Lipid profile of blood plasma 149 6.5.3 Basal plasma glucose, insulin and C-peptide concentration 150

6.5.4 Responses to oral glucose tolerance test 150

6.5.5 Responses after the meal 150 6.5.6 Correlations between the body condition and insulin secretion/sensitivity 150

6.6 Discussion 151 6.6.1 Plasma fatty acid composition 151

6.6.2 Insulin sensitivity 152 6.6.3 Insulin secretion 153 6.6.4 Body fat and insulin 154

6.7 Conclusion 155 6.8 Acknowledgements 155

CHAPITRE VII DISCUSSION & CONCLUSIONS 170

7.1 Discussion 171 7.1.1 Profils lipidiques du sang et des spermatozoïdes 171

7.1.2 Performances de reproduction et qualité de la semence fraîche 173 7.1.3 Conservation des spermatozoïdes et qualité de la semence 174

7.1.4 Métabolisme de l'insuline 175

7.2 Conclusions générales 175

7.3 Perspectives 176 LISTE DES OUVRAGES CITÉS 177

Liste des tableaux

Tableau 2.1 : Composition du fluide testiculaire de porc (Tiré de White, 1980) 9

Tableau 2.2: Rôle des principales protéines épididymaires (Adapté de Gatti et al., 2004).. 12

Tableau 2.3 : Caractéristiques et composition de la semence de verrat (Tiré de Hafez et

Hafez, 2000) 19

Tableau 2.4 : Quelques caractéristiques et composés du plasma séminal (en mg/100ml)

(Tiré de White, 1980) 23

Tableau 2.5: Les différentes catégories de lipides (Adapté de Fahy et a l , 2005) 26

Tableau 2.6 : Nomenclature des acides gras 30 Tableau 2.7 : Les acides gras majeurs (en pourcentage des acides gras totaux) des

spermatozoïdes de plusieurs espèces animales (Adapté de Maldjian et al, 2003) 38 Tableau 2.8: Principaux antioxydants retrouvés dans la semence (Tiré de Sanocka et

Kurpisz, 2004) 41

Tableau 2.9 : Paramètres et méthodes d'analyse de la qualité de la semence 53 Tableau 2.10 : Classification de différents dilueurs utilisés pour la conservation de la

semence fraîche (Tiré de Gadea, 2003) 64

Tableau 2.11 : Composition chimique du dilueur BTS (Tiré de Pursel et Johnson, 1975) ..65

Tableau 3.1: Composition de la ration de base pour verrat de reproduction 75

Tableau 3.2: Composition en acides gras (g/100g d'acides gras totaux) de la ration de base,

du gras animal hydrogéné (AS) et des deux huiles de poisson (MO et TO) 76

Table 4.2: Fatty acids composition (analytical values in g/100 g of fatty acids) of basal diet

and supplemented fat fed to the boars 107

Table 4.3: Fatty acid composition of blood plasma (analytical values in g/100 g of fatty acids; Exp.l) before (Initial) and after 28 weeks of supplementation with hydrogenated

animal fat (AF) and fish oils (MO, TO and MO+B) 108

Table 4.4: Fatty acid composition of spermatozoa (analytical values in g/100 g of fatty acids; Exp.l) after 28 weeks of supplementation with hydrogenated animal fat (AF) and

fish oils (MO, TO and MO+B) 109

Table 4.5: Sperm quality (percentages of motile and morphologically normal cells) from boars fed with supplemented fats (AF, MO, TO and MO+B) according to the different

collection phases of Experiment 1 110

Table 4.7: Concentrations of vitamins (vitamin E and biotin; Exp. 1) measured in blood plasma and in semen of boars before (Initial) and after 28 weeks of supplementation with

hydrogenated animal fat (AF) and fish oils (MO, TO and MO+B) 112

Table 4.8: Fatty acid composition of blood plasma (analytical values in g/100 g of fatty acids; Exp. 2) before (Initial) and after 6 months of supplementation with hydrogenated

animal fat (AF) and fish oils (MO and TO) 113

Table 4.9: Sperm production in commercial conditions (Exp. 2) after 6 months of

supplementation with hydrogenated animal fat (AF) and fish oils (MO and TO) 114

Table 5.1 : Composition of the basal diet (as-fed basis) 137

Table 5.2: Fatty acids composition (g/100 g of fatty acids) of hydrogenated animal fat (AF)

and fish oils (MO and TO) 138

Table 5.3: Evolution of motility, morphology, viability and membrane integrity of boar

sperm during Experiment 2 (semen storage at 17°C for 15 days) 139

Table 5.4: Evolution of motility, morphology, viability and membrane integrity of boar

sperm during Experiment 2 (semen storage at 17°C for 15 days) 140

Table 6.2: Fatty acid composition (g/100g of fatty acid) of basal diet, hydrogenated animal

fat and fish oils 163 Table 6.3: Age and body condition (back fat level, body weight, and calculated total fat)

before and at the end of the experiment (mean values ± SEM) 164

Table 6.4: Plasma fatty acid composition (g/100g of fatty acid) before treatment attribution

and for the three diets 165

Table 6.5: Basal plasma concentration of glucose, insulin and C-peptide 166 Table 6.6: Plasma glucose, insulin and C-peptide responses in OGTT 167

Table 6.7: Correlations between body fat (back fat thickness and total fat) and insulin

Liste des figures

Figure 2.1 : Schéma du système reproducteur du verrat (Adapté de Hafez, 1980) 6

Figure 2.2 : Coupe sagittale du testicule (Tiré de Barone, 1976) 8

Figure 2.4 : Schéma d'un spermatozoïde (Tiré de Hafez et Hafez, 2000) 21

Figure 2.5: Représentation schématique des acides gras (ex : l'acide a-linolénique) 28 Figure 2.6: Biosynthèse des acides gras polyinsaturés des familles oméga-6 et oméga-3 ...33

Figure 2.7 : Schéma général du métabolisme énergétique du spermatozoïde 47

Figure 2.8 : Différentes anomalies morphologiques 55

Figure 2.9 : Sécrétion et actions de l'insuline 69

Figure 3.1: Diagramme récapitulatif des différentes phases de collecte de semence 78 Figure 6.1: Plasma glucose, insulin and C-peptide profiles obtained from OGTT 168

Liste des abréviations anglaises et françaises

AA: acide arachidonique ABP: androgen bindin protein AF: gras animal, animal fat AL: acide linoléique

ALA: acide a-linolénique AGPI: acides gras polyinsaturés BTS: Beltsville-Thawing-Solution

CIPQ: Centre d'insémination porcine du Québec COX: cyclo-oxygénase

CRBR: Centre de recherche en biologie de la reproduction DAO: dérivés actifs de l'oxygène

DHA: acide docosahexaénoïque, docosahexaenoic acid DMSO: diméthylsulfoxyde

DPA: acide docosapentaénoïque, docopentaenoic acid EPA: acide eïcosapentanéoïque, eicosapentaenoic acid ERT: ergothioneine

FIV: fécondation in vitro

FPPQ: Fédération des producteurs de porcs du Québec GPC : glycérophosphocholine

GPI: glycosylphosphatidylinositol GPX: glutathion peroxydase

HOMA: homeostasis model assessment HOST: hypo-osmotic swelling test IA: insémination artificielle ISI: insulin sensitivity index LOX: lipoxygenase

LPO: lipid peroxidation LT: leucotriènes

NRC: National Research Council n-3: oméga-3

n-6: oméga-6

OGTT: oral glucose tolerance test ORT: osmotic resistance test PC: phospatidylcholine

PE: phosphatidyléthanolamine PG: prostaglandine

PI: propidium iodide PKC: protéine kinase C PLA: phospholipase A PS: phosphatidyl serine

PUFA: polyunsaturated fatty acid SOD: superoxide dismutase SPM: sphingomyéline TO: huile de thon, tuna oil

admis que la ration servie aux truies en gestation répond aux besoins nutritionnels des verrats. Le peu d'intérêt porté jusqu'à présent à l'alimentation des verrats est lié d'une part au fait que cette catégorie d'animaux représente un très faible pourcentage de l'ensemble des porcs et d'autre part aux méthodes d'élevage pratiquées ces vingt dernières années. Pendant longtemps, avec la saillie naturelle, la libido et la qualité des membres étaient préférées à la production de sperme puisque l'éjaculat de verrat peut contenir de 5 à 40 fois plus de spermatozoïdes que le nombre requis pour assurer la fécondation de tous les ovules. De plus, les études s'intéressant à l'influence des composantes nutritionnelles sur la production spermatique, en raison de la durée de la spermatogenèse chez le porc (6 à 7 semaines), sont longues, complexes et coûteuses.

Avec la généralisation de l'insémination, qui est pratiquée actuellement dans plus de 80 % des élevages porcins en Amérique du Nord et en Europe, l'alimentation des verrats revêt un tout nouvel intérêt. Cette technique, très attrayante pour les producteurs, répond en effet à un souci de productivité mais implique des coûts importants, principalement liés à la sélection, l'achat et l'entretien des verrats. Il est donc devenu nécessaire pour les industriels de pouvoir répondre aux besoins nutritionnels spécifiques des verrats afin d'assurer des performances de reproduction optimales tant pour la libido que la quantité et la qualité de la semence.

L'effet potentiel sur la semence et la libido du porc de la supplementation de l'alimentation avec différents acides gras, dont les acides gras polyinsaturés oméga-3 (AGPI n-3), connaît actuellement un intérêt croissant dans la recherche porcine. Cependant l'acide linoléique, qui appartient à la famille des acides gras oméga-6, est le seul acide gras pour lequel le NRC (1998) a reconnu une action dans l'activité sexuelle du verrat et a établi son apport à un minimum de 0,1 % dans l'alimentation. Plusieurs études ont pourtant montré, chez le porc mais aussi chez d'autres espèces animales, le rôle bénéfique des AGPI n-3 sur les performances de reproduction et la qualité de la semence (Wathes et a l , 2007).

1997; Surai et al., 2000; Zaniboni et Cerolini, 2009) ont montré l'influence d'un apport en AGPI n-3 à la ration alimentaire sur la fertilité ou la viabilité des spermatozoïdes. Chez le lapin et le chien, l'association d'acides gras n-3 à des doses supranutritionnelles de vitamines E inhibe les phénomènes oxydatifs tout en améliorant les caractéristiques du sperme (Castellini et a l , 2003; Da Rocha et al., 2009). Chez le verrat, il a été montré que l'ajout de AGPI n-3 à la ration alimentaire quotidienne augmentait la concentration spermatique (Penny et al, 2000; Maldjian et a l , 2003; Estienne et al, 2008) mais aussi les proportions de spermatozoïdes motiles (Mitre et al., 2004), vivants et morphologiquement normaux (Rooke et al, 2001). Toutefois, il existe certaines études chez le porc (Paulenz et al, 1995; Paulenz et a l , 1999), chez le cheval (Brinsko et al, 2005) et chez le lapin (Gliozzi et a l , 2009) qui viennent infirmer l'hypothèse selon laquelle les AGPI n-3 auraient un effet sur les critères de qualité de la semence des verrats.

Le but du présent travail de recherche expérimentale était d'apporter de nouvelles informations sur les effets d'un apport alimentaire en AGPI n-3, d'une part, sur les performances de reproduction chez le verrat, la qualité de la semence et sa capacité à la conservation et, d'autre part, sur le métabolisme de l'insuline. La revue bibliographique présentée dans cette thèse est structurée en quatre grandes parties. La première partie s'attarde à présenter la reproduction chez le verrat, notamment l'anatomie de l'appareil génital mâle, la production de la semence et ses caractéristiques. La seconde partie est consacrée à une description du métabolisme des acides gras et à leurs différents rôles par rapport au sperme. La troisième partie décrit les facteurs influençant la qualité de la semence et les méthodes permettant d'évaluer la fertilité des spermatozoïdes. Enfin, la dernière partie se concentre sur les différentes techniques de conservation des spermatozoïdes et les facteurs qui vont affecter leur préservation. Par la suite, après une brève description du travail expérimental, l'ensemble des résultats obtenus est présenté sous forme de trois articles scientifiques. Enfin, les conclusions issues de ces travaux sont rassemblées sous la forme d'une discussion générale.

La maturité sexuelle chez le verrat est atteinte vers 6-8 mois (Pond et Houpt, 1978). Le comportement sexuel mâle inclut trois phases : (1) la cour, (2) la monte, (3) la pénétration et l'éjaculation (Hafez et a l , 1964). La copulation peut durer entre 3 et 20 minutes.

2.1.1 L'appareil génital mâle

Chez les mammifères, l'appareil génital mâle (Figure 2.1) est formé de deux parties distinctes, les glandes génitales qui correspondent aux testicules et les voies spermatiques qui comprennent l'épididyme, le canal déférent et l'urètre, auxquelles sont associées les glandes annexes et les formations érectiles. L'appareil génital mâle est chargé de produire le sperme et de le déposer dans les voies génitales femelles (Barone, 1976). En 1938, une description anatomique complète du système reproducteur du verrat a été publiée (Mckenzie é t a l , 1938).

2.1.1.1 Les testicules 2.1.1.1.1 Anatomie

Organes pairs et pleins, de forme ovoïde et volumineux chez le porc (350-400 g/testicule en moyenne chez l'adulte), les testicules assurent deux rôles essentiels (Amann et Schanbacher, 1983) : la formation des gamètes mâles ou spermatozoïdes (fonction dite exocrine) et la sécrétion d'hormones stéroïdiennes comme les androgènes et la testosterone (fonction dite endocrine). Anatomiquement, chaque testicule, suspendu par le cordon spermatique, est logé dans le sac scrotal, poche qui joue d'importantes fonctions de protection et de thermorégulation (Barone, 1976). La position extra-abdominale des testicules permet le maintien d'une température inférieure à la température corporelle, de 2 à 3°C chez le porc (Barone, 1976), condition indispensable au bon déroulement de la spermatogenèse (Foote, 1978).

Muscle rétracteur Glande Bulbo-urétrale Épidklyme (queue) Scrotum Testicule ÉptdkJyme (tête) Canal déférent Pénis Prépuce

Ce dernier est lui-même constitué de l'artère testiculaire autour de laquelle s'enroulent les veines du plexus pampiniforme, des vaisseaux lymphatiques ainsi que des fibres nerveuses ortho- et para-sympathiques (Barone, 1976; Dadoune et Demoulin, 1991).

Chaque testicule (Figure 2.2) est recouvert d'un tissu blanc et élastique très vascularisé, l'albuginée. En s'enfonçant en profondeur dans le testicule, l'albuginée forme des compartiments appelés lobules testiculaires (Barone, 1976). Chaque lobule renferme un grand nombre de tubules en serpentin (les tubes séminifères) entourés de tissu interstitiel lâche. Ce tissu conjonctif représente 40 % du tissu testiculaire du verrat. Il est formé de très nombreuses cellules endocrines (les cellules de Leydig) regroupées en amas et de rares capillaires sanguins et lymphatiques (Dadoune et Demoulin, 1991). Les tubes séminifères, comportent deux parties, une contournée qui est le site de production des spermatozoïdes et une droite qui forme, avec le rete testis, les premières voies d'excrétion du sperme (Barone,

1976; Amann et Schanbacher, 1983).

2.1.1.1.2 Le fluide testiculaire (rete testis)

Le fluide testiculaire (Tableau 2.1) assure essentiellement le transport des spermatozoïdes des tubes séminifères du testicule vers l'épididyme. Il contient de grandes quantités d'ions potassium, magnésium et phosphore ainsi que de 1'inositol mais peu de glucose (<2 mg/100 ml). À l'exception de grandes quantités d'Adrogen Binding Protein (ABP), la concentration en protéines est aussi relativement faible (Hafez, 1980; Dadoune et Demoulin, 1991).

Canal déférent Cône vasculaire

Tête (épididyme)

Figure 2.2 : Coupe sagittale du testicule (Tiré de Barone, 1976)

Queue (Épididyme)

Albuginée

Composé mg/100 ml Sodium 347 Potassium 21 Calcium 4.8 Chlorures 476 Protéines 165 Inositol 126 Acide lactique 6,2 Glycerylphosphocholine (GPC) 52

2.1.1.2 Les voies génitales mâles

Les spermatozoïdes, à la sortie du testicule, suivent les voies spermatiques extratesticulaires. Celles-ci débutent par les canaux efférents (vasa efferentia), se poursuivent par le canal épididymaire, le canal déférent et enfin l'urètre (Barone, 1976).

2.1.1.2.1 L'épididyme

Comportant de très nombreuses convolutions, le canal épididymaire chez le verrat est long et volumineux (Barone, 1976). Accolé à la face postérieure du testicule, l'épididyme peut-être subdivisé en trois parties anatomiques : la tête (région antérieure) dans laquelle pénètrent les canaux efférents, le corps (région médiane) et la queue (région postérieure) d'où émerge le canal déférent. Le canal de l'épididyme est responsable du transport, de la concentration, de la maturation et de la survie des spermatozoïdes (Glover et Nicander,

1971).

Il est admis que, d'un point de vue fonctionnel, l'épididyme comporte trois régions (Amann et Schanbacher, 1983). La première qui englobe les canaux efférents et le début de la tête est le lieu de la réabsorption et de la sécrétion de nombreux composés du fluide testiculaire. La seconde, qui correspond à la majeure partie de la tête et inclut le corps, est reliée à la maturation des spermatozoïdes. La dernière, qui coïncide avec la partie terminale de l'épididyme et le canal déférent, est le site de réserve des spermatozoïdes.Les activités de réabsorption et de sécrétion de 1'epithelium épididymaire modifient radicalement la composition du fluide (Yanagimachi, 1994).

Comme il l'a été également montré chez d'autres espèces animales (Turner, 1984; Goyal et Williams, 1991), plus de 90 % du fluide testiculaire du verrat est absorbé au niveau de l'épididyme. Alors que plusieurs composés comme le bicarbonate et certaines protéines testiculaires (l'ABP et la transferrine) vont être absorbés, l'épithélium épididymaire va sécréter des ions H+ et un très grand nombre de protéines (125 protéines recensées chez le

verrat) (Syntin et a l , 1996).

Dix protéines (lactoferrine, HE1/CTP, GPX, hexosaminidase, galactosidase, mannosidase, PGDS, E-RABP, Clusterine) représentent à elles seules plus de 80 à 90 % des sécrétions épididymaires totales (Gatti et al, 2004) et jouent trois fonctions importantes (Tableau 2.2) : assurer la survie et la protection des spermatozoïdes au cours du transit, modifier le revêtement membranaire et réguler l'activité de l'épididyme (Dacheux et a l , 2005). Cette sécrétion protéique est en grande partie sous le contrôle des androgènes (Dacheux et Dacheux, 2001).

2.1.1.2.2 Canal déférent et urètre

En s'éloignant du testicule, l'épididyme forme le canal déférant (Vas defer entid). Au cours de son trajet dans ce conduit long de 25-30 cm, puis dans l'urètre, le liquide épididymaire s'enrichit en éléments nutritifs, en agents coagulants et lubrifiants sécrétés par les glandes annexes. Dans sa partie extra-pelvienne, l'urètre est pourvu de formations érectiles (corps spongieux et corps caverneux) qui forment le pénis (Barone, 1976).

Tableau 2.2: Rôle des principales protéines épididymaires (Adapté de Gatti et al., 2004)

Protéine épididymaire Rôle

Lactoferrine GPX

Clusterine

Les glycosidases (hexosaminidase, mannosidase et galactosidase) HE1/CTP

PGDS E-RABP

Action bactéricide Protection des membranes

(action antioxydante) Protection des membranes Catabolisme des glycoprotéines (modification des protéines de surface)

Transport du cholestérol Transport des androgènes Transport de l'acide rétinoïque

2.1.1.3 Les glandes annexes

Chez le porc, les glandes annexes sont nombreuses et très développées (Barone, 1976). Elles comprennent les vésicules séminales, la prostate, les glandes bulbo-urétrales et les glandes préputiales. Leurs sécrétions représentent environ les trois quarts du plasma séminal d'un éjaculat (Mann, 1964).

Les vésicules glandulaires sont responsables de la plus grande partie du volume de l'éjaculat. Elles sécrètent du fructose et de l'acide citrique ainsi que de grandes quantités d'ergothionéine, d'inositol et de glycerylphosphocholine (Ashdown et Hancock, 1980). La majorité de ces composés sont des substrats énergétiques (Flowers, 1996). Ces glandes sécrètent également des protéines de nature très variée (enzymes, inhibiteur d'enzymes et protéines structurales) qui jouent un rôle important dans le processus de fécondation (Strzezek, 2002).

Les sécrétion prostatiques contiennent de grandes quantités d'ions Zn2+, Ca2+, Mg2+,

K+ et de spermine ainsi que de l'acide phosphatase et de la fibrolysine (Flowers,

1996). La fonction première de cette glande serait de neutraliser l'acidité des sécrétions vaginales (Flowers, 1996). Le zinc et la spermine ont pour leur part un pouvoir bactéricide. Le zinc contribuerait également à stabiliser l'ADN des spermatozoïdes et jouerait un rôle comme facteur de décapacitation (Fournier-Delpech et Thibault, 1991).

Les glandes bulbo-urétrales (ou glandes de « Cowper »), très volumineuses chez le porc, sécrètent une sialomucine qui forme des grains de coagulum (surnommé dans l'industrie « tapioca ») dans l'éjaculat (Mann, 1964).

- Les glandes préputiales produisent le segma qui donne l'odeur « sui generis ». Elles sont la source de phéromones, véhicule de l'effet mâle dans les interactions sexuelles (Barone, 1976).

2.1.2 La spermatogenèse

La spermatogenèse (Figure 2.3) est l'ensemble des phénomènes qui, des spermatogones, cellules souches diploïdes (2n chromosomes = 38), aboutissent aux spermatozoïdes, gamètes mâles haploïdes (n chromosomes). Ce processus continu a lieu dans les tubes séminifères des testicules. Il est sous contrôle hormonal et comprend deux étapes majeures : la spermatocytogenèse et la spermiogenèse (Garner et Hafez, 1980). La spermatogenèse débute au moment de la puberté, chez le verrat vers l'âge de 5 à 8 mois (Hafez et Hafez, 2000). Frankenhuis et al. (1982) ont montré que ce processus est identique chez le verrat et chez le rat et prend dans le cas du porc environ 34 jours pour se réaliser. Dix jours supplémentaires sont nécessaires pour permettre au sperme de traverser l'épididyme avant d'être éjaculé. Un verrat adulte produit en moyenne 15-20 milliards de spermatozoïdes par jour.

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2.1.2.1 Spermatocytogenèse

La spermatocytogenèse comporte deux étapes : la première correspond à un processus mitotique des cellules de la lignée germinale (les spermatogonies); la seconde à une réduction chromosomique (méiose) aboutissant à la formation des spermatides. Les spermatogonies, cellules « souches » des spermatozoïdes, sont disposées en couches superposées contre la membrane basale des tubes séminifères. Elles sont unies par des ponts intercellulaires ce qui permet la division synchrone des cellules d'une même génération.

Sur la base de leurs caractéristiques nucléaires, Frankenhuis et al. (1982) distingue chez le verrat quatre classes de spermatogonies issues de divisions successives : les spermatogonies « indifférenciées » (As, Apr, Aai), les spermatogonies « différenciées » (Ai à

A4), les spermatogonies intermédiaires (In) et les spermatogonies B (Figure 2.3). Ces dernières vont donner naissance après division aux spermatocytes I. Par la suite, la première division méiotique des spermatocytes I conduit à la séparation des chromosomes homologues appariés et à la formation des spermatocytes II. La seconde division méiotique va aboutir à la formation des spermatides (Garner et Hafez, 1980).

2.1.2.2 Spermiogenèse

La spermiogenèse correspond à la métamorphose des spermatides et aboutie à la formation des spermatozoïdes (Figure 2.3). Cette étape comporte une série de changements morphologiques progressifs, subdivisés en 15 différents stades successifs chez le verrat, impliquant la réorganisation du noyau (compaction de la chromatine) et du cytoplasme (réduction cytoplasmique) ainsi que la formation de l'acrosome à partir de l'appareil de Golgi et l'assemblage des structures du flagelle (Dadoune et Demoulin, 1991). Les spermatozoïdes nouvellement formés sont ensuite libérés dans la lumière des tubes séminifères ; phénomène appelé la spermiation (Mann, 1964).

2.1.3 Acquisition du pouvoir fécondant

À la fin de la spermatogenèse, les spermatozoïdes encore immatures et immobiles doivent subir deux processus de maturation avant d'être potentiellement aptes à féconder l'ovule. C'est lors de leur transit dans l'épididyme que les spermatozoïdes, à travers plusieurs modifications morphologiques et biochimiques, vont devenir motiles, perdre leur gouttelette cytoplasmique et acquérir leur pouvoir fécondant. Mais ce n'est qu'à la suite du second processus de maturation dans le tractus génital féminin (la capacitation), que les spermatozoïdes vont pouvoir pénétrer la zone pellucide et féconder l'ovule.

2.1.3.1 Maturation épididymaire

Le temps de transit des spermatozoïdes dans l'épididyme est évalué en moyenne de 8 à 15 jours (Singh, 1962; Dacheux et Dacheux, 2001). Chez le verrat, França et al. (2005) décompose cette durée de 5,4 à 7 jours pour les régions de la tête et du corps et de 9 à

11,8 jours pour la queue. Lors de leur passage dans l'épididyme, les spermatozoïdes vont subir un complexe processus de maturation, principalement dans les deux premières régions du canal, puis vont être mis en réserve au niveau de la queue de l'épididyme jusqu'au moment de l'éjaculation (Holtz et Smidt, 1976). Briz et al. (1995) répertorient de

nombreux changements morphologiques et fonctionnels qui vont s'opérer au cours de ce processus graduel de maturation : activation de la motilité, changement de voie métabolique, réarrangement du noyau et des structures du flagelle, perte de la gouttelette cytoplasmique et remaniement de la membrane plasmique.

Plusieurs auteurs soutiennent que les étapes de maturation post-testiculaire dépendent en majorité des interactions séquentielles du sperme avec le fluide épididymaire (Bedford et al, 1973; Yanagimachi, 1994; Dacheux et a l , 2003; Cooper, 2007).

2.1.3.2 Maturation post-éjaculatoire : la capacitation

Austin (1952) définit la capacitation comme l'ensemble des transformations biochimiques et membranaires que le spermatozoïde doit subir pour acquérir la capacité à pénétrer la membrane cellulaire de l'ovule. Cette cascade de phénomènes est accomplie par les spermatozoïdes dans le tractus génital de la femelle (De Lamirande et a l , 1997). De nombreuses études suggèrent que celle-ci se tiendrait dans l'oviducte au niveau de l'ampoule tubaire et serait induite par le fluide péri-ovulatoire (Rodriguez-Martinez et al, 2005). Cependant, la durée et les mécanismes de régulation de la capacitation sont encore mal connus. De manière globale, le processus de capacitation correspond à la perte de glycoprotéines de surface (des facteurs de décapacitation) associée à des réarrangements membranaires (apparition de domaine récepteur ZP3), à une hyperactivité des mouvements du flagelle ainsi qu'à l'initiation de mécanismes de signalisation (AMPC, protéines-kinases

et phosphatases) (De Lamirande et al, 1997).

2.1.4 La semence de porc

Par définition, le sperme est constitué d'un liquide de composition complexe, le plasma séminal, dans lequel un grand nombre de spermatozoïdes sont en suspension (Tableau 2.3). Le verrat est l'animal domestique qui sécrète le plus grand volume de semence lors de l'éjaculation. L'éjaculat d'un verrat adulte représente en moyenne un volume de 150 à 200 ml et contient de 30 à 60 x 109 spermatozoïdes (Hafez et Hafez, 2000). Ce volume et

cette quantité totale de spermatozoïdes varient selon l'âge de l'animal, la fréquence des prélèvements ainsi que la taille des testicules (Pond et Houpt, 1978; Audet et al, 2009). L'éjaculat du verrat peut être divisé en trois grandes parties (Pond et Houpt, 1978) : la fraction pré-spermatique, transparente et de consistance aqueuse, a un volume variant entre 5 à 15 ml et est composée essentiellement des sécrétions des glandes annexes et de peu de spermatozoïdes ; la fraction spermatique (ou riche), d'apparence épaisse et de couleur blanc-laiteux, ne représente que 10 à 20% de l'éjaculat mais contient une grande concentration de spermatozoïdes (jusqu'à 90 %) ; la fraction post-spermatique représente 60 à 80 % du volume final et est essentiellement constituée de grains de coagulum.

Tableau 2.3 : Caractéristiques et composition de la semence de verrat (Tiré de Hafez et Hafez, 2000) Caractéristique Volume éjaculé (ml) 150-200 Concentration spermatique ( 106/ml) 200-300 Quantité totale/éjaculat ( 109) 30-60 Protéines (g/100 ml) 3,7 pH 7,3-7,8 Fructose (mg/100 ml) 9 Sorbitol (mg/100 ml) 6-18 Acide citrique (mg/100 ml) 173 Inositol (mg/100 ml) 380-630 Glycerylphosphocholine (mg/100 ml) 110-240 Ergothioneine (mg/100 ml) 17 Sodium (mg/100 ml) 587 Potassium (mg/100 ml) 197 Calcium (mg/100 ml) 6 Magnésium (mg/100 ml) 5-14 Zinc(pg/ml) 31,8 Chloride (mg/100 ml) 260-430

2.1.4.1 Le spermatozoïde

Nicander et Bane (1962) ont fait une description détaillée de l'ultrastructure du spermatozoïde de verrat. Cette cellule de petite taille (56-58 pm de longueur), flagellée et mobile, comporte une tête et une queue unies par un col étroit (Figure 2.4). La forme et les dimensions de la tête sont variables selon les espèces. Chez le verrat, elle est de forme elliptique et mesure 8 à 9 pm de long sur 5 pm de large (Barone, 1976). La tête est presque entièrement constituée par le noyau. À sa partie antérieure, le noyau est coiffé par un large acrosome. Celui-ci correspond fonctionnellement à un lysosome et contient plus d'une vingtaine d'enzymes différentes (Dnase, Rnase, hyaluronidase, acrosine, acide phosphatique, arylsulphatase, hexoaminase, etc.) qui interviennent dans la fécondation (Gamer et Hafez, 1980; Dadoune et Demoulin, 1991). La queue (ou flagelle) du spermatozoïde peut être subdivisée en trois parties successives : la pièce intermédiaire, la pièce principale et la pièce terminale. Le flagelle est parcouru dans toute sa longueur par l'axonème, élément essentiel de la motilité. Au niveau de la pièce intermédiaire, l'axonème est entouré d'une couronne de fibres denses externes qui se prolonge jusqu'à la pièce centrale et d'une gaine mitochondriale. Cette dernière fournie l'énergie nécessaire aux mouvements du flagelle. Les principaux constituants des spermatozoïdes sont les acides nucléiques, les protéines et les lipides (Hafez et Hafez, 2000).

Queue <

Pièce intermédiaire

Pièce terminale

2.1.4.2 Le plasma séminal

Le plasma séminal (Tableau 2.4) est composé du liquide épididymaire et des sécrétions des glandes annexes, qui représentent à elles seules les trois quart du volume séminal. Le liquide testiculaire souvent défini comme un plasma séminal primitif ne représente qu'une partie minime du volume final éjaculé, car il est grandement modifié au niveau de l'épididyme (Hafez, 1980). Le plasma séminal contient de nombreux electrolytes : potassium, phosphore, azote, calcium, magnésium et chlorure. Il est également riche en phospholipides, en inositol (3,0 à 4,5 mg/ml) et en GPC (Lavon et Boursnell, 1971). Ces composés sont impliqués dans le métabolisme spermatique (Mann et Leone, 1953; Mann, 1956; Dawson et a l , 1957; Hartree, 1957). Le fructose (9 à 60 mg/100 ml de semence) et le galactose (4 à 20 mg/100 ml) sont également présents dans la semence de verrat (Mann, 1951; Foley é t a l , 1964; Baronos, 1971).

Le plasma séminal contient des protéines (3 à 7 %) ainsi que des polypeptides et des acides aminés libres (White, 1980). La plupart des protéines sont sécrétées par les vésicules séminales (Lavon et Boursnell, 1971). Plus de 90 % d'entre elles appartiennent à la famille des spermadhésines et sont impliquées dans la modulation de la capacitation et de l'interaction avec l'ovocyte. Plusieurs protéines majeures ont été identifiées chez le porc : AWN, AQN, PSP et DQH (Dacheux et Dacheux, 2001; Jonakova et al, 2007). Les spermadhésines des familles AQN et AWN sont les protéines majeures du plasma séminal (Jonakova et a l , 1998). La AQN-1 serait impliquée dans la stabilisation de la membrane, dans la formation du réservoir spermatique et dans l'initiation de la capacitation (Ekhlasi-Hundrieser et a l , 2005). AWN jouerait pour sa part un rôle dans l'interaction du spermatozoïde avec l'ovocyte (Rodriguez-Martinez et al, 1998). La spermadhésine PSP-I, outre son effet sur la préservation des spermatozoïdes in vitro, modulerait la réponse immune utérine par son action chémioattractrice sur les leucocytes (Rodriguez-Martinez et a l , 2005). La glycoprotéine DQH participerait au processus inflammatoire et à la régulation de la capacitation (Jonakova et al., 1998). Plusieurs enzymes (aminotransferases, sulfatases, antioxydants) se retrouvent également dans le plasma séminal (Strzezek, 2002).

Tableau 2.4 : Quelques caractéristiques et composés du plasma séminal (en mg/100ml) (Tiré de White, 1980).

Caractéristique Taureau Bélier Verrat

Volume (ml) 5-8 0,8-1,2 150-200 PH 6,4-7,8 5,9-7,3 7.3-7.8 Sodium 225 ± 13 178 ±11 587 Potassium 155 ± 6 89 ± 4 197 Calcium 40 ± 2 6 ± 2 6 Magnésium 8 ±0,3 6 ±0.8 5-14 Chlorure 174-320 86 260-430 Fructose 460-600 250 9 Sorbitol 10-140 26-120 6-18 Acide citrique 620-806 110-260 173 Inositol 25-46 12 380-630 Glycérylphosphocholine 100-500 1100-2100 110-240 Ergothionéine 0 0 17 Protéines (g/100 ml) 6,8 5,0 3,7

Le plasma séminal contient également plusieurs composés antioxydants non enzymatiques comme l'acide ascorbique, l'ergothionéine et la glutathion capables de neutraliser les dommages liés à la peroxydation (Strzezek et a l , 1999; Strzezek, 2002). En comparant à d'autres espèces animales, il semble cependant que cette capacité antioxydante du plasma séminal soit beaucoup plus faible chez le porc (Brezezinska-Slebodzinska et al, 1995; Strzezek et a l , 1999). Les oestrogènes sont les hormones principales présentes dans le plasma séminal. Leur concentration peut atteindre 11,5 pg/éjaculat (Claus, 1990). Plusieurs rôles leur sont attribués : la stimulation des contractions utérines, l'induction de la synthèse de prostaglandines chez la truie et l'avancement de l'ovulation (Claus, 1990). Comme chez la plupart des espèces (taureau, étalon, verrat), les taux de prostaglandines séminales sont faibles, inférieurs à 100ng/ml (Claus et a l , 1992). Les concentrations du plasma séminal en anticorps sont faibles. LTgG est l'anticorps prédominant : 23,2 ± 14 pg/mL contre 4,8 + 2,5 pg/mL pour l'IgA et 3,7 + 1,7 pg/mL pour l'IgM (Kaiser et al, 2000).

2.2 Les acides gras et la semence

2.2.1 Définitions

Christie (2003) définit les lipides de la manière suivante : ce sont les acides gras et leurs dérivés, ainsi que toutes substances biosynthétiquement ou fonctionnellement liées à ces composés. Les acides gras sont des composés synthétisés par condensation des unités de malonyl-coenzyme A grâce à un complexe enzymatique (acide gras synthase).

Fondamentalement, les lipides peuvent être subdivisés en deux grands groupes (Rejraji et al, 2009) : les lipides simples (acides gras, glycérides, tocopherols et sterols) qui se trouvent habituellement dans les tissus de réserve sous forme d'agrégats et les lipides complexes (glycolipides, phospholipides) qui sont en général des éléments structuraux des membranes biologiques.

Plus classiquement, les lipides sont classés en six catégories (Fahy et a l , 2005) : les acides gras, les glycérolipides (principalement les triglycérides), les glycérophospholipides, les sphingolipides, les sterols et les prénols (Tableau 2.5).

- Les acides gras sont constitués d'un nombre pair de carbones formant une longue chaîne linéaire hydrocarbonées terminée à l'une de leur extrémité par un groupement carboxyle (-COOH). En général, les acides gras, rarement libres dans la nature, sont complexés à d'autres molécules pour former des glycolipides ou des lipoprotéines.

Les triglycérides sont des molécules formées d'un glycerol combiné à 3 acides gras. Ils sont les constituants exclusifs de la plupart des graisses et des huiles d'origines végétale et animale.

Les glycérophospholipides sont constitués d'un glycerol portant deux acides gras et un groupement phosphate lui-même relié à un alcool. Les phospholipides déterminent la structure de base des membranes biologiques.

- Les sphingolipides sont constitués d'un acide gras et d'un alcool aminé. Tout comme les glycérophospholipides mais dans une moindre mesure, ils sont des constituants des membranes biologiques.

L'unité de base des prénols est l'isoprène. La condensation de plusieurs de ces unités va donner naissance aux précurseurs des quinones (vitamines A, E, K) et des isoprénoïdes.

Le sterol le plus important est le cholestérol car il est non seulement le précurseur de nombreux composés (acides biliaires, hormones stéroïdiennes, vitamine D) mais aussi un constituant important des membranes plasmiques.

Tableau 2.5: Les différentes catégories de lipides (Adapté de Fahy et a l , 2005)

Groupe Exemple de classes et sous classes

Acides gras et dérivés Glycérolipides

Glycérophospholipides

Sphingolipides Sterols

acides gras et conjugués, eicosanoïdes, cires mono-, di- et tri-glycérides

acides phosphatidiques (PA), acides phosphatidylcholines (PC), acides phospatidylethanolamines (PE), acides phosphatidylsérines (PS), acides phosphatidylinositoles (PI) céramides, phophosphingolipides cholestérol, stéroïdes, vitamine D Prénols isoprénoïdes, quinones (vitamine E)

2.2.2 Nomenclature

Les acides gras se composent d'une longue chaîne hydrocarbonée linéaire dont les deux extrémités sont constituées des groupements carboxyle (-COOH) et méthyle (-CH3). Bien que le nombre d'atomes de carbone composant ces chaînes varie entre 2 et 80, les acides gras les plus répandus ont entre 12 et 22 unités de carbone (Ci2 et C22) (Gunstone, 1996). Ces longues chaînes hydrocarbonées, sont dites saturées si elles ne présentent aucune liaison double; monoinsaturés et polyinsaturées si elles possèdent une ou plusieurs liaisons doubles. Il est intéressant de remarquer que les doubles liaisons se répartissent le long de la chaîne hydrocarbonée de manière systématique et alternative, tous les trois atomes de carbone (liaison vinyl-éther : R-CH=CH-). Selon la nomenclature physiologiste (« Designation N »), les acides gras sont classés en fonction du nombre de carbones, du nombre de doubles liaisons (:) et de l'emplacement de la première double liaison (n) par rapport au groupement méthyl terminal (Figure 2.5). Il existe aussi une autre nomenclature, celle des chimistes, qui se distingue de la précédente par le fait que la numérotation des doubles liaisons (notée À) commence à partir de l'extrémité carboxyle.

Nombre d'atomes de carbone

x y

18 : 3 n-3

î

2.2.2.1 Les acides gras saturés

Les acides gras saturés à courte et moyenne chaînes (C4 à Ci4) sont présents à des concentrations faibles et variables dans la nature (Tableau 2.6). Ils se retrouvent principalement dans le lait et certaines huiles végétales (huile de palme, huile de noix de coco). Les acides gras en C14, Ci6 et Cis sont par contre très abondants. L'acide palmitique (16 : 0) est l'acide gras saturé le plus fréquemment rencontré. Il se retrouve dans les huiles de poissons (10 à 30 %), le lait et les graisses animales (jusqu'à 30 %) ainsi que dans la plupart des huiles végétales (entre 5 et 50 %). L'acide stéarique (18 : 0) se retrouve principalement dans le suif (5 à 40 %) et dans plusieurs gras solides d'origine végétale (30 à 45 %) (Gunstone, 1996). La formule chimique générale des acides gras saturés est la suivante : CH3 - (CH2)n - COOH.

2.2.2.2 Les acides gras monoinsaturés

Les acides gras monoénoïques, c'est-à-dire avec une seule double liaison, représentent une grande partie des acides gras totaux des lipides présents dans la nature. Ces acides gras sont représentés comme suit : CH3 - (CH2)n - CH = CH - (CH2)m - COOH. La plupart ont

leur double liaison sur le neuvième carbone (n-9) en configuration cis. Les acides gras les plus abondants dans les tissus animaux et végétaux ont 16, 18 et 22 unités de carbones mais certains analogues estérifiés peuvent avoir entre 10 et 30 atomes de carbones (Christie, 2009). Les principaux acides gras monoinsaturés rencontrés dans la nature sont l'acide palmitoléique ( 1 6 : 1 n-7), l'acide oléique ( 1 8 : 1 n-9) et l'acide docosénoique (22 : 1 n-9) (Gunstone, 1996).

2.2.2.3 Les acides gras polyinsaturés

Les acides gras polyénoïques possèdent au moins deux liaisons doubles. Pour la plupart, le nombre de doubles liaisons varie entre trois (chez les végétaux supérieurs) et six (pour les algues et les animaux) (Christie, 2009). Les plus importants ont entre 16 et 22 unités de carbones. Les Ci8 se rencontrent majoritairement dans le monde végétal alors que les C\(,, C20 et C22 se retrouvent principalement dans les huiles de poisson et les lipides d'origine animale (Gunstone, 1996).

Tableau 2.6 : Nomenclature des acides gras (Adapté de Christie, 2003)

Nom systématique Nom usuel Abréviation

Acides gras saturés

Éthanoïque Acétique 2 : 0 Butanoïque Butyrique 4 : 0 Dodécanoïque Laurique 12:0 Hexadécanoïque Palmitique 16:0 Eicosanoïque Arachidique 2 0 : 0 Docosanoïque Béhénique 2 2 : 0

Acides gras monoinsaturés

9-hexadecenoïque Palmitoléique 16 : 1 n-7

9-octadecenoïque Oléique 18:1 n-9

Acides gras polyinsaturés 9,12-octadécadienoïque 6,9,12-octadécatrienoïque 9,12,15-octadécatrienoïque 5,8,11,14-eicosatétraenoïque 5,8,11,14,17-eicosapentaenoïque 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoïque Linoléique (LA) 18:2 n-6 y-Linolénique 18:3 n-6 a-Linolénique (ALA) 18 : 3 n-3 Arachidonique (AA) 20 : 4 n-6 Clupanodonique (EPA) 20 : 5 n-3 Cervonique (DHA) 22 : 6 n-3

Les deux principales familles d'acides gras polyinsaturés (AGPI) présentes dans la nature, les AGPI oméga-3 (n-3 ou co-3) et les AGPI oméga-6 (n-6 ou co-6), dérivent respectivement de l'acide a-linolénique (18:3 3, ALA) et de l'acide linoléique (18 : 2 n-6, LA). L'acide linoléique est le plus commun des AGPI. Il est présent dans tous les tissus de réserve des végétaux. L'acide arachidonique (20 : 4 n-6, AA), un autre membre important de la famille des n-6, se rencontre principalement dans les graisses animales. C'est un composé mineur des huiles de poissons, du lard et du suif. Il est en revanche présent en grandes quantités dans les phospholipides (Gunstone, 1996). L'acide a-linolénique est pour sa part un important constituant des feuilles, des tiges et des racines des végétaux supérieurs (Gunstone, 1996). L'acide eicosapentaénoïque (20 : 5 n-3, EPA) et l'acide docosahexaénoïque (22 : 6 n-3, DHA) sont des membres important de la famille des oméga-3. Les huiles de poissons sont des sources majeures (jusqu'à 30 %) de ces deux acides gras (Gunstone, 1996). Le DHA est présent à de hauts niveaux de concentration dans le sperme, le cerveau et la rétine.

2.2.3 Les acides gras essentiels

Les acides linoléique (n-6) et a-linolénique (n-3) sont des acides gras dits essentiels. Chez les plantes, la conversion de l'acide oléique (18:1 n-9) en linoléique et en a-linolénique est réalisée au niveau des chloroplastes grâce aux désaturases Al2 et Al5. Chez l'ensemble des mammifères cette synthèse de novo est impossible du fait de l'absence de ces deux enzymes. Ces acides gras doivent donc être apportés par l'alimentation (Bézard et a l , 1994). De plus, il est reconnu que les acides linoléique et a-linolénique sont absolument indispensables à de nombreux processus biologiques comme la croissance, la reproduction et le développement du cerveau (Sardesai, 1992). Ce caractère indispensable, associé à leur rôle essentiel, explique que leur absence dans l'alimentation conduit à l'apparition de symptômes de carence. Le caractère essentiel de l'acide linoléique a été reconnu dès 1927 chez le rat, et dans les années 50 chez le porc (Burr et Burr, 1973). Les symptômes de carence les plus fréquents sont des altérations cutanées, des troubles rénaux et des anomalies des fonctions de la reproduction chez l'animal (Witz et Beeson, 1951).

Le caractère essentiel de l'acide a-linolénique a été reconnu beaucoup plus tard chez l'homme (Holman et a l , 1982) et est associé à des troubles neurologiques et visuels.

2.2.4 Le métabolisme des AGPI n-3 et n-6

L'acide linoléique et l'acide a-linolénique vont être utilisés comme substrat pour la synthèse de dérivés à longue chaîne par une série de réactions de désaturation et d'élongation (Figure 2.6). Cette elongation catalysée par une élongase se fait par addition d'unités acétylées (C2) fournies par le malonyl-CoA lui-même issu de la carboxylation de l'acétyl-CoA. L'incorporation de molécules de CO2 à l'acétyl-CoA est pour sa part catalysée par l'Acétyl-CoA carboxylase, une enzyme dépendante de la biotine.

Les fonctions métaboliques de la biotine (vitamine Bg), vitamine hydrosoluble, ont été découvertes dans les années 70. La biotine est une coenzyme qui participe à la biosynthèse des acides gras, des glucides et des acides aminés (Kornegay, 1986). Watkins (1989) démontra notamment, chez la volaille, qu'une alimentation carencée en biotine affectait directement l'élongation des acides gras. À l'exception du maïs, la biodisponibilité de cette vitamine dans les aliments utilisés en nutrition porcine est relativement faible (< 40 %). Son ajout à l'aliment a principalement trait au maintien de l'intégrité des onglons et à leur résistance accrue aux lésions (Matte, 2006). Les recommandations du NRC (1998) sont de 200 pg/kg.

Au cours de la biosynthèse des acides gras, l'acide a-linolénique, chef de file des AGPI de la famille n-3, est transformé en dérivés à longues chaînes dont les plus importants sont les acides eicosapentaénoïque (EPA, 20 : 5 n-3) et docosahexaénoïque (DHA, 22 : 6 n-3). En ce qui concerne la famille n-6, l'acide arachidonique (AA, 20 : 4 n-6) est le principale AGPI dérivant de l'acide linoléique.

L4 18:2n6 i

Elongase

I Élongase (

22:5n3

J É/A6/P-OX J

DPA 22:5n6

22:6n3 DHA

Le métabolisme des deux familles d'acides gras polyinsaturés suit deux voies parallèles et fait intervenir les mêmes enzymes, de sorte qu'il y a une compétition pour le substrat, notamment pour la A6 désaturase. Cette compétition métabolique entre les deux familles va impliquer « un effet de balance énergétique » (Guesnet et a l , 2005). Ainsi ce n'est que dans le cas d'une carence en apport en oméga-3 (DHA) que la biosynthèse de la famille oméga-6 se poursuivra jusqu'à l'acide docosapenténoïque (DPA, 22 : 5 n-6). Dans le cas d'un apport alimentaire équilibré, la biosynthèse des oméga-6 s'arrêtera à l'acide arachidonique.

L'activité de la A6 désaturase est une étape clef dans la synthèse des AGPI. L'affinité de cette enzyme pour l'acide a-linolénique est en effet nettement plus importante de sorte qu'il existe un rapport optimum n-6/n-3, permettant une bonne conversion des acides gras essentiels (Schmitz et Ecker, 2008). Cependant, les avis divergent concernant la valeur idéale de ce ratio. Simopoulos (2000) a montré qu'un ratio AL/ALA de 4 pour 1 correspondait à un optimum. D'autres auteurs recommandent plutôt un rapport n-6/n-3 de 6 : 1 (Galli et Marangoni, 1997; Wijendran et Hayes, 2004).

La première partie du métabolisme des AGPI menant à la synthèse des acides gras AA et EPA se déroule dans le reticulum endoplasmique de la cellule et fait intervenir de manière séquentielle deux désaturases (A6 et A5) et une élongase. À la suite d'une nouvelle série d'elongations et de désaturations conduisant à la formation de précurseurs en C24, une ultime étape de P-oxydation dans les peroxysomes va permettre la synthèse du DHA (n-3) et du DPA (n-6) (Guesnet et a l , 2005). Certains acides gras comme l'acide dihomo-y-linolénique (20 : 3 n-6, DGLA), l'AA ainsi que l'EPA vont servir de précurseurs aux voies des cyclo-oxygénases (COX) et des lipoxygenases (LOX) conduisant à la synthèse de puissants médiateurs actifs des réponses immunitaires humorale et cellulaire, les eicosanoïdes (Drevon et a l , 1995; Benatti et a l , 2004; Guesnet et al, 2005). La voie des COX va permettre la synthèse des prostaglandines (PG), des prostacyclines (PGI) et des thromboxanes. La voie des LOX mène à la production des leucotriènes (LT) et de dérivées d'acides gras hydropéroxydés. Ainsi les séries 1, 2, 3 des PG et 3, 4, 5 des LT vont dériver respectivement des acides gras DGLA, AA et EPA.

2.2.5 Les différents rôles des acides gras dans la semence

Les acides gras sont des composés naturels de la semence. Ils jouent un rôle dans la structure membranaire des spermatozoïdes, mais aussi dans le métabolisme énergétique et le processus de fécondation (Hartree et Mann, 1960; Poulos et a l , 1973a; Wathes et al, 2007).

2.2.5.1 Rôle structural : la membrane plasmique

2.2.5.1.1 Généralités

Dans les années 70, le modèle de la mosaïque fluide fut proposé pour expliquer la structure des membranes cellulaires (Singer et Nicolson, 1972). Ce modèle décrit à la fois la composition hétérogène des membranes et leur comportement dynamique. De manière simplifiée, la membrane plasmique d'une cellule est organisée en une bicouche lipidique asymétrique à laquelle sont associées des protéines et glycoprotéines (trans- et péri-membranaires). La bicouche lipidique détermine la structure de base de la membrane et constitue une barrière imperméable aux molécules solubles. Les protéines sont quant à elles responsables de la majorité des fonctions membranaires (récepteur, transporteur, enzyme, protéine de liaison).

La composition lipidique des membranes plasmiques comprend trois classes majeures : les phospholipides, les sterols et les sphingolipides (Pomorski et al, 2001). Les phospholipides qui englobent la phospatidylcholine (PC), la phosphatidyléthanolamine (PE), la phosphatidylsérine (PS) et la phosphatidyinositol (PI), sont les composés principaux des membranes. Leur distribution dans la membrane plasmique, en raison d'un mouvement de « flip-flop » entre les deux feuillets, est asymétrique : la PC va se retrouver préférentiellement dans le feuillet externe alors que la PS, la PE et la PI vont être au niveau du feuillet cytoplasmique de la cellule (Quinn, 2002). Le cholestérol, sterol prédominant des membranes, est présent en quantité équivalente entre les deux couches et module la fluidité membranaire en interagissant avec les phospholipides (Zachowski, 1993).

Dans le milieu des années 90, la découverte de l'existence de microdomaines membranaires spécialisés (radeaux et calveolae), impliqués dans la transduction de signaux cellulaires et modelés par la diffusion latérale des lipides, a permis d'affiner le modèle de la mosaïque fluide. Ainsi la membrane plasmique est organisée non seulement sur un plan transversal mais aussi latéral (Simons et Ikonen, 1997; Simons et Toomre, 2000).

2.2.5.1.2 La membrane du spermatozoïde

La membrane du spermatozoïde possède une structure classique de membrane plasmique. Sa composition lipidique est cependant toute particulière. Malgré les variations inter-espèces, les proportions des différentes classes de lipides membranaires sont généralement : 70 % de phospholipides, 25 % d'acides gras neutres et 5 % de glycolipides (Flesch et Gadella, 2000).

La membrane du spermatozoïde est principalement composée de glycérophospholipides (PC et PE), de sphingomyéline (SPM) et de cholestérol (Parks et Lynch, 1992; Ladha, 1998). La PC est la fraction prédominante tandis que SPM forme 10-15% des lipides totaux du spermatozoïde. Les fractions PS et PI sont également présentes mais à de plus bas niveaux (Nikolopoulou et al, 1985, 1986; Parks et Lynch, 1992).

La composition phospholipidique du spermatozoïde varie selon les espèces. Ainsi en comparant les spermatozoïdes du taureau et du verrat, Parks et Lynch (1992) notent que ce dernier contient de grandes quantités de PE et SPM mais moins de PC. De plus, chez le spermatozoïde du porc, la répartition du cholestérol entre les deux feuillets membranaires est asymétrique, avec une préférence pour le feuillet externe. Parks et Lynch (1992) ont noté que le rapport cholestérol/phospholipides est plus bas chez le porc que chez d'autres espèces : 0,26 contre 0,45 chez le taureau et 0,36 chez le bélier. Ces auteurs rapportent également que le ratio protéines/phospholipides est élevé chez le porc : 1,26 pour le verrat contre 0,80 pour le bélier et le taureau. Cette composition lipidique particulière confère une grande fluidité et flexibilité à la membrane plasmique, fluidité liée à la présence de nombreuses doubles liaisons (Stubbs et Smith, 1984).

Le rapport AGsaturés/AGjnsaturés,tout comme les ratios cholestérol/phospholipides, PE/PC,

SPM/PC, sont autant d'indices utilisés pour indiquer une modification de la fluidité membranaire (Ladha, 1998). Une diminution de l'un de ces ratio indiquera une augmentation de la fluidité, comme cela est observé lors de la maturation épididymaire (Poulos et a l , 1975; Nikolopoulou et al, 1985).

Johnson et al. (1972) ont montré que 10 acides gras (14 : 0, 16 : 0, 18 : 0, 20 : 0, 22 : 0, 18:1 n-9, 18:2 n-6,20 : 4 n-6,22 : 5 n-6 et 22 : 6 n-3) constituent plus de 90 % des acides gras totaux trouvés dans les spermatozoïdes. Comme les cellules des testicules, mais contrairement à celles d'autres tissus, les spermatozoïdes contiennent de fortes proportions d'acides gras polyinsaturés à longues chaînes. Les acides gras de type n-3 et n-6 représentent à eux seuls plus de 60 % des acides gras totaux retrouvés dans le spermatozoïde (Maldjian et a l , 2003). Les AGPI majeurs sont les acides arachidonique (20 : 4n-6), docosapentanoïque (22 : 5n-3) et docosahexaénoïque (22 : 6n-3) tandis que les acides gras palmitique (16 : 0) et stéarique (18 : 0) sont les acides gras saturés les plus représentés dans la membrane du spermatozoïde (Johnson et al, 1969; Rejraji et al, 2009).

De plus il est intéressant de noter que la nature et les proportions de certains AGPI membranaires spécifiques vont varier entre les espèces animales (Tableau 2.7). Ainsi, le DHA (n-3) est l'acide gras majoritaire chez le taureau et le bélier. À l'inverse, le DPA (n-6) est présent en très grandes quantités chez le chien et le lapin. Chez le verrat, cette composition lipidique est plus équilibrée avec 25-28 % de DPA et 30-38 % de DHA (Penny et al, 2000; Rooke et al, 2001; Maldjian et al, 2003).

Tableau 2.7 : Les acides gras majeurs (en pourcentage des acides gras totaux) des spermatozoïdes de plusieurs espèces animales (Adapté de Maldjian et al, 2003).

AL AA DPA DHA Volume éjaculé Espèce 1 8 : 2 n_ 6 2 0 : 4 n-6 2 2 : 5 n-6 22: 6n-3 (ml) Verrat 2,1 3,2 27,9 37,7 150-400 Taureau 3,0 3,3 6,9 55,4 6-8 Bélier 1,7 4,5 nd 61,4 1-2 Coq 1,8 6,2 1,0 2,3 0,1-0,8 Homme 1,8 2,5 nd 58,7 3-5 Chien 3,2 6,6 28,4 3,9 2-14 Lapin 4,8 nd 39,0 nd 0,4-0,6

AL : acide linoléique ; AA : acide arachidonique ; DPA : acide docosapentaénoïque DHA : acide docosahexaénoïque ; nd : non détecté