Facteurs affectant la conservation de la semence

Plusieurs facteurs vont jouer un rôle dans la conservation des spermatozoïdes : certains internes (comme les variations interindividuelles) et d'autres externes (comme la manipulation de la semence et le processus de conservation). La conservation à l'état liquide est influencée principalement par la qualité initiale de la semence, le nombre de spermatozoïdes par doses, le type de dilueur, la durée et les conditions de conservation (Laforest et a l , 1993; Waberski et al, 1994; Johnson et al, 2000). En ce qui concerne la congélation de la semence, outre un effet verrat clairement établi, le dilueur utilisé, le mode de conditionnement et le protocole de congélation sont autant de paramètres qui vont conditionner la qualité de la semence après décongélation.

2.4.3.1 Effet verrat

Il existe des variabilités individuelles en ce qui concerne l'aptitude de la semence de porc à la conservation à l'état liquide (Flowers, 2002; Kommisrud et al, 2002) et à la congélation (Larsson et Einarsson, 1976; Eriksson et Rodriguez-Martinez, 2000b; Medrano et al, 2002; Roca et a l , 2006; Saravia et a l , 2007; Flores et a l , 2008). Ces différences touchent la qualité de la semence, associée principalement à une réduction de la motilité et à la perte des acrosomes (Hammitt et Martin, 1989).

Ainsi, il existe un « effet verrat » qui va influencer la durée de conservation de la semence fraîche et le pouvoir fécondant des spermatozoïdes (Johnson et a l , 1982; Kommisrud et a l , 2002). En revanche, les résultats concernant l'effet de la race sur l'aptitude à la conservation divergent (Kommisrud et al, 2002). Comme il l'a été rapporté chez certains oiseaux et mammifères (Larsson et Einarsson, 1976; Parkinson et Whitfield,

1987; Waterhouse et a l , 2006; Blesbois, 2007; Arangasamy et al, 2008), il existe également chez le porc des différences entre les individus en ce qui concerne la qualité de la semence congelée (Rath et a l , 2009). De plus, il a été observé qu'un même animal pouvait produire des éjaculats de qualité variable (Flores et a l , 2008). Des différences entre les races pour la qualité des spermatozoïdes après décongélation ont également été rapportées (Roca et al., 2006).

Des études récentes présentent l'hypothèse que ces différences interindividuelles seraient principalement d'origine génétique (Thurston et al, 2002; Rath et a l , 2009). D'autres auteurs suggèrent plutôt que ces variations seraient reliées à la composition du plasma séminal (Roca et a l , 2006). Du fait de ces variations entre les individus, un verrat va être qualifié « apte » ou « inapte » à la congélation, selon qu'il produit ou non une semence capable de bien résister à la cryoconservation (Roca et al, 2006; Hernandez et al, 2007b; Rath et al, 2009). Il est rapporté dans la littérature que 20 à 30% des éjaculats sont considérés comme peu aptes à la congélation.

2.4.3.2 Effet de la température

La température de conservation est un facteur particulièrement important. Contrairement à ceux d'autres espèces animales comme l'étalon, les spermatozoïdes de porc sont extrêmement sensibles aux chocs thermiques (Leeuw de et al, 1990; Parks et Lynch,

1992). Une température en dessous de 15°C conduit à des dommages cellulaires irréversibles (intégrité de l'acrosome) et à la diminution de la motilité et de la survie des spermatozoïdes (Althouse et a l , 1998; Johnson et al, 2000).

En revanche, Pursel et al. (1973) ont montré que l'incubation de la semence diluée à une température supérieure à 15°C pendant plusieurs heures améliore la capacité des spermatozoïdes à résister à un brusque changement de température. Plusieurs études (White, 1993; Watson, 1996; Rath et al, 2009) ont relié cette vulnérabilité à la composition de la membrane plasmique et plus particulièrement au rapport cholestérol/phospholipides et

au ratio I AGjnsaturés/ £ AGsaturés-

2.4.3.2.1 Conservation en milieu liquide

La température idéale de conservation de la semence à l'état liquide doit être suffisante pour limiter l'activité des spermatozoïdes tout en maintenant leur survie et leur aptitude à la fécondation. L'optimum de conservation de la semence porcine se situe entre 15 et 18°C (Almond et al, 1994; Johnson et al, 2000).

2.4.3.2.2 Congélation et décongélation

La congélation mais surtout la décongélation ont un impact particulièrement néfaste sur l'intégrité structurelle et fonctionnelle de la membrane du spermatozoïde. La formation de cristaux de glace et le stress osmotique sont les deux principaux facteurs impliqués dans les dommages liés à la cryoconservation (Watson, 2000). La cryoconservation affecte la motilité et l'intégrité membranaire ; elle va générer une augmentation de la peroxydation lipidique ainsi qu'une diminution du cholestérol et des AGPI membranaire associé à l'augmentation du nombre de spermatozoïdes ayant subi la réaction acrosomiale (Cerolini et al, 2001; Maldjian et a l , 2005).

2.4.3.3 Effet de la composition du dilueur

In vitro, outre la température de conservation, le dilueur joue un rôle clef dans la diminution du métabolisme cellulaire du spermatozoïde et dans la survie du gamète mâle (Weitze et Petzoldt, 1992; Johnson et al, 2000).

2.4.3.3.1 Conservation en milieu liquide

La survie de la cellule spermatique dépend directement de la composition de son milieu environnant. In vivo, cette survie est assurée, entre autres, par les enzymes antioxydantes (GPX et SOD) et les protéines épididymaires (lactoferrine, CTP/HE1, clusterine) qui composent le fluide épididymaire. In vitro, un dilueur, pour être efficace, doit être un milieu capable de fournir les nutriments indispensables au maintien du métabolisme des spermatozoïdes, de tamponner le milieu, d'éviter les variations de pH, d'assurer un équilibre ionique et osmotique et d'inhiber le développement bactérien (Paquignon et al, 1988; Johnson et a l , 2000; Gadea, 2003).

Il existe un très grand nombre de dilueurs commerciaux différents (Tableau 2.10). Ceux- ci se divisent en deux groupes : les dilueurs de conservation « à courts termes » (moins de 3jours de conservation) et les dilueurs de conservation «à longs termes» (4jours de conservation et plus) (Gadea, 2003).

Le dilueur Beltsville-Thawing-Solution (BTS), développé par Pursel et Johnson (1975), est le plus couramment utilisé en IA (Tableau 2.11). Ce milieu est essentiellement une solution saline qui contient du glucose (source d'énergie), du citrate de sodium et du bicarbonate de sodium (tamponnent le milieu), de l'EDTA (chélateur d'ions divalents dont Ca ). Des antibiotiques, inhibant la prolifération bactérienne, peuvent être aussi ajoutés au dilueur.

Tableau 2.10 : Classification de différents dilueurs utilisés pour la conservation de la semence fraîche (Tiré de Gadea, 2003)

Conservation à court terme Conservation à long terme Beltsville-TS (BTS)

Illinois Variable Temperature (IVT) Kiev Vital i Acromax Androhep® Modena MR-A® MULBERRY III* X-Cell® Zolesco ZORPVA Gédil®

Tableau 2.11 : Composition chimique du dilueur BTS (Tiré de Pursel et Johnson, 1975) Produits g.L' Glucose 37 Citrate de sodium 6,0 EDTA 1,25 Bicarbonate de sodium 1,25 KC1 0,5 Osmolarité = 330 mOsm ; pH = 7,2

2.4.3.3.2 Congélation

Outre les caractéristiques propres à tout dilueur pour semence, les dilueurs utilisés en congélation doivent avoir une capacité à protéger les cellules des dommages liés à la congélation. Plusieurs dilueurs sont aujourd'hui disponibles pour la congélation de la semence de porc. Ils contiennent principalement un agent cryoprotecteur, du sucre, des protéines et des additifs (Paquignon et a l , 1988; Johnson et al, 2000; Barbas et Mascarenhas, 2009).

Il existe de nombreux agents de cryoprotection potentiels. Cependant, le glycerol reste le cryoprotecteur de choix pour le spermatozoïde (Johnson et al, 2000; Curry, 2007). Les dilueurs de congélation combinent en fait un cryoprotecteur non-perméable (lait ou jaune d'œuf) avec un cryoprotecteur perméable (glycerol ou DMSO) (Barbas et Mascarenhas, 2009). L'action protectrice du jaune d'œuf n'a toujours pas d'explication satisfaisante. Buhr et al. (1994) ont constaté au cours de la congélation un transfert efficace de phosphatidylcholines entre le dilueur et la membrane des spermatozoïdes. De plus, les concentrations de glycerol employées en congélation de semence sont généralement faibles (inférieures 4 %) du fait de la toxicité potentielle de cette substance (Buhr et a l , 2001; Gutierrez-Perez et a l , 2009).

Pour la semence de verrat, le dilueur de congélation contient en général 20 % de jaune d'œuf et 2 % de glycerol. Il a été également montré que certains additifs comme le détergeant synthétique Orvus Es Paste (ou Equex STM) améliore la préservation des cellules (Graham et a l , 1971; Pursel et a l , 1978; Buranaamnuay et al, 2009). Certains auteurs soulignent que l'ajout de vitamine E (200 pg/ml) au dilueur permet de prévenir les dommages oxydatifs dus à la congélation (Pena et a l , 2004; Breininger et a l , 2005; Jeong et a l , 2009). D'autres antioxydants comme le BHT, la catalase et la SOD peuvent aussi améliorer la survie des spermatozoïdes après congélation (Grobfeld et a l , 2008). L'addition combinée de certains lipides (phospholipides PE, PS, PI + Sphingomyéline) et d'a-tocophérol au dilueur de conservation permet également d'améliorer la qualité des spermatozoïdes congelés (Merkies et al, 2003).

L'ajout au milieu d'acide gras DHA a été également suggéré. Cependant, l'impact positif de cette supplementation sur la qualité de la semence après décongélation n'est pas évident. Contrairement à Maldjian et al. (2005), Kaeoket et al. (2008) notent que l'enrichissement du dilueur en DHA permettrait d'augmenter la motilité et l'intégrité membranaire des spermatozoïdes après décongélation.

2.4.3.4 Autres facteurs

2.4.3.4.1 Effet de la centrifugation

La manipulation de la semence comme la centrifugation des spermatozoïdes a un impact direct sur la qualité. Plusieurs auteurs rapportent en effet que la force centrifuge affecte la qualité et donc la survie des cellules lors de leur conservation (Salamon, 1973; Carvajal et a l , 2004; Gosalvez et a l , 2004).

2.4.3.4.2 Effet de dilution

Mann (1964) a été le premier à souligner l'impact de la dilution de la semence sur la motilité, le métabolisme et le pouvoir fécondant. Ainsi, une dilution excessive des spermatozoïdes s'accompagne d'une augmentation transitoire de leur activité suivit d'une diminution de leur motilité, d'une augmentation des dommages membranaires et d'une importante chute de la viabilité cellulaire (Maxwell et Johnson, 1999; Johnson et al., 2000). 2.4.3.4.3 Effet du plasma séminal

Les opinions sont encore aujourd'hui partagées sur l'ajout ou non du plasma séminal au dilueur. Chez le porc, Hernandez et al. (2007a) ont souligné l'effet protecteur du plasma séminal au cours de la congélation. De même chez le taureau, Garner et al. (2001) ont trouvé un impact positif de l'ajout du plasma séminal au dilueur de conservation. À l'inverse, Bergeron et al. (2004) ont montré l'effet néfaste de l'ajout du plasma séminal. Cet impact négatif a été également rapporté chez l'étalon, le bouc, le rat et la dindon (Douard et al, 2005; Love et al, 2005; Akcay et al, 2006; Purdy, 2006).

Chez le porc, la présence du plasma séminal semble améliorer la motilité et la survie des spermatozoïdes lors de leur conservation (Kommisrud et al, 2002; Saravia et al, 2009). Cependant selon certains auteurs alors que la présence du plasma séminal avant la congélation a des conséquences néfastes pour les spermatozoïdes, son ajout après congélation améliorerait leur survie (Vadnais et al, 2005; Okazaki et a l , 2009). Ces variations dans les résultats s'expliquent par le fait que le plasma séminal contient des composés qui vont à la fois activer et inhiber la capacitation, stimuler la motilité et protéger le spermatozoïde au cours de sa conservation (Maxwell et a l , 2007).