Évaluation de la qualité

L'évaluation de la qualité des spermatozoïdes est importante en insémination porcine (Tableau 2.9). Classiquement, des paramètres séminaux quantitatifs (volume de l'éjaculat, concentration et nombre total de spermatozoïdes) et qualitatifs (motilité progressive, morphologie et viabilité des spermatozoïdes) sont analysés (Colenbrander et Kemp, 1990). Cependant, avec l'avancée des connaissances et le développement de nouvelles technologies, d'autres tests ont fait progressivement leur apparition : sondes de vitalité et d'intégrité de l'acrosome, test de résistance osmotique (ORT), mesure de l'ATP, fécondation in vitro (FIV), etc. (Glossop, 1996; Gadea, 2005). Il- est important de noter que l'ensemble des différents critères de qualité cités ci-après, s'ils sont pris individuellement, n'offre pas une parfaite corrélation avec la fertilité. L'évaluation de la qualité de la semence s'appuie en fait sur une série de critères qui, pris dans leur ensemble, permettent de caractériser l'éjaculat.

Tableau 2.9 : Paramètres et méthodes d'analyse de la qualité de la semence

Paramètre analysé Méthode d'analyse

Concentration Motilité Morphologie

Technique spectrophotométrique, Compteur cellulaire électronique

Evaluation au microscope, analyse automatisée de la motilité (CASA)

Techniques de coloration, fixation avec solution formolée Vitalité Intégrité de la membrane plasmique Intégrité de l'acrosome Intégrité de l'ADN Évaluation du contenu énergétique (ATP)

Évaluation des fonctions des cellules

Techniques de coloration, emploi de fluorophores Sondes fluorescentes (SYBR-14/PI), test HOST Sondes fluorescentes : Lectine marquée

(ex : FITC-PNA)

Sondes fluorescentes : Acridine orange (SCSA), essai TUNEL

Dosage, sonde fluorescente (Rhodamine 123) Test de résistance osmotique (ORT)

Volume de l'éjaculat et concentration spermatique : Le volume de semence est généralement mesuré par une pesée de l'éjaculat (1 ml de semence correspond à 1 g). La méthode la plus répandue pour mesurer la concentration en spermatozoïdes est celle de l'emploi combiné d'un spectrophotomètre avec un hémacytomètre ou une chambre de comptage des cellules (Almond et a l , 1994).

Motilité : Ce paramètre fournit une indication sur la viabilité des spermatozoïdes. Même s'il n'existe pas de corrélation exacte entre la motilité et la fertilité (Linford et a l , 1976; Flowers, 1997), ce critère de qualité est fréquemment utilisé dans les analyses de laboratoire. Il s'appuie sur une évaluation visuelle des spermatozoïdes soit sous microscope soit par vidéo-micrographie assistée par ordinateur ou CASA (Computer Assisted Semen Analysis) du pourcentage de cellules motiles (Foxcroft et a l , 2008). En pratique, un éjaculat de bonne qualité est défini avec une motilité individuelle supérieure à 85 % (Pelaez et al, 1999).

Morphologie : Selon certains auteurs, ce critère donne, à partir de l'évaluation de la proportion des spermatozoïdes normaux et anormaux de l'éjaculat (Figure 2.8), une information fiable sur la viabilité des cellules et la fertilité du mâle (Colenbrander and Kemp, 1990). Plusieurs techniques existent pour l'évaluation de la morphologie (Colenbrander et Kemp, 1990; Glossop, 1996; Foxcroft et a l , 2008) : coloration vitale avec l'éosine-nigrosine ou le bleu trypan, la fixation des cellules dans une solution de formol ou de glutaraldéhyde et l'observation en microscopie optique, ou encore l'analyse avec un CASA. L'essai de liaison de l'ubiquitine permet plus précisément d'évaluer le pourcentage de spermatozoïdes anormaux présentant des gouttelettes cytoplasmiques (Kuster et a l , 2004). Glossop (1996) indique que la proportion de spermatozoïdes anormaux ne doit pas dépasser 30 % pour que l'insémination soit réussie. Sur le terrain, un éjaculat présentant plus de 15 % de spermatozoïdes anormaux sera le plus souvent écarté (Pelaez et a l , 1999).

Spermatozoïdes normaux

Anomalies de la tête Mort

(coloré)

Spermatozoïdes sans queue

5 0

Anomalies de la queue

Gouttelettes cytoplasmiques

Gouttelette >. / / Gouttelette Proximale — \ \ /—/ / I f ~ " Distale

Vitalité spermatique : Des colorations des cellules à l'éosine-nigrosin ou au bleu trypan (Blom, 1950), l'utilisation de sondes fluorescentes comme SYBR14/PI (Garner and Johnson, 1995) et le test de « gonflement hypoosmotique » ou HOST (Hypo-osmotic swelling test) (Vazquez et a l , 1997) sont autant de méthodes d'analyse habituellement utilisées pour évaluer la vitalité des spermatozoïdes. Une semence est considérée de bonne qualité lorsqu'elle contient moins de 25 % de cellules mortes (Pelaez é t a l , 1999).

Intégrité de l'acrosome: L'intégrité de l'acrosome est un paramètre important dans la réussite de la fécondation. Les spermatozoïdes peuvent être fixés dans une solution de glutaraldéhyde 2 % et observés par microscopie en contraste de phase (Pursel et al, 1972). Une autre méthode de marquage de la vésicule acrosomique repose sur l'utilisation d'une lectine couplée à un fluorochrome (ex: FITC-PSA, FITC-PNA) et permet l'évaluation du statut de l'acrosome des spermatozoïdes (Ashworth et a l , 1995; Jimenez et al, 2002).

Organisation lipidique : Plusieurs méthodes basées sur des marqueurs membranaires comme la chlorotétracycline (CTC), la mérocyanine 540 (M540) ou l'annexin V peuvent être également utilisées pour déterminer les réarrangements phospholipidiques de la membrane plasmique (Silva et Gadella, 2006).

Peroxydation lipidique : Plusieurs méthodes ont été développées pour évaluer la peroxydation lipidique notamment par la méthode du TBAR et la mesure de la formation du malonaldehyde (MDA) (Storey, 1997). Plus récemment une nouvelle méthode de cytometric de flux se basant sur les propriétés de CnBODIPY581/591 a

Structure de l'ADN : Il s'agit d'estimer les dommages causés à l'ADN. Plusieurs techniques peuvent être utilisées pour évaluer la stabilité de l'ADN et de la chromatine : l'essai Cornet, l'essai TUNEL (transferas mediated dUTP nick-end labelin), le SCSA (sperm chromatin structure assay) et le test de dispersion de la chromatine (Gilian et a l , 2005; Foxcroft et al, 2008).

Analyses biochimiques : Les concentrations de metabolites intracellulaires, comme le contenu cellulaire en ATP, peuvent être mesurées selon une technique de bioluminescence ou avec un marquage avec des fluorochromes comme la rhodamine 123 ou JC-1 (Evenson et a l , 1982; Januskauskas et Rodriguez-Martinez, 1995; Garner et a l , 1997; Graham et Moca, 2005).

Test de résistance osmotique (ORT) : Ce test évalue la résistance des membranes spermatiques à un choc osmotique (Rigau et a l , 1995). Schilling et Vengust (1987) rapportent qu'il existe une importante corrélation entre ce test et la fertilité des spermatozoïdes. De plus, l'index osmotique chez le verrat apparaît relativement constant et joue un rôle important dans la préparation de doses hétérospermiques utilisées pour l'insémination (Pelaez et al, 1999).

Test de fécondation in vitro (FIV) : Ces essais permettent d'évaluer le pouvoir fécondant du spermatozoïde (Pelaez et a l , 1999; Foxcroft et a l , 2008). Ainsi plusieurs tests in vitro (SPA, FIVh) vont évaluer la capacité du spermatozoïde à se lier à la zone pellucide, à la pénétrer ou encore à se lier et à féconder l'ovocyte (Berger et al, 1996; Braundmeier et al, 2004; Ruiz-Sanchez et a l , 2006).