Implication du récepteur ST2 de l'alarmine interleukin-33 dans le phénomène d'ischémie/reperfusion rénale : étude de l'influence d'un environnement hyperglycémique

Pour l'obtention du grade de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE POITIERS UFR de médecine et de pharmacie

Ischémie reperfusion en transplantation d’organes mécanismes et innovations thérapeutiques -IRTOMIT (Poitiers)

(Diplôme National - Arrêté du 25 mai 2016) École doctorale : Biologie-santé - Bio-santé (Limoges)

Secteur de recherche : Recherche clinique, innovation thérapeutique, santé publique

Présentée par : Mohammed Sehnine

Implication du récepteur ST2 de l'alarmine interleukin-33 dans le phénomène d'ischémie/reperfusion rénale : étude de

l'influence d'un environnement hyperglycémique Directeur(s) de Thèse :

Samy Hadjadj, André Herbelin

Soutenue le 15 décembre 2016 devant le jury

Jury :

Président Jean-Marc Gombert Professeur et praticien hospitalier, Université de Poitiers Rapporteur Ronan Roussel Professeur et praticien hospitalier, Université Descartes, Paris Rapporteur Pierre Gourdy Professeur et praticien hospitalier, IC2M, Université de Toulouse Membre Samy Hadjadj Professeur et praticien hospitalier, Université de Poitiers

Membre André Herbelin Directeur de recherche, IRTOMIT, Université de Poitiers Membre Vincent Rigalleau Professeur et praticien hospitalier, Université de Bordeaux

Pour citer cette thèse :

Mohammed Sehnine. Implication du récepteur ST2 de l'alarmine interleukin-33 dans le phénomène

d'ischémie/reperfusion rénale : étude de l'influence d'un environnement hyperglycémique [En ligne]. Thèse

Recherche clinique, innovation thérapeutique, santé publique. Poitiers : Université de Poitiers, 2016. Disponible sur Internet <http://theses.univ-poitiers.fr>

THESE

DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE POITIERS

(Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006) École Doctorale : Biologie-Santé N° 524

Secteur de Recherche : Recherche clinique, innovation thérapeutique, santé publique Présentée par :

Mohammed SEHNINE

Implication du récepteur ST2 de l’alarmine interleukin-33

dans le phénomène d’ischémie/reperfusion rénale : étude de

l’influence d’un environnement hyperglycémique

Directeur de thèse : Pr. Samy HADJADJ Co-Directeur de thèse : Dr. André HERBELIN

************************

Soutenue le 15 décembre 2016 devant la Commission d’Examen ************************

JURY

Pr. Ronan ROUSSEL PU-PH (HDR), Centre de recherche des Cordeliers / Bichat, PARIS Rapporteur Pr. Pierre GOURDY PU-PH (HDR), CHU / IC2M, Toulouse Rapporteur Pr. Vincent RIGALLEAU PU-PH (HDR), CHU Haut Leveque, Université Bordeaux Examinateur Pr. Jean-Marc GOMBERT PU-PH (HDR), INSERM– U 1082, Université Poitiers Examinateur Pr. Samy HADJADJ PU-PH (HDR), INSERM– U 1082, Université Poitiers Directeur de thèse Dr. André HERBELIN Docteur Inserm, INSERM– U 1082, Université Poitiers Co-Directeur de thèse

Remerciements

Je tiens tout d’abord à adresser mes plus sincères remerciements aux rapporteurs de ce travail : À Monsieur le Professeur Ronan ROUSSEL

PU-PH Centre de recherche des Cordeliers INSERM-UMR1138 Service d’Endocrinologie Diabétologie Nutrition — Hôpital Bichat PARIS

&

À Monsieur le Professeur Pierre GOURDY

PU-PH en Endocrinologie, Diabète et Maladies Métaboliques — IC2M Faculté de Médecine — Université Toulouse 3

MERCI à vous deux de m’avoir accordé de votre temps précieux pour évaluer ce travail et pour vous rendre à Poitiers afin d’assister à ma soutenance de thèse. MERCI par avance pour les commentaires avisés que vous ne manquerez pas d’apporter à ce travail, et qui, j’en suis sûr, contribueront grandement à son amélioration.

Je tiens à remercier tout particulièrement,

Monsieur le Professeur Vincent RIGALLEAU

PU-PH Endocrinologie-Nutrition, USN, hôpital Haut-Lévêque Université Bordeaux

&

Monsieur le Professeur Jean-Marc GOMBERT

PU-PH Service d’immunologie & U1082 - UFR médecine - Pole Biologie Santé Université de Poitiers

Vous me faites le très grand honneur de faire partie du jury de cette thèse et de juger mon travail. Veuillez recevoir l’expression de ma sincère gratitude et de mon profond respect.

Ce travail a été effectué au sein de laboratoire Inserm U1082 : Ischémie Reperfusion en Transplantation d’Organes Mécanismes et innovations thérapeutiques, sous la direction du professeur Samy HADJADJ, et docteur Nicolas CHATAURET dans un premier temps puis du docteur André HERBELIN.

À Monsieur le Professeur Thierry HAUET Professeur des universités, Praticien Hospitalier

Directeur du laboratoire U1082

Je tiens à vous témoigner ma très vive reconnaissance pour la confiance que vous m’avez accordée en m’accueillant au sein de votre laboratoire. Je vous prie de croire en ma gratitude pour vos conseils scientifiques éclairés, votre disponibilité et l’amour de la science que vous savez communiquer.

À Monsieur le Professeur Samy HADJADJ Professeur des universités, Praticien Hospitalier

Pour son encadrement tout au long de ces 3 années et pour son soutien sans faille. Je tiens tout particulièrement à t’exprimer ma profonde gratitude et mon admiration. Ta gentillesse, ta patience, ta rigueur, et ton humanité sont autant de qualités rares dans le monde qui nous entoure. Grâce à toi j’ai beaucoup appris tant sur les plans professionnels que personnel. MERCI Samy, « Tu resteras un exemple pour moi ». Je garderai longtemps en mémoire nos longues discussions scientifiques qui m’ont permis de mener à bien ce projet. Cela a été pour moi un immense honneur de travailler avec toi je te souhaite le meilleur et plus encore pour la suite.

À Monsieur le Docteur André HERBELIN Directeur Inserm

Service d’immunologie & U1082 - UFR médecine - Pole Biologie Santé

Pour son encadrement tout au long de 2 années de cette thèse et pour ses conseils scientifiques éclairés à chaque étape de la réalisation de ce travail. MERCI André, pour ta gentillesse, ta disponibilité et tes innombrables relectures. Merci surtout d’avoir réussi à communiquer un peu de ta rigueur scientifique et de tes capacités d’organisation, au thésard désorganisé et étourdi que j’étais, reçois ici l’expression de ma sincère gratitude et de mon plus profond respect.

À Monsieur le Docteur Nicolas CHATAURET PhD

Pour son encadrement de la première année de cette thèse et pour ces multiples compétences, son bon humour, ses conseils techniques qui m’ont aidé à me familiariser avec la vie du laboratoire. MERCI Nico, ça été pour moi un énorme plaisir et un immense honneur de travailler avec toi je te souhaite le meilleur dans ta vie personnelle et professionnelle.

À toute l’équipe du laboratoire Inserm U1082, soyez tous remerciés pour les années enrichissantes que j’ai passé à vos côtés.

À mes collègues du bureau, Sébastien, Vivien, et Isabelle. Vous avez gravé des moments inoubliables dans ma mémoire. Merci pour votre disponibilité, la pertinence de vos conseils et surtout pour votre humour à toute épreuve. J’ai beaucoup aimé tes blagues isabelle.

Pour mes voisins de l’autre côté du mur, Frédéric, pour tous les conseils et ta compétence scientifique. Sofiane, t’es un véritable frère. Je ne te remercie jamais assez pour tout ce que tu as fait pour moi. Pour tes qualités. À Souleymane, garde toujours ton beau sourire.

A Jacques pour sa bonne humeur « et ce n’est pas comme ça ». Merci pour ta disponibilité, ta patience et tes conseils motivants, je garde notre amitié pour toujours. Patrick notre expert en bio-informatique et modélisation, Merci pour ta gentillesse, et ta qualité humaine.

Je ne remercie jamais assez « ma préférée », Sandrine. Merci pour ton aide précieuse à chaque étape de mon travail, tes multiples compétences et surtout pour ta gentillesse. Sans oublier les techniciennes Virginie, Maité et Ludovic, merci pour conseils techniques et pour les moments. À Christine, je remercie beaucoup ta patience et pour tout le travail que tu fais pour assurer le bon déroulement administratif de l’unité.

Sans oublier l’autre bout de couloir, à Raphaël, pour ces conseils, sa disponibilité et surtout pour tous les bons moments qu’on a passé ensemble autour de la table de la cuisine. À Sandra, pour sa rigueur scientifique, son aide, et sa compétence. Merci Sandra. À sylvain, j’étais bluffé par ta compétence, merci pour ta gentillesse et tes conseils.

À l’équipe de RMN, à Nadège de m’avoir accompagné à l’urgence et être là pour moi, Merci Nadège, pour ta gentillesse. À Delphine et Marianne, énorme merci pour tous les moments qu’on a partagé. L’équipe du service de l’anatomopathologie du CHU, au Professeur Jean-Michel Goujon, Julie et Nathalie pour leur patience, leur disponibilité pour inclure, colorer et m’avoir lu toutes ces lames histologiques. À Sihem, la spécialiste en western blot, je ne te remercie jamais assez pour le soutien, l’aide technique et ta énorme sympathie, je te souhaite le meilleur dans ta vie professionnelle et personnelle (à Adam et Wassim).

L’équipe du PBS, à Maroua merci pour ta sympathie et pour tous ces moments qu’on a passé ensemble dans la salle de la chirurgie en opérant les souris, pour ta disponibilité et pour tes gâteaux, « j’attends toujours la baklawa ». À Aurélie merci beaucoup pour tes encouragements, pour ta compétence technique et pour le temps qu’on a passé ensemble, A Sara pour sa disponibilité, Alice, et Myriam.

Naturellement mes pensées vont :

A mes parents, pour votre amour et votre soutien depuis toujours. C’est sans doute grâce à vous que je fais ce travail. « Que Dieu vous garde et vous protège »

A mon frère Abdellah et sa petite famille, le futur pilote et l’architecte.

« vis comme si tu pouvais mourir demain, travaille comme si tu pouvais vivre à jamais » A mon frère Ibrahim, l’avocat.

A mon frère Zakarya, l’ingénieur en aquaculture. A mes grands-parents, j’aurais aimé que vous soyez là.

A mes amis de longue date, Ahmed N, Nassim D.Y, Ibrahim H. Djamel H. A tous mes amis (es) qui m’ont soutenue dans cette thèse

Table des matières

Résumé ... 1

Abstract ... 2

Liste des abréviations ... 3

Liste des figures & tableaux ... 5

INTRODUCTION ... 10

PREMIÈRE PARTIE : CONTEXTE CLINIQUE ... 10

1. Etat des lieux : ... 11

1.1. Insuffisance rénale terminale : ... 11

1.2. Néphropathie diabétique : ... 11

1.3. Transplantation rénale : un traitement de choix ... 12

2. Choix des donneurs potentiels : ... 13

2.1. Donneur marginal :... 14

2.2. Donneur diabétique : ... 15

2.3. Receveur diabétique : ... 16

DEUXIÈME PARTIE : DONNEES EXPERIMENTALES ET PHYSIOPATHOLOGIQUES ... 17

CHAPITRE (1) : Physiopathologie de l’ischémie reperfusion rénale et réponse immunitaire ... 18

I. Syndrome d’ischémie reperfusion : ... 19

1. Définitions générales : ... 19

1.1. L’ischémie : ... 20

1.2. La reperfusion :... 21

2. Conséquence de l’ischémie reperfusion : ... 21

2.1. Le no-reflow post-ischémique : ... 23

2.2. La production des espèces réactives de l’oxygène (EROs) : ... 25

3. Comportement de la cellule face à l’hypoxie : ... 27

3.1. L’adaptation cellulaire à la variation de l’O2 : Facteur inductible par l’hypoxie (HIFs) .... 28

3.2. Les systèmes de défense oxydants : ... 34

3.3. Les mécanismes de la réparation : ... 36

4. Lésions cyto-histopathologiques induites par l’I/R rénale : ... 38

4.1. La mort cellulaire : ... 38

4.2. La nécrose tubulaire aiguë : ... 43

II. Phénomènes immunitaires et inflammatoires liés à l’I/R: ... 48

1. Lésions d’IR : système immunitaire inné et adaptatif ... 48

1.1. La phase inflammatoire précoce dans les lésions rénales d’I/R :... 49

1.2. La phase inflammatoire tardive dans les lésions rénales d’I/R : ... 63

1.3. La réparation des lésions tubulaires : ... 66

2. Actions proinflammatoires et antiinflammatoires de HIFs : ... 69

2.1. HIFs et l’immunité innée : ... 70

2.2. HIFs et l’immunité adaptative : ... 72

3. Signaux de danger « les alarmines » dans un contexte ischémique : ... 75

3.1. Signaux de danger endogènes : ... 75

3.2. Interleukine-33 (généralité): ... 76

3.3. Contribution d’IL-33 dans les lésions rénales : ... 87

3.4. Relation entre l’expression de l’IL-33 et HIFs : ... 91

CHAPITRE (2) : Phénomènes hypoxiques et immunitaires dans un contexte hyperglycémique ... 93

I. Hyperglycémie, la glycation et complications diabétiques :... 94

1. Hyperglycémie et le stress oxydant : ... 95

1.1. Hyperglycémie aiguë ou transitoire : ... 96

1.2. Hyperglycémie chronique : ... 97

2. Produits de dégradation du glucose intracellulaire : ... 102

2.1. Glycation et formation des AGEs : ... 102

2.2. Conséquences moléculaires et cellulaires de la glycation : ... 106

2.3. Défense cellulaire contre la glycation et les AGEs : ... 112

II. Hyperglycémie et les lésions d’I/R rénales : ... 114

1. Phénomènes hypoxiques liés à l’hyperglycémie : ... 114

1.1. Pseudohypoxie hyperglycémique: ... 114

1.2. Consommation de l’O₂ et complications vasculaires : ... 115

1.3. Transport du glucose : ... 117

1.4. Hyperglycémie et régulation de HIF-1α : ... 119

2. Susceptibilité des lésions d’I/R à l’hyperglycémie ... 126

III. Hyperglycémie et la réponse immunitaire: ... 130

1. Pathogénie du diabète sucré : ... 130

1.1. Diabète type 1 : ... 130

1.2. Diabète type 2 : ... 130

1.3. Néphropathie diabétique (ND) : ... 131

2. Influence de l’hyperglycémie sur la réponse de l’immunité innée : ... 131

2.1. Lymphocyte Th1: ... 136

2.2. Lymphocyte Th2 : ... 137

2.3. Lymphocyte Th17 : ... 137

2.4. Lymphocyte T régulatrice (T-reg) : ... 138

2.5. Lymphocyte T cytotoxique (CD8⁺): ... 138

2.6. Lymphocyte B : ... 139

3. Relation IL-33 et hyperglycémie : ... 139

Objectifs ... 141

Matériels & méthodes ... 142

1. Le choix de l’anesthésie : ... 143

2. Le choix de l’abord chirurgical (dorsal vs ventral): ... 146

3. Le choix de type d’ischémie (unilatéral vs bilatéral) : ... 152

4. La durée de l’ischémie chaude : ... 154

Article soumis ... 156

Discussion générale ... 182

Conclusions & Perspectives ... 188

1

Résumé

La transplantation rénale (TR) est la stratégie thérapeutique de choix pour les insuffisances rénales terminales. L’utilisation de greffons de donneurs à critères étendus, tels les sujets diabétiques, est devenue une nécessité face à la pénurie de greffons, malgré le risque accru de dysfonction du greffon. L’ischémie/reperfusion (I/R) est une étape inhérente à la TR. Le diabète est un facteur de risque pour le développement de lésions rénales aiguës mais les mécanismes d’action mis en jeu restent à élucider. Il existe peu de données expérimentales sur les conséquences délétères du diabète sur les lésions d’I/R rénales. Nous avons fait l’hypothèse que l’IL-33, en tant qu’alarmine, joue un rôle clé au carrefour qui lie l’hyperglycémie à l’I/R.

L’objectif de ce travail a été d’étudier l’effet de la délétion du récepteur ST2 de l’IL-33 sur les lésions d’I/R rénales dans un contexte hyperglycémique. Nous avons utilisé un modèle d’I/R rénale chez des souris transgéniques dépourvues du récepteur ST2. Le diabète type 1 a été induit par la streptozotocine. Nous avons démontré que la délétion du récepteur ST2 a un effet néphroprotecteur en situation euglycémique, suggérant un effet exacerbateur de l’IL-33 sur les lésions d’I/R rénales. Cette protection rénale a été perdue en condition hyperglycémique. L’ensemble de ces résultats suggère que l’IL-33, en tant qu’alarmine, a des effets différentiels en fonction de l’environnement hyperglycémique. Sur le plan clinique, compte tenu de l’impact néfaste du diabète sur le rein, nos résultats conduisent à proposer d’étudier la place de l’IL-33 dans l’inflammation chronique associée au diabète et de ses conséquences sur la fonction rénale.

Mots clés : transplantation rénale, hyperglycémie, euglycémie, ischémie/reperfusion rénale, axe IL-33/ST2, streptozotocine, alarmine, greffon.

2

Abstract

Renal transplantation (RT) is the therapeutic strategy of choice for end-stage renal failure. The use of graft from extended criteria donors, including patients with diabetes, has become mandatory to cope with the shortage of grafts, despite an increased risk of graft dysfunction. Ischemia reperfusion (I/R) is a key step in RT. Diabetes is a risk-factor for the development of acute kidney injury (AKI), which mecanisms are not fully elucidated. Moreover, there are few experimental data on the deleterious effects of diabetes on ischemic AKI. We hypothesized that IL-33, as an alarmin, plays a key role at the crossroads linking hyperglycemia to I/R injury. The objective of this work was to study the effect of the deletion of the ST2 receptor of IL-33 on I/R injury in the context of hyperglycemic environment. We thus used a renal I/R model in transgenic mice lacking the IL-33 receptor (ST2). Type 1 diabetes was induced by streptozotocin. We demonstrated that the deletion of ST2 has a renal protective effect in euglycemic conditions, suggesting an exacerbating effect of IL-33 in renal I/R injury. The protective effect induced by the absence of ST2 was lost in hyperglycemic conditions. Taken together, these findings indicate that IL-33 exerts differential effects depending on hyperglycemia. Clinically, given the deleterious impact of diabetes on the kidney, our results lead to propose to further study the place of IL-33 in chronic inflammation associated with diabetes and its effects on renal function.

Key words: renal transplantation, hyperglycemic, euglycemic, renal ischemia/reperfusion, IL-33/ST2 axis, streptozotocin, alarmin, graft.

3

Liste des abréviations

Adora2a: Adénisine A2A ADP: adénosine diphosphate

AGEs: advanced glycation end product AKI: acute kidney injury

ATP: adenosine triphosphate CAT: Catalase

CBP: CREB-binding protein

CHIP: Carboxyl terminus of Heat-shock protein

70–Interacting Protein

Chre: Carbohydrate response element ChREBP: Carbohydrate response element

binding protein

CKD: Chronic kidney disease

CPA: Cellule présentatrice de l’antigène Crry : Complement receptor 1–related protein y CTGF: connective tissue growth factor

DAMP: Danger Associated Molecular Pattern DC: Dendritic cells

DFG: débit de filtration glomérulaire DT1: diabètes type 1

DT2: diabètes type 2 EndoG: endonucléase-G EPO: Erythropoïétine

EROs: Espèces réactives de l’oxygène FIH: Factor inhibiting HIF

GO: glyoxal

GPx: glutathion peroxydases GST: glutathion s- transférase

HIF-1α: hypoxia inducible factor 1 alpha HMGB1: high-mobility group B1

HRE: Hypoxia responsive element I/R: Ischémie reperfusion

ICAM: intercellular adhesion molecule IFN-γ : interféron gamma

IL-33 : interleukine 33 iNKT : invariant NKT

IRT : insuffusance rénale terminale LRCs: Label-retaining cells

M1: macrophage type 1 M2: macrophage type 2 MGO: methylglyoxal

MIP-2: macrophage inflammatory facteur 2 mPTP : mitochondrial permeability transition

pore).

NAPDH: nicotinamide adénine dinucléotide

phosphate

ND : néphropathie diabétique NF-kb: nuclear factor kappa B NKT: natural killer T

4

NTA: nécrose tubulaire aiguë

O-GlcNAc: O-N-acétylglucosaminylation OH : hème oxygénase

OUU : obstruction urétrale unilatérale

PAMP: Pathogen Associated Molecular Pattern PECAM-1 (platelet endothelial cell adhesion

molecule 1)

PHDs: Prolyl hydroxylase domain-containing

enzymes

PKC: protéine kinase C PLC: phospholipase C

RAGE: Receptor of advanced glycation end

products

S1P3: sphingosine 1 -phosphate3) SGTLs: sodium glucose cotransporters

SOD: superoxyde distamase

ST2:suppression of tumorigenicity 2

STZ : Streptozotocine TCR : T cell receptor

TGF-b: transforming growth factor-b

Th1-2-17: lymphocytes T helper de Type 1-2-17 TLRs: Toll-like receptors

TNF-α: Tumor necrosis factor alpha TR : transplantation rénale

T-reg : T régulatrices

VCAM: vascular cell adhesion molecule VEGF: vascular endothelial growth factor VHL: von Hippel Lindau E

5

Liste des figures & tableaux

Liste des figures :

Figure 1. Schéma des principaux mécanismes moléculaires des lésions rénales aigues induites par une séquence d’ischémie reperfusion. ... 20 Figure 2. Schéma plus détaillé des grands événements pathologiques hémostatiques (No-reflow) et inflammatoires induites par l’ischémie reperfusion et qui contribuent à la mort cellulaire. ... 22 Figure 3. Localisation histologique des péricytes et capacité de régulation du débit en aval des artérioles : exemple sur le contrôle de la circulation sanguine dans le système vasculaire cérébral. . 24 Figure 4. Génération des EROs par la chaine respiratoire mitochondriale au niveau des complexes I et III en tant que principaux générateurs des radicaux libres. ... 27 Figure 5. Schéma de la structure protéique des domaines qui composent α (1α, 2α, HIF-3α, IPAS) et HIF-1β. ... 29 Figure 6. Régulation des HIF-α en normoxie par l’hydroxylation des PHDs et FIH. ... 30 Figure 7. Schéma détaillé sur la régulation de HIF-1α dans les conditions normoxiques et hypoxiques. ... 31 Figure 8. Représentation schématique du mécanisme d’adaptation cellulaire face à l’hypoxie via la stabilisation cytoplasmique de HIF-1α, sa translocation nucléaire, et l’activité transcriptionnelle de ses gènes effecteurs. ... 32 Figure 9. Schéma des principaux gènes régulés directement par HIFs classés en groupes selon leurs fonctions biologiques au niveau rénal. ... 33 Figure 10. Schéma des principaux mécanismes de la mort cellulaire induite par l’ischémie reperfusion : nécrose, nécroptose, apoptose et autophagie. ... 38 Figure 11. Schéma de la voie autophagique. ... 42 Figure 12. Mécanismes physiopathologiques de nécrose tubulaire aiguë induite par ischémie rénale. ... 44

6

Figure 13. Angiotensine (Ang) II stimule l'expression endothéliale du gène HIF-1α et favorise les

lésions rénales, l’hypertension intra-rénale et la progression de la fibrose. ... 47

Figure 14. Représentation schématique du rôle inflammatoire des leucocytes et des rénales dans les lésions rénales aiguës. ... 50

Figure 15. Adhérence et transmigration des leucocytes endothéliales après l’ischémie reperfusion. 51 Figure 16. Trafic des monocytes dans les lésions d’ischémie reperfusion rénale chez la souris... 52

Figure 17. Comparaison entre un rein normal et un rein post-ischémique à travers la présence des cellules inflammatoires dans le tissu. ... 54

Figure 18. Schéma de l’interaction entre les cellules dendritiques, les leucocytes polymorphonucléaires (PMN) particulièrement les neutrophiles, et les cellules NKT. ... 56

Figure 19. Schéma du changement phénotypique des macrophages pendant la progression des maladies rénales aiguës. ... 58

Figure 20. Schéma qui présente la cellule iNKT (invariant natural killer T) et ses propriétés typiques des cellules du système immunitaire inné. ... 61

Figure 21. Schéma de la réponse inflammatoire médiée par les cellules iNKT après l’I/R. ... 62

Figure 22. Schéma du rôle des macrophages (M1 et M2) dans la régulation de l’équilibre des lésions rénales, inflammation, la réparation tissulaire et la fibrose. ... 65

Figure 23. Différents types cellulaires impliquées dans la régénération tubulaire après la lésion tissulaire. ... 67

Figure 24. L’action proinflammatoire et antiinflammatoire de HIFs. ... 70

Figure 25. Voie hypoxique et l’immunité innée. ... 71

Figure 26. Voie hypoxique et l’immunité adaptative (Différenciation et fonction des cellules T). ... 73

Figure 27. Différents stimuli sont à l’origine des lésions cellules, telles que les cellules épithéliales. . 76

Figure 28. Représentation schématique de la protéine IL-33... 78

Figure 29. Liaison de l’IL-33 à son récepteur T1/ST2. ... 81

Figure 30. Représentation des complexes de récepteurs à l’IL-33. ... 82

7

Figure 32. Structure des protéines IL-33 humaine et murine. ... 86

Figure 33. Schéma de la séquence temporelle des événements de lésion rénale aiguë induite par cisplatine. ... 88

Figure 34. Caractéristiques générales des lésions tissulaires induites par l'hyperglycémie. ... 95

Figure 35. L’insulino-résistance provoque une surproduction mitochondriale d’EROs dans les cellules endothéliales macrovasculaires en augmentant le flux des acides gras libres (FFA) et l’oxydation. ... 98

Figure 36. Différentes voies du métabolisme du glucose qui conduisent à l’activation de la protéine kinase C (PKC) et du facteur de croissance (TGF-β) ... 99

Figure 37. Séquence d’événements induite par les AGEs et le glucose. ... 101

Figure 38. Voies biochimiques pour la formation AGEs... 103

Figure 39. Réaction de Maillard et la formation chimique des différents AGEs. ... 105

Figure 40. Mécanisme de signalisation intracellulaire de récepteur RAGE activé par AGEs. ... 109

Figure 41. Schéma comparatif d’un rein normal et diabétique. ... 116

Figure 42. Schéma la réabsorption du sodium-glucose dans les cellules de l’épithélium tubulaire proximal. ... 118

Figure 43. Représentation schématique des modèles proposés pour la régulation négative de HIF-1 dans des conditions diabétiques. ... 123

Figure 44. Voie de signalisation impliquée dans la lipogenèse et la fibrose induite ChREBP dans les cellules mésangiales en glucose élevé. ... 125

Figure 45. Cascade métabolique liant ADAM17 et les gènes de fibrose au niveau glomérulaire, en situation d’hyperglycémie. ... 125

Figure 46. Mécanisme d'amélioration de l'ischémie reperfusion rénale via la surexpression de la glyoxalase I (Glo-I). ... 129

Figure 47. Séquence des événements démontrant les lésions inflammatoires dans le rein lors de la progression de la néphropathie diabétique. ... 133

Figure 48. Signalisation de TLR-2 et TLR-4 dans le rein diabétique. ... 134

8

Figure 50. Lieux d'incision dorso-lombaire chez la souris. ... 148

Figure 51. Exposition des deux reins pour une ischémie bilatérale par voie dorso-lombaire chez la souris. ... 149

Figure 52. Exposition de rein droit par voie vontro-médiane chez la souris. ... 150

Figure 53. Etude comparative des abords (dorsal vs ventral) chez la souris C57BL/6 sauvage. ... 151

Figure 54. Clampage bilatéral via un abord dorsal. ... 153

Figure 55. Clampage du pédicule rénal. ... 153

Figure 56. Etude comparative de type d’ischémie chaude (unilatérale vs Bilatérale) chez la souris C57BL/6 sauvage. ... 153

Figure 57. Choix de la durée de l’ischémie chaude ... 155

Liste des tableaux :

Tableau 2. Espèces (radicalaires et non-radicalaires) réactives de l’oxygène et de l’azote dans les organismes vivants. ... 25

Tableau 3. Expression de l'IL-33 (transcrit et protéine) dans les différentes cellulaires et tissus chez l'homme et souris. ... 79

10

INTRODUCTION

PREMIÈRE PARTIE :

CONTEXTE CLINIQUE

« C’est sans doute parce que la médecine a progressé très très lentement pendant des millénaires qu’on a bien dû appeler les malades des patients »

11

1.1. Insuffisance rénale terminale :

L’insuffisance rénale terminale (IRT) est définie comme la conséquence de l’évolution des maladies qui altèrent la fonction rénale en détruisant la structure tissulaire des reins. Le rein ne peut alors plus assurer ses fonctions physiologiques d’épuration du sang systémique. Le développement de cette maladie évolue progressivement (en général sur plusieurs années) de l’insuffisance rénale aiguë à l’apparition de lésions irréversibles et chroniques dans les reins. L’insuffisance rénale chronique est définie par un débit de filtration glomérulaire (DFG) inférieur à 15mL/min/1.73m². Le recours à un traitement de suppléance est envisagé par une dialyse ou, si possible une transplantation rénale si la clairance de créatinine est comprise entre 15 et 10 mL/min/1.73m². En France, 15 470 patients étaient inscrits sur la liste nationale d’attente d’un greffe de rein en 2014 selon l’agence de biomédecine, soit une progression de 7 % par un an. Cependant, 4 733 patients étaient en contre-indication temporaire en début de l’année 2015 2.

1.2. Néphropathie diabétique :

La néphropathie diabétique (ND) est la cause la plus fréquente d’IRT. Le diabète, principalement de type 2 (DT2), est présent chez 25-50 % des nouveaux patients avec une IRT. Cependant, la qualité de la prise en charge du diabète et de ses complications va directement influencer l’apparition et l’évolution d’une néphropathie diabétique. La première étape de la néphropathie consiste en une hyperfiltration glomérulaire à laquelle s’ajoute une microalbuminurie. Au bout de cinq ans d’évolution en moyenne, cette microalbuminurie devient persistante et s’aggrave en se transformant en protéinurie. Avec le temps, cette protéinurie devient sévère et est associée à une insuffisance rénale chronique, qui évolue vers l’IRT. Dans la plupart des cas, une insuffisance rénale chronique chez un patient diabétique est liée à une ND et ne nécessite pas de biopsie rénale pour confirmer le diagnostic. Les atteintes histologiques principales retrouvées sont une augmentation de la matrice mésangiale, un épaississement de la membrane basale, une glomérulosclérose et une fibrose tubulo-interstitielle 3_.

12

La transplantation rénale (TR), ou greffe de rein, est une intervention chirurgicale éprouvée permettant de remplacer un rein non fonctionnel suite à une maladie chronique par un rein sain. Elle apporte au patient non seulement une meilleure qualité de vie, mais aussi une prolongation de survie. Elle correspond à l’utilisation d’éléments du corps humain «_{à titre exceptionnel dans l’intérêt thérapeutique} d’autrui_{» (article 16-3 du code civil).}

La TR reste le choix thérapeutique de la maladie rénale chronique au stade V (IRT). En France, parmi les 10 799 patients arrivés au stade terminal de l’insuffisance rénale dans les 26 régions françaises en 2014, il y a eu 3 232 greffes rénales, dont 514 à partir de donneurs vivants qui représentent ainsi 16 % du total des greffes rénales 2. De plus, 4 % (428) ont bénéficié d’une greffe préemptive rénale réalisée dans 39 % des cas à partir d’un donneur vivant 2. Les principales difficultés demeurent la pénurie d’organes au regard du nombre de patients en attente d’une TR, le nombre de pertes tardives de greffon et enfin, les complications infectieuses, cardiovasculaires et tumorales. En 2014, l’agence de biomédecine a enregistré 1 058 arrêts fonctionnels du greffon, ce qui représente 9 % des patients qui sont arrivés en dialyse cette année-là. Cependant, la survie médiane des greffons est actuellement de 14 ans 2.

Le nombre de greffes augmente de façon sensible chaque année, mais le nombre de patients inscrits durant une année donnée excédant le nombre de greffes, la pénurie d’organes continue à s’aggraver. La durée d’attente sur la liste après laquelle 50 % de patients ont été greffés est de 27,6 mois pour les malades inscrits entre 2009 et 2014. La pénurie d’organes est la cause directe qui explique cette durée relativement longue. Le Plan greffe 2012-2016 4 _{a défini comme axe stratégique le}

développement de toutes les possibilités de prélèvement, autant de sources de greffons considérés comme complémentaires : donneurs décédés en état de mort encéphalique, donneurs décédés après arrêt cardiaque, donneurs dits «_{à critères} élargis » et donneurs vivants.

13

En France, la grande majorité des prélèvements d’organes sont réalisés sur des patients en état de mort encéphalique. En cas de maladie incurable, et rapidement mortelle, il est également possible dans certains pays (dont la France) d’arrêter les traitements qui maintiennent artificiellement un patient en vie et de prélever ses organes une fois le décès par arrêt circulatoire constaté. Les donneurs sont classés en 4 catégories, en prenant appui sur une classification mise en place lors d’une conférence internationale à Maastricht en 1995 5(Tab. 1).

Maastricht I : survenue d’un arrêt cardiaque en dehors de tout secours qualifié. Le prélèvement d’organes ne peut être envisagé que si les gestes de réanimation ont été commencés moins de 30 minutes après la survenue de l’arrêt cardiaque.

Maastricht II : survenue d’un arrêt cardiaque en présence de secours qualifiés aptes à réaliser une réanimation cardiorespiratoire efficace, mais qui ne permet pas la récupération d’une activité circulatoire spontanée.

Maastricht III : survenue d’un arrêt cardiaque après une décision d’arrêt des traitements en réanimation.

Maastricht IV : survenue d’un arrêt cardiaque après le diagnostic de mort encéphalique.

Tableau 1. Classification internationale de Maastricht.

Les catégories I, II et IV correspondent aux donneurs décédés après arrêt cardiaque inopiné, la catégorie III aux donneurs décédés après arrêt circulatoire suite à la limitation ou l’arrêt des traitements.

14

Malgré l’augmentation significative du nombre de prélèvements destinés à la TR réalisée en France au cours des dernières années, il existe aujourd’hui, du fait de la prévalence élevée de la maladie rénale chronique, une situation préoccupante de pénurie de greffons 2_{. En outre, cette situation nécessite un accroissement des}

sources potentielles de greffons et à ce titre le développement d’une recherche expérimentale et clinique active qui permettre d’évaluer et optimiser les différentes stratégies qui visent l’accroissement du pool de greffons. Parmi ces stratégies figure

l’utilisation de greffons à « critère élargi », en particulier provenant de donneurs dits

« marginaux ».

2.1. Donneur marginal :

Le donneur marginal est considéré comme un « donneur à risque » pour le receveur. Ces risques peuvent être caractérisés par une reprise fonctionnelle tardive, un rejet de greffon et non-fonction primaire, une diminution de survie du greffon et une surmortalité postopératoire.

En 2002, Nyborg et coll., a identifié 4 facteurs associés de façon significative et

indépendante à une diminution de la survie des greffons 6 :

l’âge du donneur supérieur à 40 ans ou inférieur à 10 ans

une fonction rénale définie par une créatinine supérieure à 150 μmol/l

une hypertension artérielle

un décès par accident vasculaire cérébral.

Les donneurs aux critères élargis incluent tous les donneurs de 60 ans et plus et ceux de 50 à 59 ans avec au moins deux facteurs de risque associés parmi les trois suivants : un décès de cause cérébro-vasculaire, un antécédent d’hypertension

artérielle et une créatinine supérieure à 130 μmol/l lors du prélèvement 6_.

Comparativement aux patients greffés avec un donneur optimal, ceux greffés à partir de reins marginaux ont une surmortalité postopératoire. Ils ont un gain

15

d’espérance de vie de 5 ans alors qu’il est de 14 ans avec un donneur optimal. Il a aussi été montré que le risque de mortalité avec greffe à partir d’un greffon marginal est diminué de 60 % par rapport au patient restant en liste d’attente (en dialyse). Cependant, la plupart des scores utilisés pour définir les donneurs marginaux négligent complètement les critères histologiques de l’organe du donneur tels qu’ils sont susceptibles d’être évalués avant la transplantation. En 2006, Remuzzi et coll.,

ont proposé un score histologique simple 7 _{qui repose sur l’analyse des}

compartiments glomérulaire, tubulo-interstitiel et vasculaire pour prédire la survie du greffon. Cette étude montre une meilleure survie à 36 mois des patients dont le

greffon a été sélectionné à l’aide de biopsie 7.

2.2. Donneur diabétique :

La TR améliore durablement la qualité de vie des patients en IRT. Malheureusement le nombre de greffons disponibles est insuffisant pour traiter tous les patients inscrits en liste d’attente de l’agence de biomédecine. Le recours à des reins issus des donneurs diabétiques sera probablement une solution non exclue. Il est bien admis que les changements métaboliques liés au diabète (l’hyperglycémie) entraînent, à la fois, des complications macrovasculaires en accélérant l’athérosclérose, dont la coronaropathie, et des complications microvasculaires à l’origine de la rétinopathie, la néphropathie, et la neuropathie. Les altérations fonctionnelles et les lésions tissulaires provoquées par l’hyperglycémie seront aggravées par les phénomènes d’ischémie reperfusion lors de la TR. Cette susceptibilité accrue du rein diabétique à la séquence ischémique a été rapportée dans des modèles expérimentaux de diabète et chez les humains atteints de diabète 8-11_{. La qualité du greffon issu d’un donneur diabétique affecte la}

durée de vie du greffon, et augmente ainsi les chances de rejet, la non reprise fonctionnelle ou encore la non reprise fonctionnelle tardive.

16

Pour les patients atteints de diabète et de maladie rénale chronique progressive, la TR est la thérapie optimale de remplacement rénal, avec ou sans greffe de pancréas. Les autres avantages de la greffe de pancréas sont devenus de plus en plus évidents en raison des progrès dans les résultats chirurgicaux et les traitements immunosuppresseurs, et peuvent être raisonnablement considérés comme bénéfiques non seulement chez les patients DT1 mais aussi chez les patients souffrant de DT2.

Il a été démontré que le contrôle glycémique serré, obtenu grâce à la thérapie intensive à l’insuline, ralentit la progression et réduit le risque de développer les complications micro et macrovasculaires observées au niveau du greffon rénal 12. Malgré l’utilisation des pompes à insuline et l’insulinothérapie intensive, l’administration exogène de l’insuline n’est pas en mesure de maintenir la normoglycémie aussi efficacement qu’un pancréas fonctionnel. En tant que telle, la transplantation allogénique de pancréas a été développée pour atteindre la normoglycémie et l’indépendance de l’insulinothérapie. La combinaison de transplantations du pancréas et du rein peut libérer un receveur diabétique de l’insuline et de la dialyse avec une prévention d’autres complications du diabète. En général, la transplantation du pancréas est associée à des avantages de survie à long terme en dépit d’une augmentation de la morbidité à court terme et le risque de mortalité. Cela est vrai avec une transplantation simultanée du pancréas et du rein ou du pancréas après transplantation rénale par rapport à la transplantation rénale seule, indépendamment du statut vivant ou décédé du donneur de rein. D’autres facteurs comme la disponibilité des donneurs vivants, les comorbidités, et le temps d’attente doivent être considérés lors du choix d’une modalité de transplantation, plutôt que d’un avantage évident dans la survie d’une stratégie par rapport à d’autres. Actuellement, plusieurs études ont été mises en place afin de mieux comprendre les avantages et les inconvénients de chacune de ces stratégies de transplantation isolée ou combinée de rein et de pancréas chez les patients DT1

17

DEUXIÈME PARTIE :

DONNEES EXPERIMENTALES ET

PHYSIOPATHOLOGIQUES

« Ce qui caractérise la santé, c’est la possibilité de dépasser la norme qui définit le normal momentané, la possibilité de tolérer les infractions à la norme habituelle et d’instituer des

normes nouvelles dans les situations nouvelles ».

18

CHAPITRE (1) :

Physiopathologie de l’ischémie

19

1. Définitions générales :

Les lésions d’ischémie reperfusion (I/R) sont définies comme les dommages cellulaires qui apparaissent après la reperfusion des tissus ischémiques précédemment viables. Sa pathogénie est une interaction multifactorielle entre des facteurs biochimiques, cellulaires, vasculaires, endothéliaux et inflammatoires qui constituent une étape caractéristique commune 15.

L’hypoxie qui résulte de l’ischémie, suivie ultérieurement par une reperfusion, est associée à une production accrue des espèces réactives de l’oxygène (EROs) et un dysfonctionnement du système antioxydant. Ce stress cellulaire entraine, par la suite, la mort des cellules tubulaires par nécrose ou apoptose. Des molécules, considérées comme de puissants activateurs de la réponse immunitaire innée (via la sécrétion des cytokines et chimiokines), telles que les ligands endogènes DAMP (damage

associated molecular patterns) seront générés par les cellules stressées et

nécrotiques 16.

L’inflammation liée à la stimulation des récepteurs des ligands DAMP, tel que les récepteurs TLRs (Toll-like receptor) et les récepteurs RAGE induisent l’activation des voies de signalisation intracellulaire. Ces dernières engendrent l’activation des facteurs de transcription nucléaire tels que NF-kB ou AP-1 et la transcription des gènes codant des molécules proinflammatoires telle que le TNF-ɑ, l’IL-1, l’IL-6, l’IL-12, les interférons, des chimiokines (IP-10, IL-8, CCL-2) dont le rôle principal est d’attirer des polynucléaires neutrophiles et activer des molécules d’adhésions (E-sélectine) 16_.

In fine, l’inflammation locale peut provoquer une nécrose tubulaire à l’origine d’une insuffisance rénale aiguë. Les débris nécrotiques vont agir comme un signal de danger et stimuler, de nouveau, la réponse inflammatoire dans un cercle vicieux (Fig. 1). Ces phénomènes seront examinés de façon plus détaillée dans les prochaines sections.

20

(réf. 17)

Figure 1. Schéma des principaux mécanismes moléculaires des lésions rénales aigues induites par une séquence d’ischémie reperfusion.

1.1. L’ischémie :

L’ischémie est définie comme la cessation de l’apport sanguin au tissu ou à l’organe. Cette interruption des connexions vasculaires induit un arrêt des apports en nutriments et une chute de la pression partielle en O_{₂ dans les territoires ischémiés,} provoquant une altération du métabolisme cellulaire. En conséquence de cette diminution des apports en O_{₂, la mitochondrie ne peut plus assurer la} phosphorylation oxydative nécessaire à la production d’adénosine triphosphate (ATP) et la régénération des cofacteurs à l’état oxydé indispensables au métabolisme oxydatif. En réponse, la glycolyse est dérivée vers la voie anaérobie qui mène à la réduction du pyruvate et à la production de lactate permettant une production résiduelle d’ATP, qui ne couvre pas les besoins énergétiques de la cellule.

Bien que le stress oxydant, qui est défini par une surproduction d’espèces réactives de l’oxygène lors de la réintroduction de l’O_{₂, il est maintenant établi qu’il} puisse prendre son origine au moment de l’ischémie via l’accumulation et l’échappement des électrons vers l’O_{₂ résiduel au niveau des complexes de la} chaine respiratoire mitochondriale. Des réponses adaptatives sont également engagées lors de l’ischémie qui fait appel au facteur de transcription hétérodimérique HIF-1 (Hypoxia inducible factor-1) dont l’activation est sensible à la pression partielle tissulaire en O_₂.

À terme, la prolongation de l’ischémie est responsable de lésions et de déstructurations cellulaires irréversibles.

21

La reperfusion est définie comme la restauration de l’apport sanguin au tissu ou à l’organe. Ce retour sanguin peut aggraver les effets délétères des cellules, initiés lors de la phase ischémique. Le déséquilibre de la balance stress oxydant et le système antioxydant cellulaire amène, par la suite, à une production accrue des EROs connues pour leurs propriétés cytotoxiques.

De plus, la réintroduction rapide de l’O_{₂ permet la réactivation de la chaîne} respiratoire mitochondriale accompagnée d’une production insuffisante d’ATP. Ces conditions favorisent l’effondrement de la fonction mitochondriale en activant la voie de signalisation pro-apoptotique.

2. Conséquence de l’ischémie reperfusion :

L’une des conséquences biologiques majeures de la variation des apports en O_₂ est l’endommagement cellulaire irréversible à la fois structurel et fonctionnel. En effet, au cours de l’ischémie, le métabolisme anaérobie prédomine, ce qui produit une diminution de pH de la cellule. Pour tamponner cette accumulation d’ions hydrogène, des transporteurs membranaires de Na⁺/H⁺ excrètent ces ions d’hydrogène en excès à l’extérieur de la cellule, ce qui produit une accumulation de flux des ions sodium en intracellulaire 18_{. L’ischémie appauvrit également la cellule}

en ATP inactivant la pompe enzymatique ATPase (Na⁺ / K⁺ ATPase), ce qui réduit activement l’exportation de Ca²⁺ à l’extérieur de la cellule. Dans ces conditions, le réticulum endoplasmique (RE) se retrouve incapable de réabsorber le Ca²⁺ produisant ainsi une accumulation de Ca²⁺ dans la cellule.

Ces modifications sont accompagnées par l’ouverture des pores mPTP (mitochondrial permeability transition pore), ce qui dissipe le potentiel de la membrane mitochondriale et altère la production d’ATP. Il est admis que le degré de lésion tissulaire varie selon l’étendue et l’ampleur de la diminution de l’irrigation sanguine ainsi que la durée de la période ischémique. D’autres événements biochimiques se produisent pendant l’ischémie qui ne contribue pas à une lésion ischémique en soi. Une fois la reperfusion est rétablie, l’apport d’oxygène et des

22

éléments dans le sang déclenchent une cascade d’événements qui aggrave les lésions des tissus.

En résumé, les mécanismes sous-jacents de la reperfusion sont complexes, multifactoriels, et comportent : (1) la production des espèces réactives de l’oxygène (EROs) alimentées par la réintroduction de l’oxygène lorsque le flux sanguin est rétabli, ces molécules cytotoxiques induites des lésions de l’ADN cellulaire et une atteinte de la structure cellulaire (2) une accumulation cytoplasmique en calcium (3) l’ouverture des pores de perméabilité mitochondriale (mPTP) (4) le dysfonctionnement endothélial (5) l’apparition d’une cascade prothrombogénique et (6) l’activation de la réponse inflammatoire (Fig. 2).

D’après ce qu’on a constaté précédemment, il est clair que ces conséquences cellulaires, présentent une somme de dommages qui résultent de l’ischémie et sont aggravés par la phase de reperfusion qui exacerbe l’étendue des lésions cellulaires de manière irréversible.

(réf. 19)

Figure 2. Schéma plus détaillé des grands événements pathologiques hémostatiques (No-reflow) et inflammatoires induites par l’ischémie reperfusion et qui contribuent à la mort cellulaire.

23

Il est maintenant bien connu que la séquence d’I/R agit sur la densité capillaire et accroît la perméabilité vasculaire 20. Ces éléments sont en faveur d’une interaction entre les cellules du parenchyme et les éléments circulants, favorisant le développement d’un phénomène no-reflow (Fig. 2). En effet, lorsque l’irrigation sanguine est rétablie dans le tissu, un grand nombre de capillaires n’assure pas une reperfusion totale de tissu. Cette perte de valeur « nutritive » de la perfusion se produit après une période post-ischémique dans différents organes tels que le cerveau, les reins, le cœur, l’intestin grêle et les muscles squelettiques 21.

Plusieurs hypothèses ont été proposées pour expliquer ce phénomène. En réponse à l’hypoxie ou l’hypoxie-réoxygénation, les cellules endothéliales expriment des molécules d’adhésions favorisant l’activation des plaquettes et la fixation et des cellules inflammatoires circulantes sur les cellules endothéliales. Cette agrégation plaquettaire est associée à l’induction de cascade de la coagulation, et finalement à une obstruction mécanique des vaisseaux sanguins de la région ischémique par des micro-thrombi 22_.

D’autres études suggèrent que les neutrophiles activés jouent un rôle important dans le développement du no-reflow post-ischémique. Une forte corrélation a été mise en évidence entre le pourcentage des capillaires présentant le no-reflow post-ischémique et le nombre des leucocytes infiltrés dans ces capillaires des tissus reperfusés. Aussi, l’implication physique des neutrophiles dans les lumières des capillaires a été également proposée comme un mécanisme de no-reflow pendant l’ischémie. En effet, cette hypothèse est basée sur le fait que les neutrophiles sont des cellules de taille importante (8 µm de diamètre en moyenne), rigides, avec une capacité importante de diapédèse à l’entrée et traverser les capillaires de plus petit diamètre. En raison des pressions de reperfusion conduisant le flux formé par des éléments du sang à travers les capillaires, les neutrophiles sont les plus susceptibles de s’arrêter dans les capillaires en bloquant la reperfusion dans ce territoire tissulaire

23_.

Un autre facteur important qui contribue à la mise en place du no-reflow est la rupture de la barrière de l’endothélium microvasculaire. En conséquence, la filtration trans-microvasculaire des fluides et de protéines sera augmentée ce qui entraînera

24

un œdème au sein du tissu. Cette accumulation de liquide dans les tissus ischémiques augmente la pression interstitielle entourant les vaisseaux sanguins, un effet qui est exacerbé par le gonflement des cellules du parenchyme, provoquant l’effondrement des microvaisseaux présentant la plus faible pression (les capillaires et les post-veinules). Ce mécanisme de compression extravasculaire contribue probablement au développement de no-reflow. Il est particulièrement important dans les tissus qui ne peuvent pas s’étendre facilement après la formation de l’œdème, car ils sont enveloppés par des structures qui limitent l’expansion des tissus (tel que le rein qui est entouré par la capsule rénale) 19_.

D’autres études ont suggéré l’implication des péricytes (des cellules contractiles qui entourent presque tous les capillaires ainsi que les petites artérioles et veinules). Ces cellules peuvent éventuellement affecter la fonction microvasculaire après une lésion rénale aiguë 24 _{et influencer ainsi la reperfusion capillaire au cours de l’I/R} 25_.

En effet, les péricytes ont été identifiées comme étant la plus grande population de cellules qui détectent la pression partielle d’oxygène dans le sang et répondent par la production l’érythropoïétine 26_{. De plus, ces cellules sont également impliquées dans}

la régulation du diamètre des capillaires péritubulaires qui entourent les néphrons au niveau rénal 27_{. (Fig. 3)}

(Réf. 28)

Figure 3. Localisation histologique des péricytes et capacité de régulation du débit en aval des artérioles : exemple sur le contrôle de la circulation sanguine dans le système vasculaire cérébral. Des travaux ont montré que les péricytes capillaires se contractent peu après le début de l’ischémie rétinienne ou cérébrale et restent contractés lorsque le flux sanguin est rétabli. En conséquence, la contraction de ces cellules induit à la fois une réduction de diamètre de la lumière capillaire qui favorisera le phénomène de

no-reflow et aussi une production de peroxynitrite à partir NO (molécule

25

Normalement, les mitochondries produisent une faible, mais constante quantité, de radicaux libres comme des sous-produits de la respiration. Un radical libre est une molécule chimique instable, caractérisée par une existence indépendante et qui contient un ou plusieurs électrons non appariés sur sa couche externe. Les EROs sont des molécules chimiques (radicaux libres) normalement produites par l’organisme, elles résultent du métabolisme (réduction monovalente) de l’oxygène et considérées comme des acteurs majeurs dans la signalisation cellulaire à la fois basale et pathologique (processus nommé la signalisation redox). En général, EROs est un terme collectif qui comprend à la fois les dérivés radicaux (superoxydes et hydroxyles) et non-radicaux (peroxydes d'hydrogène) de l’oxygène. Cependant, il a déjà été décrit l’existence d’un certain nombre des EROs (radicaux et non-radicaux), hors des trois formes citées précédemment (Tab. 2).

(Réf. 30)

Tableau 2. Espèces (radicalaires et non-radicalaires) réactives de l’oxygène et de l’azote dans les organismes vivants.

Plusieurs travaux ont établi l’importance primordiale de la production des EROs dans la physiopathologie des lésions d’ischémie-reperfusion 31, 32_{. L’ischémie}

entraîne des modifications des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale et induit une diminution de l’efficacité du système antioxydant. Des séquences ischémiques de courte durée augmentent à la fois l’électronégativité des complexes de la chaîne de transport d’électrons et la fuite d’électrons. En effet, si la séquence

26

d’ischémie est courte, elle peut ne pas être suffisante pour modifier le système antioxydant et la production des EROs dans les mitochondries après la réintroduction de l’O_{₂. Dans certaines circonstances, telles que le préconditionnement ischémique,} la production des EROs dans les mitochondries après une brève période d’ischémie et de reperfusion peut être bénéfique dans la protection des cellules 16. En revanche, lorsque la période ischémique se prolonge, des changements plus profonds au sein des mitochondries se produisent. Un temps d’ischémie prolongé peut entraîner une diminution de l’activité des complexes de la chaîne du transport d’électrons comme les complexes (I) et complexes (IV), entraînant par la suite, une diminution de la production d’ATP après la reperfusion 33. De plus, l’altération des complexes de la chaîne de transport d’électrons conduit également à la fuite des électrons, et la réduction de l’O_{₂ par les électrons libres avec la formation des radicaux superoxydes.} Plusieurs sources génératrices des EROs sont identifiées, en particulier les enzymes de la chaîne respiratoire mitochondriale et des enzymes pro-oxydantes. Parmi ces dernières, on trouve la xanthine oxydase (catabolisme des bases puriques), les cyclooxygénases et lipoxygénases (synthèse des Prostaglandines « PGs » et hydroperoxydes lipidiques « LOOH »), NAPDH oxydases (NOXs), des cytochromes P450 (métabolisme des xénobiotiques), et les autres oxydases. Les niveaux cellulaires des EROs sont régulés par la capacité du système biologique antioxydant à neutraliser, détoxifier et réparer les dommages cellulaires causés par ceux-ci.

Dans les cellules vivantes, les principaux générateurs physiologiques des radicaux libres sont les complexes enzymatiques (I) (NADH déshydrogénase) et (III) (ubiquinone-cytochrome C oxydoréductase) situés au niveau de la chaîne du transport des électrons mitochondriale. Ces complexes contiennent plusieurs centres redox (les flavines, les grappes fer-soufre, et ubisemiquinones) capables de transférer un électron à l’O_{₂ pour former O₂°¯. La génération des EROs par les} complexes (I) et (III) dépend du degré de réduction électronique de ces générateurs. Plus précisément, lorsque le rapport NADH/NAD⁺ est augmenté (apport d’énergie élevé), le degré de réduction électronique du complexe (I) augmente, et la production des EROs sera également importante (Fig. 4). Comme la production des EROs mitochondriale est très sensible à la force motrice de protons à travers la membrane interne, un léger découplage des mitochondries, via l’expression de protéines

27

découplantes UCPs (uncoupling proteins), pourra réduire fortement la génération des EROs 30.

(Réf. 30)

Figure 4. Génération des EROs par la chaine respiratoire mitochondriale au niveau des complexes I et III en tant que principaux générateurs des radicaux libres.

Le pourcentage du flux total des électrons dans les mitochondries, destiné à la production de radicaux, n’est pas constant dans les différents tissus, et les différentes conditions. En effet, l’arrivée de sang oxygéné dans le tissu ischémique bien que nécessaire pour la restauration de la production aérobie de l’ATP, se traduit également par la production accrue des EROs. En raison de leur nature hautement réactive, les EROs générées lors de la reperfusion peuvent modifier pratiquement tous les types de biomolécules qui se trouvent dans les cellules.

3. Comportement de la cellule face à l’hypoxie :

La cellule utilise plusieurs systèmes de défense pour maintenir son intégrité physiologique contre des stimuli extracellulaires et pour rétablir une homéostasie intracellulaire. Cette adaptation cellulaire lui permettra de lutter contre une baisse accrue des taux d’O₂ interstitiel et intracellulaire, lors de l’ischémie, via la voie de HIFs, et faire face aux radicaux libres cytotoxiques, lors de la reperfusion, qui menacent sa survie à l’aide d’un système antioxydant très puissant. L’efficacité de

28

ces systèmes favorise la réparation des dégâts survenus lors de l’I/R au niveau cellulaire.

3.1. L’adaptation cellulaire à la variation de l’O2 : Facteur inductible par l’hypoxie (HIFs)

L’oxygène (O_{₂) est une molécule cruciale pour la fonction et la survie cellulaire.} Lorsque la demande en O_{₂ est supérieure à l’offre, la voie de détection de l’O₂ sera} centrée sur un facteur qui joue un rôle capital dans l’homéostasie de l’O_₂ intracellulaire appelé : Facteurs inductibles par l’hypoxie (HIFs) 34_{. HIFs sont connus}

comme facteur de transcription. Ils sont impliqués dans la coordination d’un programme de transcription tout en assurant une adaptation fonctionnelle, métabolique, et vasculaire en cas de pénurie en O_{₂ (hypoxie) dans les cellules. Cette} adaptation cellulaire implique la régulation, en particulier, des gènes de l’angiogenèse, de l’érythropoïèse et de la glycolyse 35.

Le principal facteur de médiation de cette réponse est HIF-1 (Hypoxia-inducible

factor-1). HIF-1 est constitué d’une sous-unité HIF-1β exprimée de manière

constitutive, et une sous-unité HIF-1_{α (de 120 kDa) régulée par l’O₂ (ou ses} paralogues HIF-2α et HIF-3α) et exprimée dans des différents tissus. En effet, la stabilité et l’activité de HIF-α est régulée par des modifications post-traductionnelles telles que l’hydroxylation, l’ubiquitination, l’acétylation et la phosphorylation.

HIF-1_{α a été découvert par l’identification d’un élément de réponse à l’hypoxie} (HRE : Hypoxia response element : 5’-RCGTG-3’) dans les 3’ activateurs du gène de l’érythropoïétine (EPO), une hormone qui stimule la prolifération des cellules érythrocytaires 36_{. Des études ultérieures ont révélé que les protéines qui se lient au}

HRE dans les conditions hypoxiques forment un complexe hétérodimèrique composé d’une sous-unité HIF-1α et une sous-unité exprimée HIF-1β 37_{. HIF-1β est également}

connu comme ARNT (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator) qui a été identifié comme étant un partenaire de liaison au récepteur d’hydrocarbures aryliques

38_{. Ces protéines appartiennent à la famille protéique de bHLH-PAS (basic}

helix-loop-helix-Per-ARNT-Sim). Les motifs bHLH et PAS sont nécessaire pour la formation les

complexes hétérodimériques entre la sous-unité HIF-_{α et une sous-unité HIF-1β,} alors que la région en aval permet la liaison spécifique à la séquence HRE sur l’ADN

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transcription) ont été identifiés pour HIF-α (HIF-1α et HIF-2α) les domaines N-terminal (N-TAD) et C-N-terminal (C-TAD), alors que HIF-1β n’a qu’un seul domaine TAD 39. En effet, il a été déjà démontré que C-TAD en particulier, est le domaine d’interaction avec des co-activateurs de transcription, tels que CBP/p300 40. En outre, HIF-1α, HIF-2α, HIF-3α ont un domaine de dégradation dépendant de l’oxygène (ODDD : Oxygen-dependent degradation domain). Ce domaine joue un rôle dans la dégradation de HIF-_{α grâce à l’hydroxylation de deux résidus prolines} (P), et l’acétylation d’une lysine (K) 41 _{(Fig. 5).}

(Réf. 42)

Figure 5. Schéma de la structure protéique des domaines qui composent HIF-α (HIF-1α, HIF-2α, HIF-3α, IPAS) et HIF-1β.

Le nombre total d'acides aminés de chaque sous-unité est marqué à l'extrémité de la structure de domaine.

HIF-2_{α également appelé protéine PAS endothéliale ou HLF (HIF-like factor),} HRF (HIF-related factor) et membre de la superfamille PAS 2 (MOP2). Cependant, il se trouve que HIF-2α partage 48 % de séquence en acides aminés avec HIF-1α. Par conséquent, HIF-2_{α présente une similitude structurale et biochimique avec HIF-1α} (par exemple : hétérodimérisation avec HIF-1_{β et la liaison sur l’élément de réponse} d’hypoxie HRE).

HIF-3α, protéine découverte plus tard, s’hétérodimérise également avec HIF-1β et se lie à HREs. En outre, un variant issu de l’épissage de HIF-3α, nommé IPAS (PAS inhibitor) a été découvert par la suite. La protéine IPAS ne possède pas d’activité de transactivation endogène. Or, elle interagit avec la région amino-terminale de HIF-1α et empêche sa liaison à l’ADN (IPAS agit par une régulation négative dominante de HIF-1α). Cependant, IPAS peut également être induite par l’hypoxie dans le cœur et les poumons, contribuant à une boucle de régulation rétroaction négative pour l’activité de HIF-1 dans ces tissus 43. Les molécules HIF-1α