TPL3BIOMIC2

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Les Travaux Pratiques à l’Université Oran1-Ahmed Ben Bella

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Biotechnologie

Licence L3 Biotechnologie microbienne Semestre1

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T.P. N°01

 Matière: Microorganismes Symbiotiques Bénéfiques associés aux plantes

 Intitulé : Effet de certains facteurs environnementaux sue la croissance de souches de Rhizobium pH, salinité et température.

 Protocole :

 Principe: Etudier l’effet de certains facteurs environnementaux comme le pH, la saliniteé et la tempeérature sur la croissance de souches de Rhizobium.

 Méthodologie (succincte) :

1. Preéparation de milieu YEM aà pH 3.6 et 9.6  Préparer le milieu YEM (200ml)

Milieu de culture YMA (Yeast Mannitol Agar) (Vincent, 1970).

Utilisé pour la culture courante des souches de BNL, sa composition en gramme par litre est la suivante :

Extrait de levure ………..1g Agar-Agar ………...15g Mannitol ………..10g

Solution minérale de Bergersen 10 M…………..100ml :KCl 1g

Bergersen (1961) FeCl3 0.02g CaCl2, 2H2O 0.53g Na2HPO4, 12H2O 4.5g MgSO4, 7H2O 1g H2O distillée 1000ml H2O distillée……….qsp 1000ml pH (6.9 –7)

 Préparer deux solutions tampons :

Solution Tampon acétate (pH de 3,6 à 5,6) (100ml) Solution Tampon borate (pH 7,8-9,6) (100m)

Y pH X Y pH 46.3 3.7 3.6 20.0 30.0 4.8 44.0 6.0 3.8 14.8 35.2 5.0 41.0 9.0 4.0 10.5 39.5 5.2 36.8 13.2 4.2 8.8 41.2 5.4 30.5 19.5 4.4 4.8 45.2 5.6 25.5 24.5 4.6

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Définition : Une solution tampon est une solution permettant de conserver un pH à peu

près constant si on lui ajoute de faibles quantités d'acide ou de base.

Solution Tampon acétate (pH de 3,6 à 5,6)

A : Solution d’acide acétique 0,2 M (11,55 mL dans 1 L d’eau distillée)

B : Solution d’acétate de sodium 0,2 M (16,4 g de C2H3O2Na ou 27,2 g de C2H3O2Na, 3

H2O dans 1 L d’eau distillée).

x mLde A + y mL de B, dilués à 100 mL Solution Tampon borate (pH 7,8-9,6)

Preéparer une solution d'acide borique et de chlorure de potassium aà 0,20 M (soit 12,41 g de H3BO3 sec et 14,91 g de KCI sec par litre)

Preéparer une solution bicarbonate de soude aà 0,20 M (8,00 g de soude par litre).

Ne pas chauffer l'acide borique au-dessus de 50 °C. Meélanger suivant les indications du tableau et diluer aà 200 ml.

2. Pr

eé pa

r ati

o n

de

milieu YEM additionneé de 1% et 2% de NaCl (200ml)

3. Preéparation de milieu YEM incubeé aà 35°C, 40°C (200ml)

4. Preéparation d’une suspension bacteérienne de Rhizobium sur milieu YEM liquide. Besoin en mateériels :

Constituants milieu YEM,acide aceétique, aceétate de sodium, acide borique, chlorure de potassium, bicarbonate de soude, NaCl, YEM liquide en tube (10ml milieu/tube), boite Peétri, Becher et eéprouvettes.

T.P. N°02

 Intitulé : Métabolismeglucidique chez les Rhizobiums et la résistance aux Antibiotiques  Protocole : pH KCL, H2BO3 aà 0.20M NaOH aà 0.20M 7.8 50ml 2.65ml 8.0 50ml 4.00ml 8.2 50ml 5.90ml 8.4 50ml 8.55ml 8.6 50ml 12.00ml 8.8 50ml 16.40ml 9.0 50ml 21.40ml 9.2 50ml 26.70ml 9.4 50ml 32.00ml 9.6 50ml 36.85ml

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 Principe: Réaliser une identification phénotypique des souches isolées en traçant un phénodendogramme.

 Méthodologie (succincte) :

1. Dégradation de sucres :

Préparer le milieu Hugh et Leifson, 1953, additionné de différents sucres à la concentration de 10% Tryptone………2g Bleu de bromothymol………...30mg Chlorure de sodium……….5g Hydrogénophosphate de potassium………0.3g Agar-agar………...2.5g 2. Résistance aux antibiotiques :

Différents disques d’antibiotiques sont déposés sur la surface du milieu YEM ensemencé préalablement avec la souche de rhizobium.

Besoin en matériels :

Constituants du milieu Hugh et Leifson, différents sucres disponibles (Glucose, Lactose, Galactose, Fructose, Mannose…), disques d’antibiotiques.

T.P. N°03

 Intitulé : Identification moléculaire des souches isolées

 Protocole :

Séance 1 : Extraction d’ADN bactérien à partir des souches de Rhizobium

 Principe: Extraire l’ADN bactérien des souches isolées dans le but de ;

o Réaliser une identification moléculaire basée sur l’amplification et le séquençage du gène 16S.

o Vérifier la capacité des souches isolées à noduler en amplifiant le gène NodC et ou à fixer l’azote atmosphérique en amplifiant le gène Nif.

o Réaliser une RAPD pour estimer la diversité.  Méthodologie (succincte):

o Prélever une colonie pure sur milieu YEM,

o Repiquer sur milieu TY gélosé sur boite, incuber 24 à 72h

o Ajouter 8ml d’eau distillée stérile dans la boite de culture, récupérer dans un tube stérile o Mélanger au vortex jusqu'à obtention d’une suspension bactérienne homogène

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o Prélever 200µl de cette suspension et faite une lecture de la densité optique (DO) au

spectrophotomètre à 620nm

o Sachant qu’une DO ≈ 1 correspond à la concentration de 108 _Cellules/ml

Si la DO < 1 le volume à prélevé est 200µl/DO Ci.Vi = Cf.Vf

Si la DO > 1 le volume à prélevé est (200µl/DO) x facteur de dilution o Centrifuger 5 min à 13000 rpm, Eliminer ensuite le surnagent

o Resuspendre dans 50µl d’eau ultra pure, passé au vortex puis centrifuger 3 mn o Eliminer le surnageant, Ajouter ensuite :

100µl d’eau ultra pure

100µl Tris HCl (10mM pH 8.3) 17µl de protéinase K (1mg/ml)

o Mélanger au vortex puis incuber overnight à 55°C

o Après incubation, mettre au bain marie 10min à 100 °C puis stocker à -20°C

Séance 2 : Amplification & Migration des produits PCR sur gel d’agarose

 Méthodologie (succincte): Amplification :

o Préparer un Mix réactionnel selon le nombre d’échantillon à amplifier + 1 éch (erreur de pipetage), la composition du Mix est la suivante :

Tampon Taq…….5µl x nbr d’éch Taq………...0.3µl x nbr d’éch MgCl2…………. 2µl x nbr d’éch

Am1……….2.5µl x nbr d’éch le couple d’amorce change selon le gêne à amplifier Am2……….2.5µl x nbrd’éch

dNTP………2µl x nbrd’éch

E.U.P ouE.m.Q…………...7.7µl x nbrd’éch

o Déposer 22µl du Mix dans chaque tube PCR, ajouter 3µl d’ADN extrait. o N’oublier pas le témoin négatif sans ADN.

Programme d’amplification : 95°C – 3min 94°C -1min 56.3°C – 1min 35 cycles 72°C – 2min 72°C – 7min Protocole de migration :

1. Préparation du Tampon TAE X10 concentré :

Le tampon de migration TAE est disponible au labo dans le cas contraire, le préparer comme suite : 48.4g de Tris

11.42ml d’acide acétique glacial (100%) 20ml EDTA

Ajuster à pH 8.0 avec du HCl concentré Qsp 1000ml

2. Préparation du gel et migration :

Pour la révélation du gène 16S, préparer un gel à 1.2% (1.2 d’agarose dans 100ml de Tampon)

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Mettre la quantité d’agarose dans 100ml de Tampon et faire fondre totalement l’agarose au microonde.

Laisser refroidir jusqu’à 45°C- 50°C puis ajouter 4.5µl midorigreen ou BET (Agent intercalant).

Couler le gel dans la cuve préalablement monter du peigne et scotcher par les bords, laisser solidifier puis retirer le peigne et le scotch.

Placer la cuve dans l’électrophorèse, remplir cette dernière du même tampon utilisé dans la préparation du gel jusqu'à immersion du gel.

Déposer 10µl de chaque échantillon ainsi que 3µl de marqueur de taille.

Brancher l’électrophorèse avec les câbles du générateur, le sens de migration allant de l’anode (–) vers la cathode (+) puis régler le voltage à 110V.

Apres migration révéler le gel

Besoin en matériels :

Milieu TY, Vortex, Spectrophotomètre, Centrifugeuse, Eau ultra pure, Tris HCl, Protéinase K, Bain marie, Tampon Taq, EnzumeTaq, MgCl2, Amorces 1 et 2, dNTP, Tubes PCR, Thermocycleur, Tampon TAE, Agarose, Cuve à électrophorese.

T.P. N°04

 Intitulé : Révélation des structures endomycorhiziennes

 Protocole :

 Principe: Coloration des racines selon la méthode de Philips et Hayman, 1970.

Mise en évidence de différentes structures endomycorhiziennes: hyphes, vésicules, arbuscule.

 Méthodologie (succincte):

o L’analyse repose sur l’examen de fragments de racines fines prélevés au niveau du système racinaire des plantes.

o Les racines bien lavées sont mises dans une solution d’hydroxyde de potassium (KOH) à 10% pendant 45 minutes à 90°C, et ceci afin de vider les cellules de leur contenu cytoplasmique.

o Elles sont par la suite abondamment rincées à l’eau afin d’éliminer toute trace de KOH, puis sont trempées dans une solution d’acide lactique pendant 20min à températures ambiante.

o Les racines ainsi éclaircies, sont ensuite colorées dans une solution de bleu de Trypan à 0.1% dans l’acide lactique pendant 20min, puis sécher.

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o Des fragments de racines choisis au hasard sont montés et écrasé entre lame et lamelle dans le glycérol à raison de 10 fragments par lame.

o L’observation des structures endomycorhiziennes se fait au microscope au GR X10 puis GR X40.

o La conservation des racines pour une ultérieure observation se fait dans de l’acide lactique + glycérol + eau distillée (V/V/V).

 Matériels :

Racines d’Acacia saligna, Solution de KOH à 10%, Bain marie à 90°C, Acide lactique, Solution de bleu de Trypan à 0.1% dans l’acide lactique, Scalpels, Lame et Lamelle, glycérol, microscope optique.