TPL3BIOMIC

Les Travaux Pratiques à l’Université Oran1-Ahmed Ben Bella

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Biotechnologie

Licence L3 Biotechnologie microbienne Semestre1

Fiches Techniques

T.P. N°01

 Matière: Biochimie microbienne

 Intitulé : Etude du métabolisme glucidique (fermentation des sucres par les bactéries)

 Protocole :

 Principe:

 Méthodologie (succincte) :

1-L’auxanogramme : étude d’une gamme de sucres dégradables par la bactérie (en

milieu liquide).En pratique on utilise un milieu de base fournissant tous les micronutriments nécessaires à son développement à l’exception de tout substrat carboné, celui-ci est rajouté sous une forme biochimique bien définie.

But

Déterminer la capacité de la bactérie à dégrader un sucre donné mis dans un milieu de base, et ce, en produisant de l'acide.

Technique

- A partir d'un bouillon de culture, ensemencer des tubes contenant différents sucres et un indicateur de pH.

Le milieu utilisé contient :

 Peptone 15g  NaCl 5g

 Glucide à étudier avec une concentration finale de 1% (glucose, lactose, saccharose, xylose, arabinose, mannose, galactose, fructose…)

 Indicateur de pH (1%) le rouge de phénol 5ml

Interprétation

 Réaction positive: pH acide, virage au jaune du rouge de phénol et donc la bactérie a dégradé le sucre présent dans le milieu et qualifiée GLUCIDE +.

 Réaction négative: pH alcalin, virage au rouge pourpre de l’indicateur de pH et donc la bactérie a utilisé la peptone du milieu et qualifiée de GLUCIDE - .

2- Mise en évidence de la voie d’attaque des glucides

Le métabolisme fermentatif, favorisé par l'anaérobiose, engendre de nombreux

produits acides que l'on pourra détecter grâce à un indicateur de pH.

Le métabolisme oxydatif ne donne naissance qu'à de petites quantités d'acides et

uniquement lorsque seront présentes de bonnes conditions d'oxygénation. Opérer le plus possible en aérobiose

Utiliser des milieux:

 Peu peptonés (pour restreindre le métabolisme protéique)  Peu tamponnés

 Gélosés (pour limiter la diffusion des composés acides). Deux milieux répondent à ces exigences:

 Milieu de HUGH et LEIFSON (HL)

 Milieu MEVAG (Milieu d'Etude de la Voie d'Attaque des Glucides).

Technique

- Régénérer le milieu au bain-marie bouillant (20 min à ébullition). - Attendre le refroidissement.

- Ensemencer par piqûre centrale à l'aide d'une pipette Pasteur ou d'un fil droit chargé de culture à étudier.

- Etuver à 37°C en ne revissant pas à fond le bouchon.

- Lire les résultats après24h de culture ou plus, pour les bactéries oxydatives ou fermentatives à croissance lente.

3-Dégradation de l’amidon

Dans ce cas, c’est la disparition du substrat que l’on met en évidence : l’amidon réagissant avec l’iode, l’attaque de l’amidon peut être mise en évidence par la disparition de la coloration caractéristique dans une gélose.

But :

Le but de cette gélose est de rechercher l'hydrolyse de l'amidon par l’amylase,

Composition du milieu

Eléments g/L Rôles

Peptones 5 Source de Carbone, d'azote, et d'énergie, et d'acide aminés.

Amidon (1%) 10 Source de Carbone et d'énergie

Agar 10 Gélifiant qui permet au milieu de

devenir solide

Les composants sont solubilisés dans un litre d’eau distillée. Technique

- Ensemencer par stries ou spots la gélose par la bactérie à tester. - Incuber pendant 48hà la température optimale.

- Après incubation, inonder la boite avec lugol et interpréter les résultats.

T.P. N°02

 Matière: Biochimie microbienne

 Intitulé : Les milieux glucidiques complexes : (TSI /KIA), L’utilisation du citrate (citrate de Simmons), Mannitol mobilité

 Protocole :

 Principe:

 Méthodologie (succincte) : 1- Milieu TSI et KIA :

La gélose TSI (Triple SugarIron) permet l’identification des entérobactéries par la mise en évidence rapide de la fermentation du lactose, du glucose (avec ou sans production de gaz), du saccharose et de la production de sulfure d’hydrogène.

Composition du milieu Composant Qté (g/L) Peptones de caséine 15 Peptones de viande 5 Extraits de viande 3 Peptones de levure 3 NaCl 5 Lactose 10 Saccharose 10 Glucose 1

Citrate ammoniacal de Fer 0,5 Thiosulfate de sodium 0,5 Rouge de phénol 0,024

Agar 12

Lecture

La gélose TSI fournit quatre renseignements principaux :

(1) Fermentation de glucose

 culot rouge : glucose non fermenté  culot jaune : glucose fermenté

(2) Fermentation du lactose et/ou du saccharose

 pente inclinée rouge : lactose et saccharose non fermentés  pente inclinée jaune : lactose et/ou saccharose fermenté(s)

(3) Production de gaz

 apparition de gaz dans le culot (Décollement de la gélose) .

(4) Formation d’H2S

 formation d’une coloration noire entre le culot et la pente ou le long de la piqûre.

2- Milieu citrate de Simmons :

Composants Qté Sulfate de magnésium 0,2g 2g 5g 0,2g 0,8g 0,08g 15g 1L Citrate de Na+ NaCl Hydrogénophosphate d'ammonium

Hydrogénophosphate d'ammonium monosodique Bleu de bromothymol

Agar

Eau distillée (qsp)

Technique

Le milieu est présenté sous forme de gélose inclinée. La pente est ensemencée par une strie longitudinale, réalisée à l'anse, à partir d'une suspension de la culture. Mettre à l'étuve 24 heures à 37°C.

Lecture

- Virage de l'indicateur de pH au bleu : il y a eu alcalinisation du milieu et la souche est citrate de Simmons +.

- Pas de virage de l'indicateur de pH : il n'y a pas eu alcalinisation et le milieu ne présente pas de culture. La souche est citrate de Simmons -.

3-Milieu Mannitol Mobilité

Ce milieu permet l’étude de la dégradation du mannitol qui est un produit de dégradation du mannose.

Composition :

Technique

Ensemencer par piqûre centrale à l’aide d’un fil droit. Incuber 24 h à T° optimale.

Lecture

L’utilisation du mannitol par la bactérie se traduit par le virage du rouge de phénol au jaune (production d’acide).

La mobilité est interprétée par la croissance au niveau de toute la gélose molle et on conclu que la bactérie est mobile ; la croissance autour de la piqure centrale révèle que la bactérie est immobile.

Composants Qté

peptone trypsique de viande 20 g

mannitol 2 g

KNO3 1

rouge de phénol 1% 4 ml

T.P. N°03

 Matière: Biochimie microbienne

 Intitulé : Recherche des enzymes : protéase, lécithinase , catalase, oxydase et la ß – Galactosidase

 Protocole :

 Principe:

 Méthodologie (succincte):

1-Mise en évidence d’une protéase

Caractérisé l’activité protéolytique chez les bactéries par l’hydrolyse de la caséine , protéine du lait.

 Composition du milieu

Le milieu utilisé est la gélose au lait, c’est une gélose nutritive additionnée à 45°C d’un volume de lait stérile.

Technique

Ensemencer par des spots la surface de la gélose et incuber à la température optimale pendant 24 à 48h.

Lecture

L’hydrolyse de la caséine se traduit par l’apparition d’une zone claire autour des touches (spots), l’activité protéolytique peut être estimée en mesurant le diamètre des halos.

2-Mise en évidence d’une lécithinase

De nombreux microorganismes peuvent hydrolyser les phospholipides, la recherche et l’identification des bactéries lipolytique ont un intérêt dans la microbiologie alimentaire, la lécithine purifiée étant couteuse on utilise comme source de lécithine le jaune d’œuf incorporé dans la gélose ordinaire.

Composition

Gélose nutritive additionnée de jaune d’œuf stérile dilué au ½ en eau physiologique (concentration finale 10% soit 2,5 ml pour 25ml de milieu).

Technique

Faire une strie à la surface du milieu et incuber pendant 24h à la température optimale.

3-Test de catalase

Ce test permet l’identification des bactéries Gram positif, cette enzyme est produite en abondance par les bactéries à métabolisme respiratoire (aérobie stricte et aéro-anaérobie facultatif)

Technique :

Sur une lame propre et sèche déposer une goutte d’eau oxygénée à 10 volumes. A l’aide d’une pipette Pasteur boutonée, ajouter l’inoculum bactérien ;

Observer immédiatement.

Lecture :

Apparition de bulles, dégagement gazeux de dioxygène : catalase + Pas de bulles : catalase -.

4-Test d’oxydase

Cette recherche consiste à mettre en évidence la capacité de la bactérie testée à oxyder la forme réduite incolore de dérivés méthylés du paraméthylène diamine, en leur forme oxydée semi-quinonique rose violacé.

Technique

Le réactif se trouve sous la forme d’un disque pré-imprégné par le réactif ; on écrase une effilure de pipette Pasteur une colonie de germes à étudier sur ce disque.

Lecture

Virage du disque au rose violacé indique un résultat positif= Oxydase +

Aucun changement de la couleur du disque indique un résultat négatif = Oxydase -.

T.P. N°04

 Matière: biochimie microbienne

 Intitulé : Catabolisme des acides aminés (décarboxylases (LDC-ODC), dihydrolase (ADH) et tryptophane désaminase)

 Protocole :

 Principe:

 Méthodologie (succincte):

1-Recherche des décarboxylases LDC et ODC ET de la dihydrolase ADH

bactériennes

 Des peptones

 De l'extrait de levure apportant des facteurs de croissance (en particulier le pyridoxal, coenzyme des décarboxylases)

 L'acide aminé dont on veut étudier la décarboxylation (lys ou orn ou arg) en quantité importante

 Du glucose

 Un indicateur de pH.

Exemple: le milieu de FALKOW le milieu de MOELLER

L’indicateur de pH est le pourpre de bromocrésol, jaune en milieu acide et violet en milieu alcalin ;il permettra de révéler dans un premier temps l’acidification due à l’utilisation du glucose par fermentation puis dans un second temps l’alcalinisation due à l’utilisation par décarboxylation de l’acide aminé si la bactérie en est capable.

Technique et résultats

Milieu de

Falkow

- Ensemencer chaque milieu avec quelques gouttes de suspension de la culture à étudier : * Falkow témoin sans acide aminé * Falkow contenant l’acide aminé dont on veut étudier la décarboxylation.

- Si le milieu est présenté en grand tube, recouvrir d’huile de vaseline (sauf dans le cas d’une souche aérobie stricte).- Etuver 24h à 37°C.

Témoin

- virage du BCP au jaune

- acidification due à la fermentation du glucose a conditions optimales pour l’activité des décarboxylases et pour visualiser une éventuelle alcalinisation

- on peut valider les résultats.

Falkow +

acide aminé

- absence de virage du BCP et culture

- acidification due à la fermentation du glucose puis réalcalinisation due à la production d’amine par décarboxylation de l’acide aminé - souche DC + (LDC+ ou ODC+ ou ADH+)

Falkow + acide aminé

- virage du BCP au jaune

- acidification due à la fermentation du glucose mais pas de réalcalinisation due à la production d’amine par décarboxylation de

l’acide aminé

- souche DC - (LDC- ou ODC- ou ADH-)

2-Test Ureée tryptophane

Ce milieu permet de mettre en eévidence les caracteères suivants :  preésence d’une ureéase

 preésence d’une tryptophanase

 preésence d’une tryptophane deésaminase (TDA)

Ce milieu est utiliseé pour l’identification des enteérobacteéries (bacille Gram -, oxydase -). Composition du milieu Composants Quantité (g/L) -Urée20 g -L-tryptophane 3 g - Monophydrogénophosphate de potassium 1 g

- Dihydrogénophosphate de potassium 1 g - Chlorure de sodium5 g - Éthanol à 95 °GL 10 ml - Rouge de phénol25 mg Principe  Recherche de l’ureéase

L’ureéase deégrade l’ureée selon la reéaction suivante : Ureée + H2O → 2 NH4+ CO3-2

Les ions CO3-2 _{vont entraîîner une forte alcalinisation du milieu qui sera reéveéleée}

par un virage de l’indicateur de pH (le rouge de pheénol) aè sa teinte basique (rouge).  Recherche de la production d’indole (mise en évidence de la tryptophanase)

La tryptophanase hydrolyse le tryptophane selon la réaction suivante :

Tryptophane + H2O → indole + acide pyruvique + NH3

L’indole forme un complexe coloré en rouge en présence d’un réactif : le réactif de Kovacs.

 Recherche de la tryptophane désaminase

La TDA dégrade le tryptophane selon la réaction suivante : Tryptophane + H2O → acide indole pyruvique + NH3

L’acide indole pyruvique forme un précipité marron foncé en présence d’un réactif : le chlorure de fer en solution acide.

Technique

Ensemencer avec quelques gouttes de suspension bactérienne ou avec une colonie prélevée à

l’anse sur un milieu solide. Incubation 24 heures à 37°C.

T.P. N°05

 Matière: Biohimie microbienne

 Intitulé : Fermentation des acides mixtes (test VP/RM) et mise en évidence de la ß-galactosidase

 Protocole :

 Principe:

 Méthodologie (succincte):

1-Tests RM et VP

Le milieu de Clark et Lubs permet l'étude des produits de fermentation du glucose: différenciation entre les fermentations « acides mixtes » et « butylène glycolique ».

Milieu Clark et Lubs

Composants Quantiteé Peptone trypsique 5 Glucose 5 Phosphate bipotassique 5 pH = 7

1.1 Test RM (rouge de méthyle)

Ce test permet la mise en évidence, grâce au rouge de méthyle, de la fermentation des

acides mixtes par acidification d'un milieu glucosé après fermentation du glucose.

Au cours de la fermentation, il ya formation de plusieurs acides : acide formique, acide butyrique, acide acétique … . Ces produits sont recherchés en pratique à partir du milieu Clarck et Lubs avec la réaction du rouge de méthyle (RM).

Technique

Consiste à ajouter au milieu Clarck et lubs inoculé depuis 24h, 2 à 3 gouttes de solution alcoolique de rouge de méthyle à 0,2%.

Si la coloration du milieu est jaune =Réaction négative=RM-Si la coloration est rouge=Réaction positive= RM+

1.2. Test VP (Vosges-Proskauer)

Ce test permet la mise en évidence de la production d'acétoïne (ou 3-hydroxy butanone) au cours de la fermentation butylène glycolique: en présence

d'une base forte (soude ou potasse) et d'α-naphtol, l'acétoïne donne une coloration

rouge en milieu très oxygéné. Technique

Dans un tube contenant le milieu Clarck et lubs inoculé depuis 24h, on ajoute 0,5 ml de solution α-naphtol et 0,5 ml de KOH à 16%.

Agiter et laisser le tube en position inclinée pendant 10mn. Aucune coloration donc Réaction

négative=VP-Coloration rouge= Réaction positive=VP+ ;

Remarque: le test VP est beaucoup plus speécifique que le test RM qui ne donne qu'une ideée globale du meétabolisme. Le test VP est particulieèrement inteéressant pour caracteériser le groupe Klebsiella-Enterobacter-Serratia des enteérobacteéries.

2-Test ONPG

Ce test permet de mettre en évidence la dégradation du lactose par la ß-galactosidase, ce test est réalisé lors de l’identification de très nombreuses bactéries. Cette enzyme est intracellulaire et inductible il faut donc une perméase pour faire passer les molécules du lactose et induire la synthèse de l’enzyme.

Cette enzyme inductible ne peut être synthétisée par la bactérie que lorsque celle-ci est en présence de son substrat. La recherche de la ß-galactosidase ne peut donc se faire que sur un milieu contenant du lactose (milieu KIA ou TSI).

On utilise un substrat synthétique : l’ortho-nitro-phényl-galactoside (ONPG) incolore de structure proche du lactose et capable de pénétrer dans la bactérie sans perméase. Si la bactérie possède la ß-galactosidase, on obtient du galactose et de l’ortho-nitro-phénol (ONP) de couleur jaune.

•Faire une suspension dense en eau stérile (tube à hémolyse) • Déposer un ½ disque d’ONPG

• Placer au bain-marie à 37°C • Lire après 30 minutes

T.P. N°06

 Matière: Biochimie microbienne

 Intitulé : Les champignons comestibles Identification des entérobactéries par Galerie API 20E

 Protocole :

 Principe:

 Méthodologie (succincte):

Le système API (Appareillage et Procédé d’Identification) est une version miniaturisée et standardisée des techniques biochimiques conventionnelles pour l’identification des bactéries.

La galerie API 20 E Technique

 Réunir fond et couvercle d’une boite d’incubation et répartir environ 5 ml d’eau distillée dans les alvéoles pour créer une atmosphère humide.

 Déposer stérilement la galerie dans la boite d’incubation

Inoculation de la galerie.

 Remplir tubes et cupules des tests : |CIT |, |VP |, |GEL|, avec la suspension bactérienne.

 Remplir uniquement les tubes (et non les cupules) des autres tests.

 Créer une anaérobiose dans les tests soulignés : ADH, LDC, ODC, URE, H2S en remplissant leurs cupules avec l’huile de paraffine.

 Refermer la boite d’incubation, coder et placer à 37 °C pendant 18-24 heures.

Lecture

Noter sur la fiche de reésultat toutes reéactions spontaneées. Si le glucose est positif et/ou si 3 tests ou plus sont positif : reéveéler les tests neécessitant l’addition de reéactifs.

-Test VP : ajouter une goutte de réactif VP1 et VP2. Attendre au minimum 10 minutes. Une couleur rose franche ou rouge indique une réaction positive.

-Test TDA : ajouter une goutte de reéactif TDA. Une couleur marron fonceée indique une reéaction positive.

-Test IND : ajouter une goutte de reéactif de Kovacs. Un anneau rouge obtenu en 2minutes indique une reéaction positive.

La lecture de ces reéactions se fait selon le profil numeérique :

Apreès addition des reéactifs neécessaires aè la reéveélation de diffeérents tests, la galerie est lue conformeément aux indications du fabricant et codeée.