TPL3MBAP

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Les Travaux Pratiques à l’Université Oran1-Ahmed Ben Bella

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Biologie

Licence L3 Microbiologie Appliquée Semestre2

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T.P. N°01

 Matière: Microbiologie de l’environnement

 Intitulé : Isolement des microorganismes du sol

 Protocole :

 Principe: Isolement et dénombrement des microorganismes qui se trouvent dans deux échantillons de sol différents (moisissures, actinomycètes, bactéries, levures…) par la méthode des dilutions successives.

 Méthodologie (succincte) :

1 gramme de chaque sol séché et tamisé est introduit dans un tube contenant 9 mL d’eau distillée stérile + tween 80 (agent mouillant). Les échantillons sont homogénéisés par agitation au vortex pendant quelques minutes.

- Prélever 1 ml à l’aide d’une pipette stérile et déposer dans un tube à essai contenant 9 ml d’E.D stérile ou E.P

- Agiter pendant au moins une minute.

- Répéter les étapes 4 et 5 pour les trois autres dilutions (10-2_{, 10}-3_{, 10}-4_).

- En commençant par la dilution la plus faible (10-4_{), pipeter 0,1 ml et déposer dans}

chacune des 2 boites de Petri contenant les milieux PDA, GN et WYE. Étendre sur toute la surface avec un étaloir stérile.

- Effectuer les mêmes étapes pour les dilutions de 10-4_{et 10}-3_.

- Sceller les boites de Petri à l’aide du Ruban cellophane.

- Incuber les boites de Petri à la température de la pièce. Observer après 24, 48 et 72 heures.

- Noter le nombre de colonies/plat de Petri/dilution.

- Calculez le nombre de microorganismes par gramme de sol selon la formule suivante :

Nombre de colonies /plat × le facteur de dilution = # organismes / 1 gramme de sol

- Noter la morphologie des colonies.

Produits chimiques Consommable Lugol /Verrerie Petits Matériels

 Glucose asparagine : Glucose, 10g ; asparagine, 0.5g ; K2HPO4, 0.5g ; agar, 15g  PDA (Pomme de terre

dextrose Agar): 200g Pomme de terre; 20g dextrose; 20g Agar.

 GN (gélose nutritive): extrait de viande 1,0g/L, extrait de levure 2,5g/L, peptone 5,0g/L, chlorure de sodium 5,0 g/L, Agar 15,0 g/L

 WYE (water-yeast extract-agar) Modifié par Reddi et Rao: Extrait de levure oxoid, 0.25g; agar oxoid, 18g.  Tween 80

Boites de Petri

 Embouts bleu stériles p1000 et p200 Pipettes Pasteur stériles

Papier aluminium  Ruban cellophane  Papier absorbant  Désinfectants  Eau distillée  Béchers 200 ml  Tubes à essai Lames Lamelles  Anse de platine  Tamis  Spatules  Micropipette p1000  Micropipette p200

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 Huile à immersion  Violet de Gentiane  Fuschine  Lugol  Ethanol 0.95%  NaOCl

T.P. N°02

 Intitulé : Isolement et observation de Rhizobium

 Protocole :

 Principe: Isolement des bactéries nodulant les plantes légumineuses (luzerne, pois, fève... etc.) sur milieu gélosé et observation des formes bactéroides (provenant du nodule). Formes dont les contours sont très irréguliers (formes en X, en Y, etc.).

 Méthodologie (succincte): Préparer un état frais:

Avec l'aiguille lancéolée, prélever par grattage, un peu de matière d'une nodosité et faire un premier étalement avec le plat de l'aiguille ou d'un bistouri.

Ajouter une goutte de colorant (bleu de méthylène ou rouge neutre) et, après 2 minutes environ, placer la lamelle et procéder à un nouvel écrasement en appuyant délicatement sur la lamelle avec le manche de l'aiguille.

b) A partir d'une suspension dilution des nodules racinaires : déposer une petite goutte d'eau (flacon du portoir à colorants)

- Etaler sur environ ¼ de la lame.

- Laisser sécher en mettant la lame sur le chauffe lames.

- Fixer le frottis en passant la lame 3 fois dans la flamme du bec Bunsen (1/2 seconde par passage).

- coloration au violet de Gentiane suivie d'un mordançage par une solution iodo-iodurée de Lugol.

- Recouvrir toute la lame de Violet de Gentiane. Laisser 1minute - Rincer à l’eau avec une pissette d’eau

- Ajouter le Lugol. Laisser 30 secondes (répéter l'opération un deuxième fois). - Rincer à l'eau .

- Décoloration à l'alcool

- Recouvrir la lame d'alcool éthylique 100°. Attendre 10 secondes. - Rincer immédiatement à l'eau .

- Recoloration à la fuchsine.

- Ajouter la Fuchsine. Laisser 1 minute. - Laver abondamment à l'eau.

- Sécher délicatement la lame dans un papier jetable. Nettoyer au besoin le dessous de la lame avec un papier jetable . La lame doit être totalement sèche.

- Observer à l'immersion en pleine lumière : Mettre une goutte d'huile à immersion sur la lame

3) Isolement

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- Dans un petit récipient en verre, verser 10 mL de NaOCl à 2% sur les nodules préalablement lavées et laisser agir pendant 5min.

- Eliminer le NaOCl et laver les nodules 2 à 3 fois avec de l'eau stérile.

- A l'aide d'une tige de verre préalablement trempée dans l'alcool et flambée stérile, broyer les nodules placés dans 3mL d'eau stérile. Ceci constitue l’échantillon non dilué.

- Dans des tubes à essai stériles, réaliser les dilutions 10-1_{, 10}-2_{, 10}-3_{et 10}-4_{dans un volume}

final de 10 mL. Bien vortexer chaque tube.

- A l'aide de pipette pasteur stérile, déposer une goutte du liquide ou d'une suspension diluée du surnageant dans une boîte de Petri YEM et étaler aseptiquement les gouttes avec un étaloir.

b- Ensemencement des milieux de culture et incubation - Prévoir 1 gélose par dilution.

- Ensemencer 0.1 mL des dilutions suivantes;10-1_{, 10}-2_{et 10}-3_{sur les milieux suivants :}

Yeast Extract-Mannitol (YEM) et GN.

- Vortexer la dilution avant de prélever 0.1 mL ; répartir sur la gélose puis étaler rapidement au râteau. Incuber les boites des milieux gélosés YEM et GN à pendant 2 à 4 jours à un température comprise entre 25 à 30°C.

- Noter la morphologie des colonies.

- Purification des isolats sur milieu YEM par la méthode des quadrants et incubation à température ambiante pendant 72h.

Produits chimiques Consommable/Verrerie Petits Matériels

 Milieu Yeast-Extract-Mannitol (YEM): Mannitol: 10g; K2HP04: 0.5g; Extrait de levure: 0.5; NaCl: 0,1g; MgS04.7H20: 0.2g; HCl N/10; agar: 18 g.  GN (gélose nutritive): extrait de viande 1,0g/L, extrait de levure 2,5g/L, peptone 5,0g/L, chlorure de sodium 5,0 g/L, Agar 15,0 g/L.  Huile à immersion  Violet de Gentiane  Fuschine  Lugol  Bleu de méthylène  NaOCl éthanol 0.95% Boites de Petri

 Embouts bleu stériles p1000 et p200  Papier filtre

Pipettes Pasteur stériles

 Flacons en verre 250ml  Papier absorbant  Désinfectants  Eau distillée  Béchers 200 ml Tubes à essai Lames Lamelles  Anse de platine  Spatule  Micropipette p1000  Micropipette p200  Aiguille lancéolée Pince Bistouri Verre de montre

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T.P. N°03

 Intitulé : Isolement des microorganismes de l’eau

 Protocole :

 Principe: Faire une analyse bactériologique de deux échantillons différents d'eau par un dénombrement en fermentations à tubes multiples et sur milieux gélosées et ce pour la mise en évidence des indicateurs de contamination fécale et de la flore aérobie mésophile totale.

 Méthodologie (succincte):

1) Analyse des coliformes totaux et fécaux Test présomptif :

Dans 9 tubes contenants le milieu BCPL, transférer avec une pipette stérile, respectivement 10ml, 1ml, 0,1ml de l’échantillon bien homogénéisé, et mélanger le contenu de ces 9 tubes de façon à obtenir une répartition homogène de l’inoculum et du milieu. Les tubes sont incubés à 37°C pendant 48 h. Les tubes présentant un trouble avec production du gaz dans la cloche sont positifs.

Les tubes BCPL présentant un trouble avec dégagement du gaz dans la cloche sont positifs, ils confirment la présence des coliformes, Compter le nombre de séries de tubes positifs et le nombre de tubes négatifs et on obtient les résultats en extrapolant sur la table de MAC GRADY.

Test confirmatif :

Procéder à la confirmation de chaque culture provenant des tubes ayant donné une réaction positive, en ensemençant à l’aide d’une anse bouclée le bouillon lactosé au vert brillant. Incuber deux séries de tubes dans les conditions suivantes:

Les coliformes totaux sont incubés à 37°C pendant 48h. Les coliformes fécaux sont incubés à 44°C pendant 24h. Test démonstratif :

-Inoculer le milieu EMB à partir des tubes positifs BLBVB et incuber 24h à 37°C.

-Préparer un frottis à partir des colonies développées sur milieu EMB et faire une coloration de Gram.

-Observer à l'immersion et noter la forme des cellules et leur mode de regroupement.

2) Analyse des stréptocoques fécaux

Le bouillon de Rothe est utilisé (même mode opératoire que les coliformes) pour le test présomptif, tubes sont incubés à 37°C pendant 48h. Le bouillon Litsky est utilisé pour le test confirmatif. La lecture des résultats se fait après 48h d’incubation. Les tubes de Litsky présentant un trouble avec dépôt violet au fond sont positifs.

3) Dénombrement de la flore mésophile totale

- Prélever 1mL d'eau brute et l'introduire dans un tube contenant 9 mL d’eau physiologique stérile. L'échantillon est homogénéisé par agitation au vortex pendant quelques minutes. La suspension ainsi obtenue constitue la dilution 10-1.

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- Dans des tubes à essai stériles, réaliser les dilutions 10-2, 10-3 et 10-4 dans un volume final de 10 mL. Bien vortexer chaque tube.

- Liquéfier la gélose PCA à 45-50°C. - Prévoir 2 boites par dilution.

- Vortexer la dilution avant d'ensemencer 1 mL des dilutions suivantes 10-2, 10-3 et 10-4. Prélever 1ml de l'échantillon à analyser et l'introduire à l’intérieur des boites de pétri stériles puis ajouter 10 à 15mL de gélose.

- Laisser solidifier après une agitation lente.

- La première série de boites est incubée à 37°C pendant 24h pour la croissance des bactéries pathogènes, qui se développent à la température du corps humain. La deuxième série de boites est incubée à 22°C pendant 48 à 72h pour la croissance des bactéries adaptées à la température de l’eau.

- Dénombrer les colonies sur PCA et noter leur aspect macroscopique.

- Calculer la concentration des bactéries par ml d'échantillon d'eau. Ne pas oublier de tenir compte des dilutions.

N : Nombre d' UFC par gramme ou par mL de produit initial

Boîtes interprétables = boîtes qui contiennent entre 30 et 300 colonies. Pour une boîte 10-3 le facteur de dilution est 1000.

Produits chimiques Consommable/Verrerie Petits Matériels

Bouillon de Rothe : peptone 20,0 g; glucose 5,0 g; azide 0,2 g; NaCl : 5,0 g; hydrogénophosphate de

potassium : 2,7 g;

dihydrogénophosphate de potassium : 2,7 g.

Bouillon de Litsky : Ploypeptone : 20 g. Glucose : 5 g. Chlorure de sodium : 5 g. Phosphate monopotassique : 2.7 g. Phosphate dipotassique : 2.7 g. Azide de sodium : 0.3 g. Ethyl violet : 0.0005 g. 

Bouillon lactosé au pourpre de bromocrésol (BCPL): Peptone 5,0 g; Extrait de viande de bœuf 3,0 g; Lactose 10,0 g, Pourpre de bromocrésol 25 mg.

Bouillon vert brillant: Peptone 10,0 g; Lactose 10,0 g; Bile 20,0 ml; Vert brillant 13,0 mg.

Milieu EMB: peptone 10,0 g; lactose 10,0 g; éosine 0,4 g; bleu de méthylène 0,0625 g;

hydrogénophosphate de potassium 2,0 g; agar 15,0 g.

Milieu PCA: Tryptone 6,0 g; extrait

Boites de Petri

Embouts bleu stériles p1000 et p200

Ruban cellophane Papier absorbant Désinfectants Eau distillée Béchers 200 ml Tubes à essai  Lames Lamelles Ecouvillons stériles Eprouvettes 50 ml Anse de platine Micropipette p1000 Micropipette p200

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de levure 2,5 g; glucose 1,0 g; agar15,0 g. Huile à immersion Violet de Gentiane Fuschine Lugol Bleu de méthylène Rouge neutre NaOCl éthanol 0.95%

T.P. N°04

 Intitulé : Etude de la Flore Bucco-dentaire humaie

 Protocole :

 Principe: Isolement des microorganismes à partir de d'un prélèvement de muqueuses buccales de la gencive et de la langue sur différents milieux de culture et identification morphologique microscopique et macroscopique après incubation à des températures proches de la température du corps humain.

 Méthodologie (succincte):

1) Prélèvement

- Avec un écouvillon stérile, frotter environ 2 cm2_{de la muqueuse buccale}

(intérieur de la joue). Agiter l’écouvillon dans 2 mL d’eau stérile. Ceci constitue l’échantillon pur = non dilué (P).

2) Colorations de Gram

a) Frotter l’écouvillon « muqueuse » sur 2 lames. Faire une coloration de Gram sur 1 lame et conserver l’autre pour refaire la coloration si nécessaire. Estimer le % de chaque type de bactéries.

b) Avec un autre écouvillon frotter une dent du fond et la gencive l’entourant. Frotter l’écouvillon « dent » sur 2 lames. Faire une coloration de Gram sur 1 lame et conserver l’autre pour refaire la coloration si nécessaire.

Estimer le % de chaque type de bactéries et comparer avec la flore de la muqueuse.

3) Dilutions en eau distillée stérile

Dans des tubes à essai stériles, réaliser les dilutions 10-1_{, 10}-2_{, 10}-3_{et 10}-4_{dans un}

volume final de 10 mL. Bien vortexer chaque tube

4) Ensemencement des milieux de culture et incubation Prévoir 1 gélose par dilution.

Ensemencer 0.1 mL des dilutions suivantes: 10-2_{, 10}-3_{et 10}-4_{sur les milieux}

suivants : PCA, Chapman et Sabouraud.

vortexer la dilution avant de prélever 0.1 mL ; répartir sur la gélose puis étaler rapidement au râteau. Incuber les boites des milieux gélosés à 37° C pendant 24 à 48h.

5) Dénombrer les colonies de chaque type sur les différents milieux. Noter

l'aspect macroscopique des colonies sur chaque milieu de culture.

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3) Calculer la concentration de chaque type de bactéries par mL de muqueuse

buccale. Ne pas oublier de tenir compte de la dilution. N : Nombre d' UFC par gramme ou par mL de produit initial

Produits chimiques Consommable/Verrerie Petits Matériels

 Milieu PCA: Tryptone 6,0 g; extrait de levure 2,5 g; glucose 1,0 g; agar15,0 g.

 Milieu Chapman:

Peptone 10,0 g; Extrait de viande de bœuf 1,0 g; Chlorure de sodium 75,0 g; Mannitol 10,0 g; Rouge de phénol 0,025 g; Agar-Agar15,0 g.

 Milieu Sabouraud: Peptone 10 g; Glucose 20 g; Agar-agar 15 g; vitamines et facteurs de croissance  Disques oxydase  Eau oxygénée  Huile à immersion  Violet de Gentiane  Fuschine  Lugol  Bleu de méthylène  Rouge neutre  NaOCl éthanol 0.95% Boites de Petri

 Embouts bleu stériles p1000 et p200

 Ruban cellophane  Papier absorbant  Désinfectants  Eau distillée  Béchers 200 ml Tubes à essai Lames Lamelles Ecouvillons stériles

 Milieu PCA: Tryptone 6,0 g; extrait de levure 2,5 g; glucose 1,0 g; agar15,0 g.  Milieu Chapman: Peptone 10,0 g; Extrait de viande de bœuf 1,0 g; Chlorure de sodium 75,0 g; Mannitol 10,0 g; Rouge de phénol 0,025 g; Agar-Agar15,0 g.  Milieu Sabouraud: Peptone 10 g; Glucose 20 g; Agar-agar 15 g; vitamines et facteurs de croissance  Disques oxydase  Eau oxygénée  Huile à immersion  Violet de Gentiane  Fuschine  Lugol  Bleu de méthylène  Rouge neutre  NaOCl éthanol 0.95%