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Institut National Polytechnique de Toulouse (INP Toulouse)
Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries (SEVAB)
Effets chez le porcelet d'une exposition à un régime co-contaminé en
mycotoxines, et appréciation des stratégies de lutte
mercredi 20 avril 2011
BERTRAND GRENIER
Pathologie, Toxicologie, Génétique et Nutrition
Nathalie LE FLOC'H-BURBAN, Chargée de Recherches, INRA Rennes, Rapporteur Yvan LARONDELLE, Professeur, Université catholique de Louvain, Rapporteur
Martine KOLF-CLAUW, Professeur, ENV Toulouse Cyril FEIDT, Professeur, ENSAIA Nancy Wulf-Dieter MOLL, Ingénieur, BIOMIN Tulln
Nathalie LE FLOC'H-BURBAN et Yvan LARONDELLE Isabelle OSWALD et Martine KOLF-CLAUW ToxAlim, Equipe Immuno-Mycotoxicologie
AUTEUR : Bertrand GRENIER
TITRE : Effet chez le porcelet d’une exposition à un régime co-contaminé en mycotoxines, et appréciation des stratégies de lutte
DIRECTEURS DE THESE : Dr. Isabelle OSWALD et Pr. Martine KOLF-CLAUW RESUME :
Les mycotoxines sont des métabolites secondaires des moisissures qui peuvent naturellement contaminer de nombreuses denrées alimentaires, notamment les céréales. Dans les travaux de thèse, nous nous sommes intéressés à deux mycotoxines majeures produites par des champignons du genre Fusarium, le Déoxynivalénol (DON) et la Fumonisine (FB). Les objectifs de la thèse ont été de déterminer les effets individuels et combinés d’une contamination en DON et FB chez le porc, une espèce cible et sensible aux mycotoxines. Les effets sur les fonctions immunitaires lors d’un challenge antigénique ainsi que sur les fonctions intestinales ont été évalués. Par ailleurs, dans le cadre d’un partenariat avec un industriel, nous avons évalué in vivo les effets de méthodes de détoxification par biotransformation et ciblant spécifiquement ces deux toxines. Chez le porc, l’ingestion d’aliments contaminés avec de faibles doses de mycotoxines (DON, 3 mg/kg ; FB, 6 mg/kg) a provoqué des lésions tissulaires (foie, reins et poumons) et a fortement altéré la mise en place d’une réponse immunitaire spécifique de l’antigène (expression des cytokines, prolifération des lymphocytes et anticorps spécifiques). Les animaux ont été significativement plus affectés après la consommation du régime co-contaminé, et l’interaction a pu être considérée comme additive. De plus, les paramètres intestinaux examinés ont révélé des changements dans la morphologie, dans le profil de sécrétion des cytokines et dans l’adhésion cellulaire. L’interaction des deux toxines a pu ici être caractérisée comme moins qu’additive. Les approches de détoxification biologique proposées par l’industriel étaient basées sur la transformation par voie enzymatique du DON et des FB, à partir d’un microorganisme entier et d’une enzyme respectivement. La stratégie d’élimination des FB a suscité un intérêt plus important étant donné que cette méthode est non commercialisée et en cours de développement. Ainsi, la toxicité du produit d’hydrolyse de la FB1 (mycotoxine principale de la famille des FB) obtenu initialement par traitement enzymatique, a été comparée in vivo à celle de la molécule mère la FB1. Les résultats ont montré que l’hydrolyse de la FB1 réduisait fortement la toxicité hépatique et intestinale chez les porcelets. L’expérimentation animale avec le DON et la FB, seuls ou en combinaison a ensuite été reproduite afin de déterminer l’efficacité d’hydrolyse de ce procédé chez le porc après incorporation de l’enzyme dans les aliments contaminés. Dans ces aliments, le microorganisme entier ciblant le DON avait également été inclus. La nette diminution du marqueur d’exposition des FB et la neutralisation partielle ou totale des effets ont suggéré que le procédé avait fortement réduit la biodisponibilité des FB dans le tractus gastro-intestinal. Cette observation a aussi été en partie confirmée pour l’approche de dégradation du DON. La biotransformation par voie enzymatique des mycotoxines représente ainsi une stratégie biotechnologique prometteuse dans la lutte contre ces contaminants.
MOT-CLES : Déoxynivalénol, Fumonisine, porc, co-contamination, réponse immunitaire, réponse intestinale, marqueur d’exposition, biotransformation enzymatique
DISCIPLINE : Toxicologie alimentaire INTITULE ET ADRESSE DU LABORATOIRE :
Institut National de la Recherche Agronomique – INRA Unité ToxAlim, Equipe d’Immuno-Mycotoxicologie 180, chemin de Tournefeuille – BP 93173
AUTHOR : Bertrand GRENIER
TITLE : Effect in pigs of the exposure to a mycotoxins co-contaminated diet, and evaluation of control strategies
THESIS SUPERVISORS : Dr. Isabelle OSWALD and Pr. Martine KOLF-CLAUW ABSTRACT :
Mycotoxins are secondary metabolites of fungi that are natural contaminants of several commodities, in particular cereals. In the present work, we focused on two major mycotoxins produced by the Fusarium genus, Deoxynivalenol (DON) and Fumonisin (FB). The main objectives of the thesis were to determine the toxic effects of individual and combined DON and FB contamination in pig, a target species highly sensitive to mycotoxins. The effects on the immune functions following an antigenic challenge and also on the intestinal functions were evaluated. Besides, within the framework of an industrial partnership, we evaluated in vivo the effects of detoxifying methods by biotransformation and targeting specifically these two toxins. In pigs, ingestion of contaminated feeds with low doses of mycotoxins (DON, 3 mg/kg ; FB, 6 mg/kg) triggered tissular lesions (liver, kidneys and lungs) and strongly impaired the establishment of the antigenic immune response (cytokines expression, lymphocytes proliferation and specific antibodies). Animals consuming the co-contaminated diet were more affected and the interaction could be considered as additive. In addition, changes in morphology, in profile of cytokines secretion and in cell adhesion were observed at intestinal level. The interaction here could be characterized as less than additive. The biological detoxification approaches proposed by the industrial were based on the transformation by enzymatic way of DON and FB, from intact microorganism and enzyme respectively. We paid a particular attention to the strategy of FB removal as this method is not marketed and still in development. Therefore, the toxicity of the hydrolysis product of FB1 (major mycotoxin in the FB group) initially obtained by enzymatic way, was compared in vivo to the toxicity of the parent compound FB1. Results showed that the hydrolysis of FB1 strongly reduced the toxicity in piglets at intestinal and hepatic levels. The animal experiment with DON and FB, alone or in combination was then repeated in order to determine in pigs the hydrolysis efficiency of this process when enzyme was incorporated in contaminated feeds. In these feeds, the intact microorganism toward DON was also included. The marked decrease of the biomarker of exposure to FB and the partial or total counteraction of the effects suggested that the process had greatly reduced the FB bioavailability in the gastrointestinal tract. This observation was also in part confirmed for the method degrading DON. The biotransformation method of mycotoxins by enzymatic way represents therefore a promising biotechnological strategy in the control of these contaminants.
KEY WORDS : Deoxynivalenol, Fumonisin, pig, co-contamination, immune response, intestinal response, biomarker of exposure, enzymatic biotransformation
DISCIPLINE : Food Toxicology
HEADING AND ADRESS OF THE LABORATORY : Institut National de la Recherche Agronomique – INRA Unité ToxAlim, Equipe d’Immuno-Mycotoxicologie 180, chemin de Tournefeuille – BP 93173
REMERCIEMENTS
Le travail ici présenté a été rendu possible grâce à un partenariat entre l’Association Nationale de la Recherche Technique (ANRT), le laboratoire d’Immuno-Mycotoxicologie de l’Institut National pour la Recherche Agronomique (INRA) et la société BIOMIN, formalisé dans une Convention Industrielle de Formation par la Recherche (CIFRE n°065/2007).
Je tiens à remercier toutes les personnes qui ont accepté de faire partie de ce jury :
Le Dr. Nathalie Le Floc’h-Burban et le Pr. Yvan Larondelle, qui ont accepté d’évaluer ce travail en qualité de rapporteur.
Le Pr. Cyril Feidt, qui a accepté de faire partie de ce jury en tant qu’examinateur.
Le Dr. Wulf-Dieter Moll, le Dr. Gerd Schatzmayr et Mr. Christian Tenier (ces deux derniers étant non présents dans le jury), pour m’avoir accordé votre confiance dans la réalisation de ce projet, m’avoir ouvert la porte sur le monde de l’entreprise. Merci Dieter d’être examinateur de ce travail. Le Pr. Martine Kolf-Clauw, co-directrice de thèse, pour sa disponibilité et ses conseils judicieux tout au long de ces 3 années ½ de thèse. Je te remercie de ton implication dans les expérimentations animales et dans la rédaction.
Le Dr. Isabelle Oswald, directrice de thèse, pour son accueil au sein de l’équipe d’immuno-mycotoxicologie. Je t’adresse tout particulièrement mes remerciements, la pertinence de tes conseils, ta capacité à gérer cette équipe et tous ces projets, et également ta capacité à répondre aussi vite à tes mails même à l’autre bout de la planète, m’impressionneront toujours. Merci pour ta confiance, ta disponibilité (même en vacances) et pour m’avoir permis de « voyager » et rencontrer de nombreuses personnes à travers tes collaborations ou lors des congrès.
Je tiens à adresser tous mes remerciements, ma sympathie et mon affection aux personnes qui ont partagé avec moi – de près ou de loin – ces 3 ans ½ de travail :
- INRA, pôle de St Martin du Touch :
Au personnel de l’équipe :
Philippe, merci de ta générosité et de ta multi-compétence au labo. J’espère un jour pouvoir de nouveau travailler avec une personne comme toi.
Joëlle, je te remercie de ta gentillesse et de ton ouverture d’esprit. Les conversations que nous avons pu avoir sur la société, l’actualité politique ou encore la vie de tous les jours vont me manquer. Anne-Marie, sans qui les expérimentations animales auraient été impossibles. Merci pour ton professionnalisme et pour toutes ces pauses partagées à discuter avec toi.
Olivier, grâce à ce congrès en Autriche et cette superbe suite que nous avons partagé, j’ai pu découvrir un chercheur fort sympathique et passionné des champignons ! J’espère que tu vas la garder cette barbe !
Je remercie tous les autres membres permanents de l’équipe pour leurs bonnes humeurs et leurs disponibilités : Laurence, Thierry, Soraya, Christiane.
J’ai vu passé un nombre incroyable de stagiaires (entre 30 et 40), courtes ou longues durées, tout au long de ma thèse, et je tiens à vous remercier pour tous ces moments agréables passés au ou en dehors du labo en votre compagnie. Je n’en citerai que quelques uns, Mél, Romain, Dima, Leticia. Et également bonne chance à tous ces nouveaux étudiants bien sympas et prêts à prendre la relève (ou pas !) : Patricia, Julie, Selma, Joyce, German, Roberta.
Au personnel du pôle ToxAlim :
Marie-Jo, encore merci pour ta rapidité pour nous procurer toute la bibliographie et pour cette
aide très précieuse dans la reliure et l’envoi de ce manuscrit.
Merci à tous ceux qui ont forcément contribué à faire de cette thèse une agréable expérience jusqu’au bout. Je pense en particulier, à Alice, Afi, Arnaud (bon courage pour ton petit bout), Fred, Hervé, Pascal, Nico, Cécile 1 et 2, Caro, Manue.
Simon, je suis bien content d’avoir fait ta connaissance en thèse, je sais que nous resterons en contact, nos virées à la montagne et les soirées magrets de canard nous ont bien rapprochés ! Bon courage pour la suite.
- BIOMIN :
Je tiens à adresser mes remerciements à la société BIOMIN, que ce soit en France ou en Autriche. Par le biais de leurs investissements, leurs conseils mais aussi leurs confiances, ce projet de thèse a pu se réaliser dans les meilleures conditions. Je remercie tout particulièrement Gerd Schatzmayr, Christian Tenier, Dieter Moll et Heidi Schwartz dans cette collaboration.
Merci également aux autres collègues de chez BIOMIN, qui ont largement contribué à mes agréables séjours en Autriche ou lors des congrès : Daniel, Doris, Gertrude, Katia, Inès, Tamara, …. - Collaborateurs :
Tout au long de ma thèse, j’ai pu rencontrer de nombreuses personnes et qui ont directement ou indirectement participées à la réalisation et/ou à la réussite de nos projets. Parmi ces personnes, je citerai Ana-Paula Loureiro Bracarense, professeur à l’école vétérinaire de Londrina au Brésil et qui a depuis le début collaboré dans ce travail de thèse. Sa compétence en histopathologie a été très précieuse tout au long de ce travail de thèse. Egalement un grand merci pour ton accueil lors de mon séjour au Brésil.
J’ai une pensée particulière pour mes deux collègues roumaines, si gentilles et disponibles, Daniela et Ionelia. Merci de m’avoir donné l’opportunité de présenter mes travaux lors du symposium que vous aviez organisé.
Un grand merci à Georges Guillemois de l’INRA de St-Gilles pour son aide dans la fabrication de nos aliments expérimentaux.
- ENVT :
Jean-Luc, si tu ne m’avais pas donné ma chance lors de ma première expérience professionnelle, je ne serai probablement pas là aujourd’hui. Merci pour ta confiance et ta bonne humeur.
Je n’oublie pas toutes les personnes de cette période qui a précédée la thèse, avec qui je garde de bons contacts : Kunta, Mag, Béa, Romain, Steph.
- Activités sportives :
Le sport a été mon compagnon fidèle tout au long de ces 3 ans ½ et ainsi j’adresse un grand merci à mon club de foot à 11 et à 7, au club de badminton de l’INRA, et aux stations de ski des Pyrénées. - Les amis :
Ces 3 années ½ ne se seraient pas aussi bien passées si je n’avais pas été entouré de tous mes amis. D’abord toi Léon, mon pote qui m’a suivi de notre très cher Alsace jusqu’à Toulouse et qui maintenant fait le bonheur de la science à Los Angeles. Nos soirées et weeks ends avec les copains de Toulouse et d’Alsace resteront des moments inoubliables. Merci donc les amis de la rue Guénot et la rue Maran, merci pour toutes ces soirées League des Champions et ces week ends de détente, Nico, Yo, Sebbie, Ben, Aurel, Maud, Alicia, Nickauch c’était génial de vous avoir rencontré sur Toulouse ! J’ai aussi une pensée pour mes amis d’enfance et de fac, les retours en Alsace ou les visites chez les uns et les autres sont toujours un plaisir. J’espère qu’on continuera à se voir régulièrement, merci les amis, Steph, Zgueg, Portos, Rik, Adrien, Eric, Yannick, José, Bastien.
- La famille :
Et enfin, je dédie tout spécialement mon travail de thèse à mes parents, Marie-Claude et Patrice, qui m’ont toujours soutenu et à qui je dois beaucoup. Merci la frangine, je suis fier de toi. Et bien sûr les liens familiaux étant très importants, je n’oublierai pas mes folles cousines, fafa et sa famille, Rémi, les tatas et tontons et mes grand-mères.
Et enfin, merci à toi « Choucroute » pour ton soutien et ton amour qui m’ont tant aidé ces derniers mois.
PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS
Articles :
Grenier, B., Loureiro-Bracarense, A. P., Lucioli, J., Pacheco, G., Cossalter, A. M., Moll, W. D., Schatzmayr, G., Oswald, I. P. 2011. Individual and combined effects of subclinical doses of deoxynivalenol and fumonisins in piglets. Molecular Nutrition & Food Research, DOI 10.1002/mnfr.201000402, sous presse.
Lucioli, J., Grenier, B., Pacheco, G., Cossalter, A. M., Moll, W. D., Schatzmayr, G., Oswald, I. P Loureiro-Bracarense, A. P. Chronic ingestion of deoxynivalenol and fumonisins induce changes in the morphology and local immune response of the intestine of piglets. Manuscrit en
préparation.
Grenier, B., Loureiro-Bracarense, A. P., Schwartz, H., Cossalter, A. M., Schatzmayr, G., Moll, W. D., Oswald, I. P. Hydrolysis of fumonisin B1 strongly reduced toxicity in piglets at the intestinal and hepatic levels. Manuscrit en préparation.
Revue et Chapitres :
Grenier, B., Loureiro-Bracarense, A. P., Oswald, I. P. Physical and chemical methods for mycotoxins decontamination in maize. In Mycotoxin Reduction in Grain Chains: A Practical Guide. Edited by Logrieco, A. F., sous presse.
Pedrosa, K., Schatzmayr, D., Jans, D., Bertin, G., Grenier, B. Mycotoxin reduction in animals – adsorption and biological detoxification. In Mycotoxin Reduction in Grain Chains: A Practical Guide. Edited by Logrieco, A. F., sous presse.
Grenier, B., Oswald, I. P. Mycotoxins co-contamination: meta-analysis of published data. World Mycotoxin Journal, soumis.
Communications orales à des congrès :
Grenier, B., Loureiro-Bracarense, A. P., Lucioli, J., Pacheco, G., Cossalter, A. M., Moll, W. D., Schatzmayr, G., Oswald, I. P. 2010. The issue of mycotoxins multi-contamination: example of Deoxynivalenol and Fumonisins co-contamination. 6th World Mycotoxin Forum. November 8-10.
Noordwijkerhout, Netherlands.
Grenier, B., Loureiro-Bracarense, A. P., Lucioli, J., Pacheco, G., Cossalter, A. M., Moll, W. D., Schatzmayr, G., Oswald, I. P. 2010. Individual and combined effects of low doses of deoxynivalenol and fumonisins in piglets. 9th International Symposium of Animal Biology and
Nutrition. September 23-24. Bucharest, Romania.
Grenier, B., Loureiro-Bracarense, A. P., Lucioli, J., Pacheco, G., Cossalter, A. M., Moll, W. D., Schatzmayr, G., Oswald, I. P. 2010. Effect of two Fusariotoxins, Deoxynivalenol and Fumonisin B1, on the pig: general toxicity and the immune response. 32nd Mycotoxin Workshop. June
14-16. Lyngby, Danemark.
Grenier, B., Loureiro-Bracarense, A. P., Schwartz, H., Cossalter, A. M., Schatzmayr, G., Moll, W. D., Oswald, I. P. 2010. Differential toxicity of Fumonisin B1 and its hydrolyzed form on the piglet immune response. 7th meeting of Immunology of Domestic Animals. May 17-18. Paris, France.
Grenier, B., Loureiro-Bracarense, A. P., Cossalter, A. M., Moll, W. D., Schatzmayr, G., Oswald, I. P. 2009. Evaluation des effets combinés du Deoxynivalénol et de la Fumonisine B1 sur la réponse immunitaire du porcelet. Journées d’Animation Scientifique du Département Santé Animale de
l’INRA. Mai 25-28. Port-Albret, France.
Communications affichées à des congrès :
Grenier, B., Loureiro-Bracarense, A. P., Schwartz, H., Cossalter, A. M., Schatzmayr, G., Moll, W. D., Oswald, I. P. 2010. Hydrolysis of Fumonisin B1 strongly reduced toxicity for piglets at the intestinal and systemic levels. 6th World Mycotoxin Forum. November 8-10. Noordwijkerhout,
Netherlands.
Grenier, B., Loureiro-Bracarense, A. P., Lucioli, J., Pacheco, G., Cossalter, A. M., Moll, W. D., Schatzmayr, G., Oswald, I. P. 2010. Effects of subclinical doses of deoxynivalenol and fumonisins, alone or in combination on the systemic and intestinal responses of piglets. 4th World Nutrition
Forum. October 13-16. Salzburg, Austria.
Grenier, B., Loureiro-Bracarense, A. P., Schwartz, H., Cossalter, A. M., Schatzmayr, G., Moll, W. D., Oswald, I. P. 2010. Hydrolysis of Fumonisin B1 strongly reduced toxicity for piglets at the intestinal and systemic levels. 4th World Nutrition Forum. October 13-16. Salzburg, Austria.
Grenier, B., Loureiro-Bracarense, A. P., Lucioli, J., Pacheco, G., Cossalter, A. M., Moll, W. D., Schatzmayr, G., Oswald, I. P. 2009. Combined effects of Deoxynivalenol and Fumonisin B1 on the pig immune response. Conference of International Society for Mycotoxicology. September 9-11. Tulln, Austria.
Grenier, B., Loureiro-Bracarense, A. P., Lucioli, J., Pacheco, G., Cossalter, A. M., Moll, W. D., Schatzmayr, G., Oswald, I. P. 2008. Evaluation of individual and combined effects of Deoxynivalenol and Fumonisin B1 on the pig immune response. 3rd World Nutrition Forum.
September 18-19. Mayrhofen, Austria.
1
2
TABLE DES MATIERES ... 1
LISTEDESABREVIATIONS ... 4
FIGURESETTABLEAUX ... 6
INTRODUCTION ... 8
CONTEXTEDEL’ETUDE ... 9
ETUDEBIBLIOGRAPHIQUE ... 13
1. Les mycotoxines : généralités, métabolisation et effets toxiques ... 14
2. La co-contamination en mycotoxines : méta-analyse des données publiées (revue n°1) ... 19
Introduction... 22
Caractérisation de l’interaction entre les mycotoxines ... 23
Interaction entre les différentes mycotoxines ... 24
i. interactions entre les aflatoxines et les autres mycotoxines ... 24
ii. interactions entre les fusariotoxines ... 35
iii. interactions entre l’ochratoxine A et les autres mycotoxines ... 41
Conclusion ... 45
Légende des tableaux ... 47
3. Procédés de décontamination des denrées contaminées et réduction des mycotoxines chez l’animal ... 48
3.1. Méthodes physiques et chimiques pour la décontamination du maïs contaminé (revue n°2) ... 48
Introduction... 52
i. méthodes physiques ... 53
ii. méthodes chimiques ... 61
Conclusion ... 68
3.2. Adsorption et détoxification biologique (revue n°3) ... 69
Introduction... 72
i. adsorption des mycotoxines ... 74
ii. détoxification biologique ... 84
Conclusion ... 88
TRAVAIL EXPERIMENTAL ... 90
OBJECTIFSDELATHESE ... 91
CHAPITRE1– TOXICITE IN VIVO DU DEOXYNIVALENOL ET DES FUMONISINES, SEULS OU EN COMBINAISON CHEZ LE PORCELET ... 93
1. Toxicité in vivo du deoxynivalénol et des fumonisines, seuls ou en combinaison sur la réponse immunitaire (article n°1) ... 94
Introduction... 96
Matériel & Méthodes ... 98
Résultats ... 101
Discussion ... 104
2. Toxicité in vivo du deoxynivalénol et des fumonisines, seuls ou en combinaison sur la morphologie et la réponse locale de l’intestin (article n°2) ... 107
Introduction... 110
Matériel & Méthodes ... 112
3
Discussion ... 117
Légende des Figures ... 121
CHAPITRE2– EVALUATION DE LA TOXICITE DU PRODUIT D’HYDROLYSE DE LA FUMONISINE B1 CHEZ LE PORCELET (ARTICLE N°3) ... 123
Introduction... 128
Matériel & Méthodes ... 130
Résultats ... 134
Discussion ... 137
CHAPITRE3– EVALUATION DES EFFETS D’AGENTS DETOXIFIANTS LORS D’UNE EXPOSITION AU DEOXYNIVALENOL ET AUX FUMONISINES CHEZ LE PORCELET ... 142
Résumé de l’étude ... 143
Matériel & Méthodes ... 144
Résultats ... 149
Discussion ... 156
DISCUSSION GENERALE ... 160
1. Critères expérimentaux... 161
Le modèle animal ... 161
L’exposition aux mycotoxines et à leurs dérivés ... 163
Les suppléments alimentaires : micro-organisme/enzyme a propriétés détoxifiantes ... 166
2. Les systèmes de défense de l’organisme ... 168
L’immunité systémique acquise et spécifique ... 168
Mécanisme cellulaire de modulation de l’immunité ... 173
L’immunité intestinale ... 175
3. Stratégies de lutte pour réduire les effets toxiques du deoxynivalénol et des fumonisines – approches de biotransformation ... 179
L’Eubacterium spécifique des trichothécènes ... 179
La carboxylesterase spécifique des fumonisines ... 180
La présence simultanée de la carboxylesterase et de l’Eubacterium ... 183
CONCLUSIONS ... 184
4
LISTE DES ABREVIATIONS
AF Aflatoxine AFB1 Aflatoxine B1 AFM1 Aflatoxine M1 AJ Adherens Junction ANOVA Analysis of variance
ANRT Agence Nationale de la Recherche Technique
APC Antigen Presenting Cells A.U. Arbitrary Units
b.w. body weight
BGY Bright Greenish Yellow
CAST Council for Agricultural and Sciences Technology
CIFRE Convention Industrielle de Formation par la Recherche CIT Citrinine
CMH Complexe Majeur d’Histocompatibilité ConA Concanavaline A CPA Cyclopiazonic acid cpm counts per minute DA Deactivating Agents DART Data Analysis for Real Time DAS Diacetoxyscirpenol
DC Dendritic Cells
DDGS Dried Distillers’ Grains and Solubles
DOM-1 De-époxy-déoxynivalénol DON Déoxynivalénol
EFSA European Food Safety Authority e.g. exempli gratia (par exemple) ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent
Assay
ERK Extracellular signal-Regulated Kinases
FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations
FB Fumonisine FB1 Fumonisine B1 FLD Fluorescent detection
GALT Gut-Associated Lymphoid Tissue GGT Gamma-Glutamyl Transferase HACCP Hazard Analysis Critical Control Point HE Hématoxyline-Eosine
HFB Hydrolyzed Fumonisin HFB1 Hydrolyzed Fumonisin B1 HPLC High Performance Liquid
Chromatography HRP Horseradish peroxydase HSCAS Hydrated Sodium Calcium
Aluminosilicate H2O2 Hydrogen peroxyde
IARC International Agency for Research on Cancer
5 IFN Interféron
IBD Inflammatory Bowel Disease Ig Immunoglobuline
IL Interleukine
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
IPEC-1 Intestinal Porcine Epithelial Cells-1 kGy kilogray
LD Limite de Détection
MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase MIP Macrophage Inflammatory Protein MLN Mesenteric Lymph Nodes
MON Moniliformine MS Mass Spectrometry NIV Nivalénol
NTC Non Template Control OTA Ochratoxine A
OVA Ovalbumine
PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PAS Period Acid-Schiff
PCR Polymerase Chain Reaction ppb partie par milliard (e.g. µg/kg)
ppm partie par million (e.g. mg/kg) pv poids vif
RPL32 Ribosomal Protein L32 RT Reverse Transcription Sa Sphinganine
SDS Sodium Dodecyl Sulfate SEM Standard Error Mean So Sphingosine
TEER Résistance électrique transépithéliale
TCA Tricarballylic acids side chains TCT Trichothécènes
Th T helper cells TJ Tight Junction
TNF Tumor Necrosis Factor T-2 Toxine T-2
UE/EU Union Européenne/European Union USFDA United State Food and Drug
Administration ZEA Zéaralénone µCi µCurie
6
FIGURES ET TABLEAUX
Figure 1 : Mycotoxines majeures produites par les champignons et se retrouvant à l’état naturel dans différents produits de consommation……… 9 Figure 2 : Tentation de Saint Antoine peint entre 1512 et 1516 par Grünewald, et épis parasités par
Claviceps purpurea, excroissance (sclérote) qui s’accroche aux épis de seigle………. 9 Figure 3 : Diversité structurelle des mycotoxines majeures……… 10 Figure 4 : Caractérisation de l’interaction entre les mycotoxines………23 Figure 5 : Effet individuel et combiné du DON et de la FB sur l’histologie du jéjunum et de l’iléon... 115 Figure 6 : Effet individuel et combiné du DON et de la FB sur le nombre de cellules inflammatoires et de cellules caliciformes dans le jéjunum et l’iléon……….. 115 Figure 7 : Effet individuel et combiné du DON et de la FB sur l’expression des ARNs codant des cytokines dans le jéjunum……… 116 Figure 8 : Effet individuel et combiné du DON et de la FB sur l’expression des ARNs codant des cytokines dans l’iléon……….. 116 Figure 9 : Effet individuel et combiné du DON et de la FB sur l’expression intestinale de l’E-cadhérine et de l’occludine……….. 116 Figure 10 : Réaction de deestérification par la carboxylestérase sur la Fumonisine B1, résultant en Fumonisine B1 totalement hydrolysée, et cinétique in vitro d’hydrolyse de la Fumonisine B1 par la carboxylestérase………. 124 Figure 11 : Effets des traitements FB1 et HFB1 sur les lésions du foie………. 134 Figure 12 : Effets des traitements FB1 et HFB1 sur l’intestin grêle………. 135 Figure 13 : Transformation par voie enzymatique de l’ochratoxine A et de la zéaralénone, via l’utilisation du microorganisme Trichosporon mycotoxinivorans, et transformation par voie enzymatique des trichothécènes de type A et B, via l’utilisation du microorganisme Eubacterium
BBSH 797……….. 143 Figure 14 : Illustrations de la procédure d’incorporation dans l’aliment de l’agent désactivateur ciblant spécifiquement les fumonisines……….... 144 Figure 15 : Plan expérimental de la phase animale avec le protocole de vaccination……….. 145 Figure 16 : Effet de l’exposition aux mycotoxines avec un régime alimentaire supplémenté ou non en agents désactivateurs sur les bases sphingoïdes, sphinganine (Sa) et sphingosine (So)………. 150 Figure 17 : Effet de l’exposition aux mycotoxines avec un régime alimentaire supplémenté ou non en agents désactivateurs sur le score lésionnel du foie………. 151 Figure 18 : Effet de l’exposition aux mycotoxines avec un régime alimentaire supplémenté ou non en agents désactivateurs sur le score lésionnel des poumons……….. 152 Figure 19 : Effet de l’exposition au DON avec un régime alimentaire supplémenté ou non en agents désactivateurs sur la hauteur des villosités du jéjunum………. 152 Figure 20 : Effet de l’exposition aux mycotoxines avec un régime alimentaire supplémenté ou non en agents désactivateurs sur la prolifération des lymphocytes après stimulation antigénique……… 154 Figure 21 : Effet de l’exposition aux mycotoxines avec un régime alimentaire supplémenté ou non en agents désactivateurs sur la concentration plasmatique des immunoglobulines A et G spécifiques de l’ovalbumine……….. 154 Figure 22 : Effet de l’exposition aux mycotoxines avec un régime alimentaire supplémenté ou non en agents désactivateurs sur l’expression des ARNs spléniques codant pour des cytokines……….. 155 Figure 23 : Cheptel porcin des principaux pays producteurs en 2005, et évolution des échanges mondiaux de viande de porc……….. 161 Figure 24 : Effets toxicologiques provoqués chez le porc par l’ingestion des mycotoxines majeures 168
7
Figure 25 : Hypothèses proposées dans l’altération de la mise en place de la réponse spécifique, d’après les résultats obtenus dans le chapitre 1 sur l’effet du DON et de la FB, seuls ou en
combinaison……….. 169
Figure 26 : Mécanisme d’inhibition de la céramide synthase par les fumonisines et implication dans le métabolisme des sphingolipides………. 170
Figure 27 : Vue globale de la muqueuse intestinale, et des compartiments et des acteurs clés du système de défense de l’intestin………. 175
Figure 28 : Réseau qui constitue le système de perméabilité paracellulaire de l’intestin, impliquant les protéines de jonction……….. 176
Figure 29 : Effets d’exposition à des mycotoxines chez l’homme et l’animal………. 185
Figure 30 : Graphique sur l’analyse mondiale de denrées agricoles. Représentation du nombre de mycotoxines détectées dans les échantillons, et par conséquent de la fréquence des multi-contaminations………... 186
Tableau 1 :Interaction entre les Aflatoxines et les Fumonisines……… 24
Tableau 2 :Interaction entre les Aflatoxines et l’Ochratoxine A………. 27
Tableau 3 :Interaction entre les Aflatoxines et les Trichothécènes………. 31
Tableau 4 :Interaction entre les Aflatoxines et les autres mycotoxines……… 33
Tableau 5 :Interaction entre les fusariotoxines………. 35
Tableau 6 :Interaction entre l’Ochratoxine A et les autres mycotoxines………. 41
Tableau 7 :Evaluation toxicologique des procédés de décontamination du maïs………. 58
Tableau 8 : Résultats des effets des HSCAS dans les aliments contaminés en AFB1 chez différentes espèces……….... 75
Tableau 9 : Résultats des effets des parois de levure dans les aliments contaminés en mycotoxines chez différentes espèces……….. 80
Tableau 10 : Origines et dilutions des anticorps primaires utilisés pour la détection des protéines de jonction et de la β-actine en Western Blot……….. 113
Tableau 11 : Séquence nucléotidique des primers utilisés en PCR temps réel……….. 114
Tableau 12 : Séquence nucléotidique des primers utilisés en PCR temps réel……….. 132
Tableau 13 : Effets des traitements FB1 et HFB1 sur les paramètres biochimiques……….. 134
Tableau 14 : Effets des traitements FB1 et HFB1 sur l’expression des cytokines du foie……… 134
Tableau 15 : Effets des traitements FB1 et HFB1 sur le ratio sphinganine/sphingosine dans les échantillons biologiques……… 135
Tableau 16 : Effets des traitements FB1 et HFB1 sur la hauteur des villosités dans l’intestin grêle… 135 Tableau 17 : Effets des traitements FB1 et HFB1 sur l’expression des cytokines dans l’intestin grêle et dans les ganglions mésentériques……….. 135
Tableau 18 : Régimes formulés et teneurs finales en mycotoxines……… 144
Tableau 19 : Effet de l’exposition aux mycotoxines avec un régime alimentaire supplémenté ou non en agents désactivateurs sur le gain de poids total……… 149
Tableau 20 : Effet de l’exposition aux mycotoxines avec un régime alimentaire supplémenté ou non en agents désactivateurs sur certains paramètres hématologiques et biochimiques à J35……….. 149
Tableau 21 : Effet de l’exposition aux mycotoxines avec un régime alimentaire supplémenté ou non en agents désactivateurs sur l’index de prolifération des hépatocytes……… 150
Tableau 22 : Effet de l’exposition aux mycotoxines avec un régime alimentaire supplémenté ou non en agents désactivateurs sur la population cellulaire et la prolifération cellulaire du jéjunum et de l’iléon……….. 153
Tableau 23 : Teneurs maximales recommandées en mg/kg pour un aliment pour animaux ayant un taux d’humidité de 12%... 161
Tableau 24 : Analyse de denrées agricoles de janvier à décembre 2009 et détermination des niveaux de contaminations mondiales en mycotoxines………. 164
8
Figure 1 :
Mycotoxines majeures produites par les champignons et se retrouvant à l’état naturel dans différents produits de consommation
INTRODUCTION
9
CONTEXTE DE L’ETUDE
Les mycotoxines sont des produits du métabolisme secondaire de moisissures pouvant se développer sur la plante au champ ou en cours de stockage, et douées de potentialités toxiques à l’égard de l’homme et des animaux. Les moisissures toxinogènes peuvent se développer sous tous les climats, sur tous les supports solides ou liquides, dès l’instant qu’il y a des éléments nutritifs et de l’humidité (activité en eau Aw supérieure à 0,6).
Les toxines produites se retrouvent ainsi à l’état de contaminants naturels dans de nombreuses denrées d’origine végétale, notamment les céréales (maïs, blé, orge, soja) mais aussi les fruits, noix, amandes, grains, fourrages, et les aliments composés et manufacturés contenant ces matières premières destinés à l’alimentation humaine et animale (Figure 1).
Il a été recensé que les mycotoxines contaminent 25 à 40 % des productions céréalières mondiales, à des niveaux mesurables. Leurs effets toxiques sur l’homme et l’animal, leur stabilité lors des processus de transformation et de cuisson des aliments, et leur présence sur de nombreux produits agricoles justifient ainsi l’attention croissante qui leur est portée (nombreuses recherches en cours, renforcement de la législation en Europe).
Historiquement, de nombreuses pathologies liées à des épisodes de contamination en mycotoxines ont été rapportés. L’une des plus connues s’est produite au Moyen-Age, également appelée le « Mal des Ardents » ou « Feu de Saint-Antoine », et provoquée par les toxines de
Claviceps élaborées par l’ergot de seigle (Figure 2).
Figure 2 :
Tentation de Saint Antoine peint entre 1512 et 1516 par Grünewald (photo à droite)
Epis parasités par Claviceps purpurea, excroissance (sclérote) qui s’accroche aux épis de seigle (photo ci-dessous)
Fumonisine B1
Déoxynivalénol
Aflatoxine B1
Ochratoxine A
Zéaralénone
Patuline
Figure 3 :
INTRODUCTION
10
Elle se présentait sous la forme de délires, prostrations, douleurs violentes, abcès, gangrènes des extrémités aboutissant à des infirmités graves et incurables. Des épidémies ont sévi du 8ème au 16ème siècle en raison des conditions d’alimentation misérables des populations, en particulier la consommation de farines contaminées par les sclérotes de ces champignons. De la même manière, les fusariotoxines (toxine T-2 et zéaralenone) sont considérées comme responsables du déclin de la civilisation Étrusque et de la crise athénienne cinq siècles avant J.-C. Certains tombeaux égyptiens ont également été suspectés de renfermer des moisissures sécrétant une mycotoxine, l’ochratoxine A, qui aurait été responsable de la « malédiction des Pharaons ». La littérature vétérinaire rapporte de nombreux cas de mycotoxicoses, notamment le syndrome de Turkey X ou « maladie de la dinde », qui a décimé en Angleterre des milliers de dindes, de canetons et autres animaux domestiques dans les années 1960. Elle a permis de découvrir les aflatoxines, mycotoxines produites par Aspergillus
flavus en quantités importantes dans la farine d’arachide importée d’Amérique latine dont se
nourrissaient les volailles.
Mais de nos jours en Europe, il demeure exceptionnel d’être exposé à des doses toxiques en une seule ingestion d’aliments contaminés, provoquant ainsi une « mycotoxicose » aiguë. Les effets chroniques (exposition répétée à de faibles voire très faibles doses) sont les plus redoutés en raison des habitudes alimentaires et du pouvoir de rémanence de ces toxines.
Les mycotoxines peuvent être classées en polycétoacides, terpènes, cyclopeptides et métabolites azotés selon leur origine biologique et leur structure (Figure 3). On peut aussi classer les mycotoxines plus simplement selon leurs principaux effets toxiques. On distingue parmi les groupes de mycotoxines considérées comme importantes du point de vue agro-alimentaire et sanitaire les aflatoxines, les ochratoxines et l’ochratoxine A en particulier, la patuline, les fumonisines, la zéaralènone et les trichothécènes et tout spécialement le déoxynivalénol (Figure 3).
Un aspect important mais pourtant peu documenté concerne la présence simultanée de plusieurs mycotoxines dans les denrées alimentaires. En effet, une même moisissure a la capacité de produire différentes mycotoxines. A l’inverse, une même mycotoxine pourra être produite par plusieurs espèces et genres de moisissures. Ainsi, plusieurs toxines d’une même famille structurale ou présentant des structures différentes peuvent se retrouver dans le même produit alimentaire et, a
fortiori, dans une ration composée de divers ingrédients alimentaires : on parle alors de
multi-contamination. Cette situation naturelle pose des interrogations sur les interactions toxiques qui peuvent s’opérer et ainsi pourrait se traduire par un effet antagoniste ou additif ou encore synergique. De plus, les recommandations et régulations actuelles ne fixent des seuils que pour une mycotoxine et ne tiennent pas compte des contaminations avec plusieurs mycotoxines.
INTRODUCTION
11
Une partie du travail de thèse a donc consisté à étudier l’interaction de deux mycotoxines, le deoxynivalenol et la fumonisine, à des faibles doses. En effet, la co-contamination par ces deux toxines majeures produites par des champignons du genre Fusarium, a été rapportée lors d’échantillonnage de denrées agricoles, et sont d’intérêt majeur en termes d’ubiquité et de toxicité. De plus, ces résultats s’inscrivent dans une étude bibliographique que nous avons réalisée et présentée dans ce mémoire, sur les données toxicologiques actuelles, rapportant les résultats d’expérience in vivo suite à l’exposition à des toxines seules ou en combinaison.
L’autre partie du travail de thèse a consisté à évaluer l’efficacité d’agents détoxifiants de mycotoxines, dans le cadre de notre collaboration avec l’industriel BIOMIN.
En effet, le risque mycotoxique étant d’origine naturelle, l’homme n’en maîtrise pas la survenue qui est notamment liée aux conditions climatiques, et ainsi la contamination fongique est difficilement contrôlable. Par conséquent, le contrôle du niveau de contamination des aliments exige l’emploi de stratégies variées et complémentaires. Des méthodes préventives telles que des pratiques culturales adaptées existent pour diminuer le risque de prolifération des moisissures. Cependant, l’élimination totale du risque fongique et mycotoxique est impossible.
Les stratégies impliquant le tri et/ou la destruction des denrées contaminées sont peu réalistes du fait de leur coût économique important. Par ailleurs, la dilution des aliments contaminés afin d’abaisser le niveau de contamination en-dessous des normes réglementaires, a été interdite en Europe à partir de juillet 2003. Ces méthodes d’élimination ou de réduction des teneurs en mycotoxines, directement sur les matières brutes, sont détaillées dans le présent manuscrit, suite à la publication d’un chapitre sur les méthodes physiques et chimiques existantes.
Une autre façon d’augmenter la qualité sanitaire des aliments est l’utilisation de ligands minéraux et organiques ou de micro-organismes/enzymes détoxifiant les mycotoxines afin de limiter l’absorption des mycotoxines dans l’organisme de l’animal. Cet aspect est également détaillé dans le mémoire de thèse, suite à un chapitre complémentaire sur les alternatives biologiques. Nous présenterons également les résultats d’une des méthodes développées par la société BIOMIN, concernant l’action d’une enzyme sur la fumonisine B1, mycotoxine prédominante de la famille des fumonisines et une des toxines les plus difficiles à éliminer.
Grâce à nos installations au sein du pôle ToxAlim, les phases animales expérimentales ont été conduites sur le porc. D’un point de vue agronomique, les animaux monogastriques d’élevage tels que le porc et la volaille sont particulièrement exposés aux mycotoxines du fait de l’importance de la part des céréales dans leur alimentation. De plus, ces animaux et en particulier le porc sont très sensibles aux mycotoxines, du fait de l’absence de réservoir ruminal, connu pour contenir des micro-organismes capables de dégrader les toxines avant leur absorption intestinale. Finalement,
INTRODUCTION
12
l’utilisation de ce modèle animal permet aussi d’extrapoler nos données à l’homme, considérant la similarité de leurs systèmes immunitaire et digestif.
INTRODUCTION
13
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
L’étude bibliographique réalisée se présente sous la forme de deux grandes parties, précédées d’une brève introduction sur les mycotoxines majeures, en termes d’occurrence et de toxicité. La première grande partie est une revue exhaustive sur les expériences menées in vivo et qui caractérise les interactions des mycotoxines. La seconde partie présente les méthodes développées pour neutraliser, éliminer et décontaminer les denrées alimentaires contaminées en mycotoxines. Comme indiqué précédemment, la présence de plusieurs mycotoxines en même temps n’est pas un cas isolé mais plutôt une situation fréquente. Les relevés de terrain et les études toxicologiques sur les multi-contaminations sont encore peu nombreux contrairement aux données individuelles, et par conséquent la connaissance du risque pour la santé humaine et animale est limitée. Nous présentons donc une synthèse des résultats d’expériences in vivo, où des animaux ont été exposés à deux toxines, seules ou en combinaison. A partir des données brutes, nous avons classé paramètre par paramètre l’effet des mycotoxines en association, tel que synergique, additif, moins qu’additif ou antagoniste. De par son aspect exhaustif, cette revue résume l’état actuel des connaissances sur l’interaction des mycotoxines chez l’animal.
La contamination en mycotoxines étant peu maîtrisable, de nombreuses approches pour réduire ou éliminer les mycotoxines ont été développées, et certaines intégrées dans les chaînes de production et/ou appliquées en aval dans les élevages. Ces stratégies sont présentées sous forme de deux chapitres en cours de publication dans un ouvrage scientifique. Le premier rapporte les méthodes physiques et chimiques qui agissent directement sur les denrées alimentaires contaminées. Nous présentons l’efficacité de ces techniques expérimentales ou appliquées, et aussi la toxicité potentielle des denrées modifiées physiquement et chimiquement. Le second chapitre traite des méthodes biologiques qui agissent directement dans le tractus gastro-intestinal des animaux, suite à l’ingestion d’aliments contaminés. Nous pouvons distinguer les approches basées sur la capacité d’adsorption des mycotoxines par des ligands minéraux ou organiques, et sur la capacité de biotransformation des toxines par voie enzymatique.
INTRODUCTION
14
1. Les mycotoxines : généralités, métabolisation et effets toxiques
Les mycotoxines sont des molécules de faible masse moléculaire issues du métabolisme secondaire des moisissures. Plus de 300 métabolites secondaires ont été identifiés mais seule une trentaine possède de réelles propriétés toxiques préoccupantes.
Les effets toxiques sont de nature variée. Certaines toxines exercent un pouvoir hépatotoxique (aflatoxines), d’autres se révèlent oestrogéniques (zéaralénone), immuno/hématotoxiques (patuline, trichothécènes, fumonisines), dermonécrosantes (trichothécènes), néphrotoxiques (ochratoxine A) ou neurotoxiques (toxines trémorgènes). Certaines mycotoxines sont reconnues ou suspectées d’être cancérogènes.
Pour les consommateurs humains, un autre type de risque est indirect car induit par la présence possible de résidus dans les productions issues des animaux de rente exposés à une alimentation contaminée par les mycotoxines. Ces résidus correspondent à la toxine elle-même et/ou à des métabolites bioformés conservant les propriétés toxiques du composé parental. Les espèces d’élevage peuvent donc constituer un vecteur de ces toxines ou de leurs métabolites dans des productions telles que les abats, le lait ou le sang. C’est le cas notamment de l’aflatoxine B1, dont le métabolite l’aflatoxine M1 est retrouvé dans le lait des mammifères lorsque ceux-ci ont ingéré des aliments contaminés par l’aflatoxine B1.
Les mycotoxines sont généralement thermostables et ne sont pas détruites par les procédés habituels de cuisson et de stérilisation. Leur capacité à se lier aux protéines plasmatiques et leur lipophilie en font des toxiques capables de persister dans l’organisme en cas d’expositions répétées et rapprochées.
Les animaux monogastriques d’élevage, porcs et volailles sont particulièrement exposés aux mycotoxicoses du fait de l’importance de la part de céréales dans leur alimentation et de l’absence de réservoir ruminal contenant des micro-organismes capables de dégrader les toxines avant leur absorption intestinale.
En France, en dehors de cas sporadiques correspondant à des accidents aigus observables dans différentes espèces animales, l’essentiel des problèmes est lié à une contamination chronique par les fusariotoxines (trichothécènes, zéaralénone, fumonisines) des aliments produits en France ou importés. Les problèmes ponctuels dus à l’importation de matières premières contaminées justifient des procédures de surveillance et de contrôle.
INTRODUCTION
15
a) Les aflatoxines (voir la revue de Meissonnier et al., 2005)
Chez les animaux monogastriques, l’absorption pourrait représenter près de 90% de la dose administrée. Après absorption, les aflatoxines (AF) sont véhiculées dans l’organisme après fixation sur les protéines plasmatiques, c’est le cas de l’Aflatoxine B1 (AFB1) liée à l’albumine. La présence de cet adduit dans le sérum peut servir de bio-indicateur d’exposition.
La plus toxique des quatre aflatoxines naturelles est l’AFB1, viennent ensuite par ordre décroissant de toxicité l’AFG1 puis les AFG2 et AFB2. Les effets des aflatoxines sont principalement liés à l’action toxique des époxydes formés par l’action du système enzymatique réactionnel des mono-oxygénases à cytochromes P450. Ainsi l’AFB1 8,9-époxyde conduit à la formation d’adduits à l’ADN en créant des liaisons avec les bases guanines, et pouvant entraîner des effets carcinogènes. En raison de ses capacités de bioactivation, le foie est la cible principale des aflatoxines. L’exposition à l’AFB1 peut aboutir à un cancer hépatique surtout lorsqu’elle est associée à une infection par le virus de l’hépatite B ou C. Chez l’animal, AFB1 exerce des propriétés immunosuppressives affectant en particulier l’immunité à médiation cellulaire par inhibition de la phagocytose, diminution de la production de radicaux oxygénés et altération de la production de cytokines. La réactivation d’infections parasitaires et la diminution de l’efficacité vaccinale ont été mises en évidence expérimentalement sur plusieurs modèles animaux après administration d’AFB1. b) L’ochratoxine A (voir revue de Pfohl-Leszkowicz & Manderville, 2007)
L’ochratoxine A (OTA) est connue pour sa nephrotoxicité. Elle serait l’un des facteurs potentiels à l’origine de troubles rénaux chez l’homme, connus sous le nom de Néphropathie Endémique des Balkans. Elle s’avère également immunotoxique, tératogène et neurotoxique.
L’OTA est d’abord absorbée dans l’estomac en raison de ses propriétés acides. Néanmoins, le site majeur d’absorption de l’OTA est l’intestin grêle avec une absorption maximale au niveau du jéjunum proximal. Elle est hydrolysée en OTα non toxique par la carboxylpeptidase A et la chymotrypsine ainsi que par les flores microbiennes (rumen des polygastriques et gros intestin chez toutes les espèces). Au niveau hépatique, l’OTA est transformée en des métabolites mineurs qui permettent une détoxification partielle.
Au niveau immunitaire, l’un des effets les plus notables de l’OTA est la diminution de la taille des organes lymphoïdes, probablement par un mécanisme nécrotique ou apoptotique.
INTRODUCTION
16
c) La zéaralénone (voir rapport de l’AFSSA, 2009)
Les propriétés physiques et chimiques de la zéaralénone (ZEA) et notamment son hydrophobicité sont des caractéristiques favorables à une large diffusion à l’intérieur des tissus. Les différentes études de pharmaco-cinétique montrent d’ailleurs que la ZEA est absorbée rapidement après administration orale et peut être métabolisée par le tissu intestinal. La ZEA et ses dérivés ont la capacité de se fixer de façon compétitive sur les récepteurs oestrogéniques cellulaires. La ZEA est donc un perturbateur endocrinien. Sa fixation est due à sa capacité à adopter une conformation similaire aux oestrogènes naturels tels que les 17β-estradiol.
Chez l’homme, la ZEA est suspectée d’une vague de changements pubertaires chez des milliers de jeunes enfants à Porto-Rico. Des toxicoses aux Etats-Unis, en Chine, au Japon et en Australie ont été liées à la présence de ZEA dans les denrées alimentaires.
Les différentes propriétés d’absorption, de distribution, de biotransformations et d’excrétion de la ZEA chez différents animaux ont été résumées par Gaumy et al. (2001). Plusieurs métabolites tels que les α et β zéaralénols et α et β zéaralanols peuvent être formés. Ils peuvent ensuite subir une glucurono-conjugaison. L’α-zéaralénol est un métabolite 3 à 4 fois plus actif que la molécule initiale. Le porc est particulièrement sensible à la ZEA. Le taux de survie de l’embryon est notamment diminué pour les femelles en gestation ayant ingéré de la ZEA.
Plusieurs altérations des paramètres immunologiques ont été montrées in vitro après exposition de lymphocytes à la ZEA : inhibition de la prolifération lymphocytaire après stimulation par un mitogène, augmentation de la production d’IL-2 et d’IL-5. Par contre, aucune étude réalisée in vivo ne montre d’immunotoxicité de la ZEA.
d) Les trichothécènes (voir rapport de l’AFSSA, 2009) La toxine T-2
Chez l’animal, la toxine T-2 est rapidement absorbée après ingestion et distribuée dans l’organisme sans accumulation dans un organe spécifique. La toxine T-2 est rapidement métabolisée par déacétylation, hydroxylation, glucuronoconjugaison et dé-époxydation : la principale voie de biotransformation est une déacétylation qui aboutit à la formation de toxine HT-2.
La toxine T-2 est probablement à l’origine de l’Aleucie Toxique Alimentaire, maladie qui a touché des milliers de personnes en Sibérie pendant la seconde guerre mondiale. Elle provoque chez l’animal une perte de poids, des vomissements, des dermatoses sévères et des hémorragies pouvant entraîner la mort. La toxine T-2 possède des propriétés immunosuppressives intervenant à la fois sur
INTRODUCTION
17
le nombre de macrophages, de lymphocytes et d’érythrocytes. Elle inhibe la synthèse protéique et la synthèse d’ADN et d’ARN.
Le déoxynivalénol
La biodisponibilité du deoxynivalénol (DON) est extrémement variable selon les espèces animales, allant de 10% chez les ovins à plus de 50% chez le porc. Le DON est un inhibiteur de la synthèse protéique, inhibant l’élongation de la chaîne protéique.
Le DON, communément appelé vomitoxine, provoque des vomissements chez le porc induisant une réduction de la consommation alimentaire, une diminution du gain de poids et des perturbations de certains paramètres sanguins. L’impact du DON sur le système immunitaire a été relativement étudié, montrant une augmentation de la sensibilité face à certains pathogènes ou encore une diminution de l’efficacité vaccinale. Par ailleurs, l’ingestion prolongée de DON provoque une augmentation de la concentration des IgA, pouvant induire une néphropatie à IgA.
e) Les fumonisines (voir rapport de l’EFSA, 2005)
Chez l’animal, après administration par voie orale, la fumonisine B1 (FB1), la plus toxique des fumonisines, est faiblement absorbée et se retrouve majoritairement dans les fecès. La biodisponibilité est évaluée de 1 à 6% selon l’espèce. La majeure partie de la toxine absorbée se retrouve dans le foie et les reins.
Les fumonisines agissent en particulier sur la synthèse des sphingolipides, en inhibant de façon compétitive l’activité de la céramide synthase. Cette perturbation de la synthèse des sphingolipides entraîne une accumulation de bases sphingoïdes (la sphinganine et la sphingosine) et une déplétion en céramide et en sphingolipides complexes. Ceci a de multiples conséquences sur la physiologie cellulaire, puisque les bases sphingoïdes et les céramides sont des second messagers impliqués dans de nombreuses fonctions telles que l’apoptose, la croissance et la différenciation cellulaire, l’inflammation ou encore la sécrétion protéique. Par ailleurs, les sphingolipides sont des constituants structuraux essentiels des membranes cellulaires et la FB1 peut provoquer une atteinte de l’intégrité membranaire.
Pour toutes les espèces animales étudiées, le foie est la principale cible de la FB1. Les reins sont également affectés chez de nombreuses espèces, notamment les rongeurs. Mais la particularité de cette toxine est la capacité d’induire lors d’intoxications aigües des troubles spécifiques de l’espèce cible. Ainsi, à forte dose la FB1 est capable d’induire des oedèmes pulmonaires chez les porcins, des
INTRODUCTION
18
leucoencéphalomalacies chez les équidés, des lésions rénales et hépatiques chez les rongeurs, ou encore d’induire des cancers de l’œsophage et des anomalies du tube neural chez l’homme.
INTRODUCTION
19
2. La co-contamination en mycotoxines : méta-analyse des données publiées
Due à leur grande diversité structurale, la toxicité induite par les mycotoxines est très différente et varie en fonction de la cible cellulaire et tissulaire, mais aussi de l’espèce cible. Ainsi, il est très compliqué de prédire l’effet de leurs interactions, en se basant simplement sur les effets individuels. Néanmoins, lorsque certaines mycotoxines ou famille de mycotoxines ont des modes d’action similaires ou partagent des propriétés toxiques communes, telles que des effets immunosuppresseurs, mutagènes ou tératogènes, un effet au moins additif est attendu lors de leur association chez l’homme ou l’animal. Cette revue reporte l’analyse de plus de 100 expériences invivo publiées dans la littérature, avec un plan factoriel 2 x 2, i.e. avec les effets individuels et
combinés des mycotoxines. Pour chaque paramètre analysé, nous avons reporté l’effet de l’interaction tel que synergique, additif, moins qu’additif ou antagoniste. A noter que les interactions impliquant les aflatoxines représentent plus de la moitié des études reportées.
Cette revue, écrite sous la direction d’Isabelle Oswald, a été soumise en janvier 2011 dans le World Mycotoxin Journal.
INTRODUCTION
20
Mycotoxins co-contamination : meta-analysis of published data
B. GRENIER1,2 & I. P. OSWALD1
1 INRA, Unité ToxAlim, Toulouse, France.
2 BIOMIN Research Center, Technopark 1, Tulln, Austria.
Address correspondence to Dr Isabelle P. Oswald INRA-Unité ToxAlim 180 chemin de Tournefeuille BP 93173 31027 Toulouse Cedex 3 Phone : +33561285480 E-Mail : isabelle.oswald@toulouse.inra.fr
INTRODUCTION
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ABSTRACT
Most fungi are able to produce several mycotoxins simultaneously; moreover food and feed can be contaminated by several fungi species at the same time. Thus, humans and animals are generally not exposed to one mycotoxin but to several toxins at the same time. Most of the studies concerning the toxicological effect of mycotoxins have been carried out taking into account only one mycotoxin. In the present review, we analyzed 112 reports where laboratory or farm animals were exposed to a combination of mycotoxins, and we determined for each parameter measured the type of interaction that was observed. Most of the published papers concern interactions with aflatoxins and other mycotoxins, especially fumonisins, ochratoxin A and trichothecenes. A few papers also investigated the interaction between ochratoxin A and citrinin, or between different toxins from
Fusarium species. Only, experiments with a 2 x 2 factorial design with individual and combined
effects of the mycotoxins were selected. Based on the raw published data, we classified the interactions in four different categories: synergistic, additive, less than additive or antagonistic effects.
This review highlights the complexity of mycotoxins interactions which varies according to the animal species, the dose of toxins, the length of exposure but also the parameters measured.
INTRODUCTION
22
INTRODUCTION
Food safety is a major issue throughout the world. In this respect, much attention needs to be paid to the possible contamination of food and feed by fungi and the risk of mycotoxin production. Mycotoxins are secondary metabolites produced by fungi, mainly by species from the genus
Aspergillus, Fusarium and Penicillium. Mycotoxins are very common contaminants of cereals.
Furthermore, most mycotoxins are resistant to milling, processing and heating and, therefore, readily enter the food and feed chains (Bullerman and Bianchini, 2007). The toxicological syndromes caused by ingestion of such toxins range from acute mortality, to slow growth and reduced reproductive efficiency. Consumption of fungal toxins may also result in impaired immunity and decreased resistance to infectious diseases (Oswald and Comera, 1998).
Most fungi are able to produce several mycotoxins simultaneously in separate feedstuffs, and considering, it is a common practice to use multiple grain sources in animals diets, the risk to be exposed to several mycotoxins at the same time increases. This is supported by global surveys that indicate humans and animals are generally exposed to more than one mycotoxin (Bermudez et al., 1997; Boeira et al., 2000; Monbaliu et al., 2010; Rodrigues and Griessler, 2010; Speijers and Speijers, 2004; Wangikar et al., 2004b). The toxicity of combinations of mycotoxins cannot always be predicted based upon their individual toxicities. Interactions between concomitantly occurring mycotoxins can be antagonistic, additive, or synergistic. The data on the in vivo combined toxic effects of mycotoxins are limited and therefore, the health risk from exposure to a combination of mycotoxins is incomplete.
The aim of this review is to summarize the published experiments, where laboratory and farm animals were exposed to a combination of mycotoxins and to describe, parameter by parameter, the type of interaction observed.
Synergistic
interaction
Antagonistic
interaction
0 2 4 6 8 10Cont Tox A Tox B Tox A+B 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10
Potentialization Type 2 Type 3
Type 1
Type 2
Cont Tox A Tox B Tox A+B Cont Tox A Tox B Tox A+B Cont Tox A Tox B Tox A+B
Cont Tox A Tox B Tox A+B 0 2 4 6 8 10 Type 2
Cont Tox A Tox B Tox A+B
Additive
interaction
0 2 4 6 8 10Cont Tox A Tox B Tox A+B
Less than additive
interaction
0 2 4 6 8 10Cont Tox A Tox B Tox A+B
0 2 4 6 8 10 Type 1
Cont Tox A Tox B Tox A+B
INTRODUCTION
23
CHARACTERIZATION OF THE DIFFERENT INTERACTIONS BETWEEN MYCOTOXINS
In the present review, in order to be consistent among the different papers, we went back to the original published raw data, and for each parameter that was measured, we classified the interaction in four different categories: synergistic, additive, less than additive and antagonistic effect.
- The “synergy” category was complex and we could differentiate 3 types of synergistic interaction (Figure 4) :
Synergism type 1: contains experiments where the effect of the mycotoxins combination was greater than expected from the sum of the individual effects of the two toxins. We also included in this category, experiments where one toxin did not display any effect but where the effect of the co-contaminated treatment was greater than the effect of the other toxin alone (potentialization, P).
Synergism type 2: the two mycotoxins induce opposite effects and the combined treatment induces an effect greater than the individual effect. So even though the toxins have opposite individual effects, the interaction led to an exacerbated effect.
Synergism type 3: the two mycotoxins induce similar effects and the combined treatment induces an opposite effect than the individual effects.
- The “additive” category includes experiments where the effect of the combination could be calculated as the sum of the individual effects of the two toxins (Figure 4).
- The “less than additive” category includes experiments where the effect of the combined treatment mainly reflected the effect of only one of the toxin without additional effect of the other toxin (Figure 4).
- We also differentiated 2 types of antagonistic interaction (Figure 4) :
Antagonism type 1: the two mycotoxins induce similar effects and the combined treatment induces a lower effect. So, the combination lowered the effect of the more potent toxin. Antagonism type 2: the two mycotoxins don’t induce the same effects and the combined
treatment induces an effect intermediate between the two individual treatments. So, the combination lowered the effect of one of the toxin.
Results of the interaction were only reported, where significant differences were observed between the control group (no mycotoxin) and at least one of the mycotoxin-contaminated group (mycotoxin A, mycotoxin B or mycotoxin A+B), on parameters measured at the end of the experiment. Regarding histopathological analysis, few studies scored the incidence and severity of lesions; so we could not have analyzed the results based on the raw data, and include them in the different tables. Nevertheless, we included the conclusions as indicated by the authors in the text.
