Vue d’ensemble des régimes de base

85 As discussões iniciais a respeito da interpretação química da perda de peptídeos do método SCX×RP-MS/MS foram previamente discutidas em Batiston (2015). [36] Contudo, naquele momento não havia uma explicação plausível de como as propriedades físico-químicas dos peptídeos poderiam interferir na perda dos peptídeos do método em questão.

Figura 17 - Comandos do MATLAB para a geração do modelo químico-matemático, referente à Figura 16.

>> x=[−3:3]; >> y=x; >> x=linspace(−3,3,100); y=x; >> [x,y]=meshgrid(x,y); >> z=1.7./(1.75+(x+1.5).^2+y.^2)+1.4./(1.75+(x−1.5).^2+(y−1).^2); >> mesh(x,y,z); >> surf(x,y,z);

Fonte: Autoria própria.

As informações da Figura 16 permite entender a razão da perda de peptídeos ou porque estes não foram detectados no nosso método (LC×LC-MS/MS). Assim, nós assumimos que a pressão do gás nebulizador (N2) entre 1,2 bar para os peptídeos com baixa hidrofobicidade e 1,6

bar para os peptídeos com alta hidrofobicidade determina a eletronebulização eficiente na escala capilar, referente a interface entre a cromatografia líquida e o espectrômetro de massas. [29] Ressaltamos, que a coluna cromatográfica utilizada neste estudo possui diâmetro interno de 300 µm com vazão de 8 µL min−1. Nestas condições, torna-se necessário a utilização de um gás secante proveniente da pressão do nebulizador, referente ao processo de ionização do equipamento microQTOF-QII da Bruker.

Conforme mencionado, a primeira consideração a respeito do grau de hidrofobicidade das biomoléculas foram interpretadas por meio da quantidade de ACN no tampão na etapa de eluição da coluna SCX (eixo da abscissa da Figura 16), portanto quanto maior a percentagem de solvente orgânico maior o caráter hidrofóbico do peptídeo.

Verifica-se a possibilidade de interpretação conjunta dos dois fatores significativos (% ACN no tampão na 1D com a pressão do gás nebulizador na autoMS/MS), uma vez que por meio

86 da seletividade em termos da hidrofobicidade da coluna SCX podemos correlacionar estes resultados com a melhor condição da eletronebulização no espectrômetro de massas (observe as condições das duas regiões de máximo da superfície de resposta da Figura 16). Aspecto este que seria extremamente difícil de verificar por meio da otimização univariada, e ainda, uma correlação até agora inédita na literatura.

Os valores menores a 1,2 bar da pressão do gás nebulizador, provavelmente estão relacionados à incompleta evaporação da gota no processo de eletronebulização, fato que não permite sua dispersão por meio da força coulômbica (repulsão intermolecular eletrostática) em gotículas menores, com cargas de mesmo sinal. Desta forma, alguns peptídeos não são direcionados no campo elétrico entre o capilar da LC-2D e o contra eletrodo localizado na interface do Q-ToF. Por outro lado, valores superiores a 1,6 bar da pressão do gás nebulizador são capazes de vencer o campo elétrico, de forma que os peptídeos são direcionados para fora da interface Q-ToF. A Figura 18 esquematiza o processo descrito. [29]

Figura 18 - Câmara da eletronebulização e ionização do Q-ToF. A) conexão com cromatógrafo e entrada da

amostra. B) entrada do gás nebulizador (N2). C) Agulha para pulverização com gás nebulizador com fluxo coaxial de N2. 1C) ionização efetiva com gás nebulizador (1,2 ou 1,6 bar). 2C) perda de peptídeos e eliminação de espécies neutras D) escudo de pulverização (−3.6 kV). E) capa do capilar (−4 kV). F) descarte G) câmara de pulverização. H) N2 de secagem (fluxo e temperatura controlada). I) capilar de vidro. J) estágio de vácuo I.

Fonte: Adaptação de Batiston (2019) a partir de BRUKER Daltonics micrOTOF II User Manual, Version 1.2

(Dezembro 2008), Alemanha.

Alguns estudos descreveram a importância da pressão do gás nebulizador para melhorar a sensibilidade, assim como o limite de detecção em análises químicas para moléculas pequenas. [46-48] Apesar do aumento da sensibilidade estar relacionado com os nossos resultados,

87 verificamos que não há estudos sobre o relato da importância da pressão do gás nebulizador (N2)

para o aumento de coberturas na sequência peptídica das biomoléculas. E ainda, não foi verificado nenhum estudo que relacione a eletronebulização eficiente com a hidrofobicidade dos peptídeos. Desta forma, as conclusões demonstradas em nossos trabalhos possuem uma colaboração adicional ao trabalho do grupo de Matthias Mann, onde o grupo constatou que de 100.000 peptídeos eluídos na cromatografia líquida unidimensional, a grande maioria dos peptídeos não foram identificados no MS, especificamente na etapa de fragmentação do MS/MS. [17]

A primeira discussão a respeito do comportamento da hidrofobicidade dos peptídeos na etapa de eluição na coluna SCX teve início há 25 anos, e a elucidação deste fenômeno ainda continua em aberto. [49-51] Isso porque o comportamento químico e o equilíbrio das espécies na solução são extremamente diversificadas. Em suma, a adição de solvente orgânico no tampão de eluição da coluna SCX, não é somente para diminuir a interação hidrofóbica e desta forma maximizar a interação eletrostática das moléculas com a fase estacionária da trocadora catiônica. Mas, além da carga líquida total dos peptídeos, outros fatores podem afetar o tempo de retenção dos peptídeos sobre a fase estacionária da coluna SCX. Portanto tratam-se de propriedades relativas à hidrofobicidade, seja na contribuição referente aos peptídeos com diferentes tamanhos de cadeia molecular, a conformação estrutural, a distribuição da carga, a densidade da carga, as regiões hidrofóbicas na molécula, e as interações inter- e intramoleculares. O conjunto destes comportamentos possui denominação na literatura de interações hidrofóbicas não-específicas. [49-51]

Conforme evidenciado em Batiston (2015),[36]investigamos o conjunto de peptídeos dos experimentos que fazem referência para as duas regiões de máximo do modelo químico- matemático referente aos peptídeos de BSA e verificamos que alguns peptídeos são detectados somente com a condição de 8% de ACN no tampão de eluição da primeira dimensão, assim como 1,2 bar da pressão do gás nebulizador e outros peptídeos são somente detectados na condição de 18% de ACN no tampão de eluição da 1D com 1,6 bar da pressão do gás nebulizador em autoMS/MS.

Constatamos que quando a primeira dimensão cromatográfica possui baixa percentagem de solvente orgânico no tampão de eluição, os peptídeos com elevado grau de hidrofobicidade

88 ficam retidos de forma irreversível na fase estacionária na etapa de análise, de modo que são removidos após a etapa de limpeza da coluna SCX, esta etapa é necessária para evitar o efeito de memória. Por outro lado, quando a primeira dimensão cromatográfica possui elevada percentagem de ACN no tampão de eluição, os peptídeos com baixo grau de hidrofobicidade são perdidos na etapa de limpeza e dessalinização na coluna de armadilha.