Le foie est un organe majeur dans la métabolisation du fipronil (Tang et al., 2004;
Das et al., 2006) et des hormones thyroïdiennes (Klachko and Johnson, 1983; Kelly, 2000), c'est pourquoi nous avons étudié les effets du fipronil sur le transcriptome hépatique. Les puces à ADN ont montré qu'après une exposition au fipronil, 402 sondes correspondant à 377 gènes étaient surexprimées et 310 sondes correspondant à 292 gènes étaient sous exprimées (q-value<0.1). L'impact du fipronil sur le transcriptome hépatique du rat est illustré dans la figure 41.
CHAPITRE 5: MECANISMES MOLECULAIRES DE LA PERTURBATION
Figure 41: Profil d'expression génique hépatique lors d'un traitement au fipronil chez le rat.
L'étude du transcriptome hépatique de rat a été réalisée sur les foies de 7 rates traitées au solvant et de 8 rates traitées au fipronil (3 mg/kg/j) pendant 14 jours. Les fonctions représentées à droite de la heatmap correspondent aux trois fonctions majoritairement surreprésentées parmi les gènes dont l'expression a été augmentée ou diminuée lors d'un traitement au fipronil.
Les gènes sous exprimés étaient majoritairement liés au métabolisme des lipides.
L'effet du fipronil sur ces gènes n'a été confirmé que partiellement par qPCR (figure 42).
En effet, sur les quatre gènes présentés ici, seul le gène Cd36 impliqué dans le transport des acides gras était significativement sous-exprimé lors d'un traitement au fipronil (p<0.01).
Figure 42: Effet du fipronil sur l'expression des ARNm de gènes impliqués dans le métabolisme des lipides chez le rat.
L'expression moyenne (± ES) des ARNm des gènes Cyp4a1, Cd36, Hmgcs2 et Thrsp a été déterminée à partir des échantillons de foie de rat prélevés 24h après la dernière administration de solvant
CHAPITRE 5: MECANISMES MOLECULAIRES DE LA PERTURBATION Ces résultats nous ont conduit à centrer notre étude sur les gènes surexprimés lors d'un traitement au fipronil. Les gènes surexprimés étaient majoritairement liés au métabolisme et au transport des xénobiotiques, des hormones et des composés endogènes comme les acides biliaires et les stéroïdes. Pour évaluer l'hypothèse d'une régulation potentielle de ces gènes par le fipronil via les récepteurs nucléaires CAR et PXR, nous avons comparé nos profils d'expression génique à ceux obtenus par Ren et al. (2009) chez des rates exposées à un activateur de CAR et de PXR, le phénobarbital, ou à un activateur uniquement de PXR, la pregnenolone-16alpha-carbonitrile (PCN). Malgré les différences entre les sondes testées avec les puces à ADN Affymetrix et Agilent, nous avons pu montrer qu'environ la moitié des gènes régulés par le fipronil dans le foie de rat étaient aussi régulés par le phénobarbital ou le PCN (figure 43), suggérant bien une activation des récepteurs nucléaires CAR et PXR par le fipronil.
Figure 43: Comparaison des profils d'expression génique hépatiques obtenus lors du traitement de rates avec du fipronil, du phénobarbital ou de la pregnenolone-16alpha-carbonitrile.
PB: phénobarbital, activateur de CAR et de PXR; PCN: pregnenolone-16alpha-carbonitrile, activateur de PXR.
Enfin, les surexpressions de gènes lors d'un traitement au fipronil observées à l'aide des puces à ADN ont été confirmées par qPCR. Nous avons testé plus de 40 gènes. Les gènes les plus significativement modulés par le fipronil sont des cibles des récepteurs nucléaires CAR et PXR (Kiyosawa et al., 2008, figure 44). De plus, il est à noter que ces régulations ont eu lieu malgré une diminution faible mais significative de l'expression des récepteurs nucléaires CAR et PXR lors du traitement au fipronil.
CHAPITRE 5: MECANISMES MOLECULAIRES DE LA PERTURBATION
Figure 44: Effet du fipronil sur l'expression des ARNm des récepteurs nucléaires CAR et PXR et des gènes impliqués dans le métabolisme et le transport des xénobiotiques et de composés endogènes comme les hormones thyroïdiennes chez le rat.
L'expression moyenne (± ES) des ARNm des récepteurs nucléaires (A), des enzymes hépatiques de phase I (B) ou de phase II (C) et des transporteurs de phase III (D) a été déterminée à partir des échantillons de foie de rat prélevés 24h après la dernière administration de solvant (vert, n = 14) ou de fipronil (bleu, n = 10). Significativement différent du groupe solvant: *p<0.05, **p<0.01.
3. Conclusions
Chez le rat, le fipronil modulait l'expression hépatique de gènes cibles de CAR et/ou de PXR. Afin de démontrer le rôle des récepteurs nucléaires dans ces modulations induites par le fipronil, nous avons alors choisi de comparer les effets d'un traitement au fipronil chez des souris sauvages, CAR-/- ou PXR-/-. Mais avant de démarrer les expérimentations sur ces souris KO, il était tout d'abord nécessaire de vérifier que le fipronil avait le même effet sur le transcriptome hépatique du rat et de la souris.
CHAPITRE 5: MECANISMES MOLECULAIRES DE LA PERTURBATION
C. Impact du fipronil sur le transcriptome hépatique chez la souris 1. Matériels et méthodes
Seize souris mâles de neuf semaines ont été utilisées pour cette expérimentation.
Les animaux ont été répartis en deux groupes (n = 8 souris/groupe) traités quotidiennement avec du solvant ou du fipronil (5 mg/kg/j) par gavage oro-gastrique pendant 14 jours. Juste après la dernière administration de solvant ou de fipronil, les foies ont été collectés afin de comparer l'effet du fipronil sur l'expression des ARNm hépatiques chez la souris et le rat.
2. Résultats
a. Effet du traitement sur le poids des animaux et le poids des foies
Les poids moyens (± ET) des souris traitées au solvant et au fipronil étaient significativement différents à la fin de l'expérimentation (respectivement 24.7 ± 1.5g et 23.2 ± 0.8g, p<0.05) alors qu'ils étaient similaires au début de l'expérimentation (respectivement 23.5 ± 0.9g et 23.1 ± 0.8g). Les poids moyens des foies (± ET) exprimés en pourcentage des poids corporels étaient respectivement de 4.6 ± 0.3% et de 5.1 ± 0.2% à la fin de l'expérimentation pour les groupes traités au solvant ou au fipronil, indiquant une augmentation significative du poids des foies dans le groupe traité au fipronil (p<0.01) résultant probablement de la diminution significative du poids des animaux à la fin de l'expérimentation dans le groupe traité au fipronil.