Les concentrations extracellulaires en T4 augmentaient entre 0.25 et 0.5h jusqu'à atteindre 70 à 90% de la dose. Cela suggérait qu'un délai était nécessaire pour équilibrer les concentrations entre le milieu extracellulaire et le milieu intracellulaire. Les concentrations extracellulaires en T4 diminuaient ensuite pendant tout le reste de la cinétique sans atteindre des valeurs inférieures à la LOQ du dosage (figure 33, exemple représentatif pour des cellules traitées au solvant, au solvant et au piperonyl butoxide, au fipronil à 2.5 µM, au fipronil à 2.5 µM et au piperonyl butoxide, ou au fipronil sulfone à 2.5 µM).
CHAPITRE 4: TOXICOLOGIE COMPARATIVE IN VITRO
Figure 33: Evolution des concentrations extracellulaires moyennes en T4 (± ET) après incubation d'hépatocytes de rat avec du solvant ± piperonyl butoxide, du fipronil à 2.5 µM ± piperonyl butoxide, ou du fipronil sulfone à 2.5 µM.
Les hépatocytes ont été incubés avec les différents traitements à J1 pendant 24h. Ensuite, les concentrations extracellulaires en T4 ont été mesurées dans le milieu extracellulaire collecté 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 et 24h après incubation avec du solvant (vert), du solvant et du piperonyl butoxide 50 µM (violet), du fipronil à 2.5 µM (bleu), du fipronil à 2.5 µM et du piperonyl butoxide à 50 µM (marron) ou du fipronil sulfone à 2.5 µM (orange) à J2. Les concentrations moyennes ont été obtenues à partir des valeurs de trois puits distincts.
La clairance de la T4 a été estimée pour chaque traitement à partir de ces données (figure 34). La clairance de la T4 était diminuée lors du traitement des hépatocytes au solvant + piperonyl butoxide, suggérant un effet inhibiteur propre du piperonyl butoxide sur la clairance de la thyroxine. Pour comparer les effets d'un traitement au fipronil seul, d'un traitement au fipronil sulfone et d'un traitement au fipronil + piperonyl butoxide, nous avons donc choisi d'exprimer la clairance de la T4 en pourcentage du solvant correspondant soit la clairance pour les traitements fipronil et fipronil sulfone en fonction de celle du solvant, et la clairance pour le traitement fipronil + piperonyl butoxide en fonction de celle du solvant + piperonyl butoxide. Aucune relation dose-réponse claire n'a pu être observée concernant les effets des différents traitements sur la clairance de la T4. L'évolution des clairances relatives en fonction de la dose administrée aux hépatocytes semblait similaire que les cellules soient traitées au fipronil, au fipronil et au piperonyl butoxide, ou au fipronil sulfone seul. En effet, quel que soit le traitement, ces clairances relatives montraient des profils fluctuants entre 0.1 et 1 µM pour atteindre une valeur maximale à 1 µM de l'ordre de 150 à 200% de la valeur de la clairance pour le groupe contrôle correspondant (solvant ou solvant + piperonyl butoxide). De façon surprenante à 5
CHAPITRE 4: TOXICOLOGIE COMPARATIVE IN VITRO µM, soit un tiers de l'IC50 du fipronil sulfone sur hépatocytes humains, les clairances diminuaient. A 1 µM, l'effet le plus important sur la clairance relative de la T4 a été observé avec le traitement au fipronil et piperonyl butoxide, suggérant que le fipronil est plus efficace que le fipronil sulfone pour induire le catabolisme des hormones thyroïdiennes chez le rat. Toutefois, ce résultat reste à confirmer dans de meilleures conditions de culture. En outre, l'aspect de la relation dose-réponse ne permettait en aucun cas d'établir la puissance relative des deux molécules sur la clairance de la T4. Les conditions expérimentales doivent donc être optimisées si l'on veut discriminer les effets propres du fipronil et de son métabolite et déterminer la puissance relative des deux molécules.
Figure 34: Clairance de la T4 après le traitement d'hépatocytes de rat avec du solvant ± piperonyl butoxide, du fipronil ± piperonyl butoxide, ou du fipronil sulfone.
La clairance de la T4 a été estimée à l'aide d'un modèle bicompartimental correspondant à l'administration d'un bolus iv de T4 pour un traitement des hépatocytes de rat avec du solvant (vert), du solvant et du piperonyl butoxide 50 µM (violet), du fipronil (0.01 à 5 µM, bleu), du fipronil (0.01 à 5 µM) et du piperonyl butoxide 50 µM (marron) ou du fipronil sulfone (0.01 à 5 µM, orange). Le graphique à gauche représente la clairance de la T4 en fonction du traitement. Les lignes en pointillés rappellent les clairances pour le groupe solvant (vert) et le groupe solvant et piperonyl butoxide (violet). Le graphique à droite représente la clairance de la T4 pour les différentes doses de fipronil ou de fipronil sulfone exprimée en pourcentage de celle du groupe solvant pour les hépatocytes traités au fipronil ou au fipronil sulfone, et en pourcentage de celle du groupe solvant et piperonyl butoxide pour les hépatocytes traités au fipronil et au piperonyl butoxide.
3. Conclusions
Un traitement au fipronil et au fipronil sulfone des hépatocytes de rat conduisait, comme in vivo (Roques et al., 2012), à une exposition au fipronil sulfone similaire et majoritaire. De plus, contrairement à ce que l'on a vu in vivo (chapitre 2), le traitement des hépatocytes au piperonyl butoxide conjointement au traitement au fipronil permettait d'inhiber suffisamment la biotransformation du fipronil en fipronil sulfone pour exposer les
CHAPITRE 4: TOXICOLOGIE COMPARATIVE IN VITRO déterminer l'effet propre du fipronil sur la perturbation thyroïdienne. Cependant, afin de mieux caractériser l'exposition des hépatocytes au fipronil et au fipronil sulfone, nous avons souhaité dans l'expérimentation suivante déterminer les concentrations en fipronil et en fipronil sulfone dans le milieu intracellulaire car nous n'avons pas retrouvé 100% de la dose administrée dans le milieu extracellulaire.
De plus, les concentrations extracellulaires dans le milieu de culture augmentaient entre 0.25 et 0.5h pour le fipronil et le fipronil sulfone comme pour la T4 avant de diminuer jusqu'à la fin de la cinétique. Ceci peut être dû à un délai nécessaire pour équilibrer les concentrations entre le milieu extracellulaire et le milieu intracellulaire.
Dans l'expérimentation suivante, le premier point des cinétiques ne sera alors effectué qu'1h après le début des traitements pour s'affranchir de cette phase.
Nous avons été en mesure de déterminer la clairance de la T4 en fonction des différents traitements. Les cultures primaires d'hépatocytes semblaient donc être un modèle acceptable pour l'étude de l'effet perturbateur thyroïdien du fipronil et/ou de son métabolite. Cependant, aucun effet dose-réponse n'a été clairement observé. Ceci peut être dû à une mauvaise estimation de la clairance de la T4 compte-tenu du faible nombre de points sur la phase terminale de la cinétique. Les temps de prélèvements du milieu de culture seront alors modifiés dans la prochaine expérimentation. Cette étude suggérait tout de même que le fipronil pouvait avoir un effet perturbateur thyroïdien propre et similaire voire supérieur à celui du fipronil sulfone. De plus, le piperonyl butoxide avait un effet inhibiteur sur la clairance de la T4. Ceci invalide l'approche utilisant du piperonyl butoxide et nous n'utiliserons donc pas cette inhibiteur de la biotransformation du fipronil en fipronil sulfone dans l'expérimentation suivante, mais cela soulève des perspectives intéressantes en ce qui concerne l'exploration du métabolisme des hormones thyroïdiennes.
Enfin, la mesure de l'expression des cytochromes P450 par In Cell Western effectuée dans cette expérimentation n'a pas été présentée ici du fait de la mauvaise qualité des données probablement due à de mauvaises conditions de transport des plaques entre l'INRA de Sophia-Antipolis et l'ENVT.
CHAPITRE 4: TOXICOLOGIE COMPARATIVE IN VITRO
D. Différences interspécifiques dans la perturbation thyroïdienne induite par un traitement au fipronil ou au fipronil sulfone
Les objectifs de cette partie étaient de déterminer:
1) si les différentes doses en fipronil et en fipronil sulfone utilisées, conduisant à des concentrations similaires à celles observées in vivo chez le rat, le mouton ou l'Homme, ne présentaient pas d'effet cytotoxique,
2) si on pouvait reproduire in vitro les différences interspécifiques en termes de métabolisation du fipronil en fipronil sulfone observées chez le rat et le mouton in vivo, et déterminer la capacité de biotransformation du fipronil chez l'Homme,
3) si on observait une courbe dose (fipronil, fipronil sulfone) - réponse (clairance de la T4) chez les trois espèces et quelles étaient les différences interspécifiques en termes de potentiel perturbateur thyroïdien d'un traitement au fipronil.