Les poids moyens (± ET) des souris CAR-/- et PXR-/- étaient significativement différents de celui des souris sauvages au début de l'expérimentation (30.7 ± 2.1g, 32.4 ± 4.2g et 29.4 ± 3.4g respectivement pour les souris sauvages, CAR-/- et PXR-/-, p<0.01) alors que seulement celui des souris PXR-/- était significativement différent de celui des souris sauvages à la fin de l'expérimentation (29.9 ± 1.9g, 30.7 ± 3.6g et 28.4 ± 2.8g respectivement pour les souris sauvages, CAR-/- et PXR-/-, p<0.01). Ces différences de poids étaient cependant de faible amplitude. Le traitement n'a pas eu d'effet sur le poids des animaux quel que soit le génotype.
Les poids moyens des foies (± ET) exprimés en pourcentage du poids corporel étaient respectivement de 3.9 ± 0.5%, 4.1 ± 0.6% et 4.2 ± 0.6% pour les souris sauvages, CAR-/- et PXR-/- traitées au solvant et respectivement de 4.2 ± 0.5%, 3.8 ± 0.6% et 4.1 ± 0.4% pour les souris sauvages, CAR-/- et PXR-/- traitées au fipronil, indiquant que ni le génotype, ni le traitement, ni leur interaction n'ont eu d'effet sur le poids des foies.
b. Concentrations plasmatiques en fipronil et en fipronil sulfone
Figure 48: Concentrations plasmatiques moyennes (± ET) en fipronil et en fipronil sulfone chez des souris sauvages, CAR-/- et PXR-/- ayant reçu 3 mg/kg/j de fipronil par voie orale pendant 14 jours.
Les concentrations plasmatiques en fipronil (bleu, gauche) et en fipronil sulfone (orange, droite) ont été déterminées chez des souris sauvages (n = 11), déficientes pour le récepteur nucléaire CAR (n = 10) ou déficientes pour le récepteur nucléaire PXR (n = 8) traitées au fipronil (3 mg/kg/j pendant 14 jours). Les échantillons de plasma correspondaient à certains échantillons prélevés pour la cinétique de 13C6-LT4. Significativement différent du groupe souris sauvages: *p<0.05.
Les concentrations plasmatiques en fipronil étaient proches de la LOQ du dosage de 2.5 ng/mL pour les trois génotypes (figure 48). Les concentrations plasmatiques en fipronil
CHAPITRE 5: MECANISMES MOLECULAIRES DE LA PERTURBATION sauvages (p<0.05), ce qui semble cohérent compte tenu du rôle des récepteurs nucléaires CAR et PXR dans la régulation des cytochromes P450 responsables de la métabolisation du fipronil en fipronil sulfone (Konno et al., 2008). Cependant, quel que soit le génotype les souris étaient majoritairement exposées au fipronil sulfone. En effet, le rapport fipronil sulfone/fipronil moyen (± ET) était respectivement de 1007 ± 152; 619 ± 367 et 789 ± 303 pour les souris sauvages, CAR-/- et PXR-/-.
c. Potentiel perturbateur thyroïdien du fipronil
Figure 49: Effet du fipronil sur l'évolution des concentrations plasmatiques et la clairance de la
13C6-LT4 chez des souris sauvages, CAR-/- et PXR-/- ayant reçu 3 mg/kg/j de fipronil par voie orale pendant 14 jours.
L'évolution des concentrations plasmatiques moyennes (± ET) en 13C6-LT4 ainsi que la clairance apparente (± SE, correspondant à l'erreur faite sur l'estimation de la clairance par le modèle pharmacocinétique) ont été déterminées à partir des concentrations plasmatiques en 13C6-LT4 mesurées dans des échantillons de plasma collectés 0.25, 2, 4, 8, 12 et 24h après administration d'un bolus ip de 13C6-LT4 (10.2 µg/kg) à des souris sauvages, déficientes pour le récepteur nucléaire CAR ou déficientes pour le récepteur nucléaire PXR traitées pendant 14 jours au solvant (vert, n = 5 ou 10 souris/génotype/traitement) ou au fipronil (bleu, n = 5 ou 10 souris/génotype/traitement).
Les concentrations plasmatiques moyennes en 13C6-LT4 étaient plus élevées dans le groupe solvant que dans le groupe traité au fipronil pour tous les temps de la cinétique chez les souris sauvages mais pas chez les souris KO (figure 49). La clairance de la 13C6-LT4
tendait à être plus haute chez les souris sauvages traitées au fipronil que chez celles traitées au solvant. On observait le même effet chez les souris CAR-/- même si la clairance de la 13C6-LT4 semblait plus faible constitutivement chez ces souris que chez les souris
CHAPITRE 5: MECANISMES MOLECULAIRES DE LA PERTURBATION sauvages. La clairance de la 13C6-LT4 semblait similaire chez les souris PXR-/- traitées au solvant ou au fipronil. Aucun effet significatif du génotype ou du traitement n'a cependant été mis en évidence.
d. Voies métaboliques hépatiques modulées par le fipronil
Etonnamment, il n'y a pas eu d'effet du traitement chez ces souris sauvages pour les gènes Cyp2b10 et Gstα2 (figure 50) contrairement à ce qui a été montré chez les souris sauvages traitées à 5 mg/kg/j de fipronil dans l'expérimentation précédente. Il est de plus à noter que, chez les souris traitées au solvant, l'absence de CAR entrainait une diminution significative des ARNm des gènes Cyp2b10 et Cyp3a11 et l'absence de PXR une diminution significative des ARNm du gène Slco1a4, suggérant un effet de CAR ou de PXR sur l'expression constitutive de ces gènes. Une augmentation significative de l'expression des gènes Cyp3a11, Ces2a, Abcc3 et Slco1a4 a été observée lors du traitement des souris sauvages au fipronil. Cet effet était absent chez les souris PXR-/- pour tous les gènes, absent chez les souris CAR-/- pour les gènes Ces2a et Abcc3 et réduit chez les souris CAR -/-pour les gènes Cyp3a11 et Slco1a4, suggérant une implication des récepteurs nucléaires CAR et PXR dans les modulations du profil d'expression génique engendrées par un traitement au fipronil.
CHAPITRE 5: MECANISMES MOLECULAIRES DE LA PERTURBATION
Figure 50: Effet du fipronil sur l'expression des gènes Cyp2b10, Cyp3a11, Ces2a, Gstα2, Abcc3 et Slco1a4 chez des souris sauvages, CAR-/- et PXR-/- ayant reçu 3 mg/kg/j de fipronil par voie orale pendant 14 jours.
L'expression moyenne (± ES) des ARNm de ces gènes a été déterminée à partir des échantillons de foie prélevés 24h après la dernière administration de solvant (vert, n = 5 souris/génotype) ou de fipronil (bleu, n = 5 souris/génotype). Significativement différent du groupe solvant: a, p<0.05.
Significativement différent du groupe souris sauvages: b, p<0.05.
3. Conclusions
Les récepteurs nucléaires CAR et PXR semblaient être impliqués dans la régulation du métabolisme du fipronil via la modulation de l'expression des cytochromes P450 responsables de la métabolisation du fipronil en fipronil sulfone. De plus, les deux récepteurs nucléaires, et plus particulièrement PXR, semblaient être impliqués dans la modulation par le fipronil de l'expression d'enzymes hépatiques impliquées dans la métabolisation et le transport des hormones thyroïdiennes. Cependant, nous n'avons pas
CHAPITRE 5: MECANISMES MOLECULAIRES DE LA PERTURBATION été en mesure de reproduire les effets du fipronil sur Cyp2b10 et Gstα2 qui étaient induits chez les souris sauvages plus jeunes et traitées au fipronil à 5 mg/kg/j utilisées dans l'expérimentation précédente. De plus, nous n'avons pas été en mesure de déterminer de façon formelle l'implication des récepteurs nucléaires CAR et PXR dans l'augmentation de la clairance de la 13C6-LT4 observée lors d'un traitement au fipronil chez le rat. Nos résultats montraient donc que la souris était moins sensible à la perturbation thyroïdienne engendrée par un traitement au fipronil que le rat. Nous avons alors choisi d'évaluer l'impact d'une dose plus importante de fipronil (10 mg/kg/j) chez des souris sauvages, déficientes pour le récepteur CAR et déficientes pour le récepteur PXR âgées de 9 semaines, un âge identique à celui des souris traitées à 5 mg/kg/j utilisées dans l'expérimentation précédente.
CHAPITRE 5: MECANISMES MOLECULAIRES DE LA PERTURBATION
E. Effet d'une forte dose de fipronil sur la régulation de l'expression de gènes hépatiques chez de jeunes souris sauvages, CAR
-/-et PXR
-/-1. Matériels et méthodes
Des souris mâles wild-type, déficientes pour le récepteur CAR ou déficientes pour le récepteur PXR de neuf semaines ont été utilisées pour cette expérimentation (n = 16 souris/génotype). Les animaux ont été répartis en deux groupes (n = 8 souris de chaque génotype/groupe) traités quotidiennement avec du solvant ou du fipronil (10 mg/kg/j) par gavage oro-gastrique pendant 14 jours. Juste après la dernière administration de solvant ou de fipronil, le sang total a été prélevé par ponction intracardiaque sous anesthésie à l'isoflurane et collecté dans des tubes héparinés afin de déterminer les concentrations plasmatiques en T4 totale et en T3 totale. Les foies ont été collectés afin de déterminer l'expression des ARNm hépatiques modulés par le fipronil.
2. Résultats
a. Effet du traitement et du génotype sur le poids des animaux et le poids des foies
Le poids moyen (± ET) des souris CAR-/- était significativement différent de celui des souris PXR-/- à la fin de l'expérimentation (26.1 ± 1.3g, 26.4 ± 2.2g et 24.7 ± 1.8g respectivement pour les souris sauvages, CAR-/- et PXR-/-, p<0.05) alors que les poids moyens (± ET) étaient similaires pour tous les génotypes au début de l'expérimentation (25.7 ± 1.2g, 26.3 ± 2.1g et 25.0 ± 2.0g respectivement pour les souris sauvages, CAR-/- et PXR-/-). Le traitement n'a pas eu d'effet sur le poids des animaux quel que soit le génotype.
Les poids moyens des foies (± ET) exprimés en pourcentage du poids corporel étaient respectivement de 4.8 ± 0.3%, 4.8 ± 0.4% et 5.1 ± 0.3% pour les souris sauvages, CAR-/- et PXR-/- traitées au solvant et respectivement de 4.8 ± 0.6%, 4.9 ± 0.4% et 4.7 ± 0.6% pour les souris sauvages, CAR-/- et PXR-/- traitées au fipronil, indiquant que ni le génotype, ni le traitement, ni leur interaction n'ont eu d'effet sur le poids des foies.