Modèles animaux

1. Origine et hébergement des animaux

Les rats étaient des rats Wistar femelles adultes, de 200 à 250g, provenant de chez Janvier (Wistar RjHan:WI, Le Genest Saint Isle, France), Harlan (Wistar HsdHan:WIST Outbred, Gannat, France) ou Charles River (Wistar Crl:WI, L'Abresle, France). Les rates étaient hébergées par 2 à 4 en cage, excepté lors de la pose d'un cathéter où elles étaient hébergées en cages individuelles. Elles étaient placées dans des armoires à rongeurs afin d'être soumises à un cycle lumineux inversé (lumières éteintes de 9:00 à 21:00, manipulation des animaux pendant leur phase d'activité) dans l'animalerie de l'Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse (ENVT, France) ou, pour l'étude du transcriptome hépatique de rat (chapitre 5), sur des portoirs et soumises à un cycle lumineux non inversé (lumières allumées de 7:00 à 19:00) dans l'animalerie de l'Institut National de la Recherche Agronomique de St Martin de Touch (INRA, France). Les rates ont été acclimatées aux conditions du laboratoire pendant au moins une semaine avant le début des expérimentations. La nourriture (2016 Teklad Diet, Harlan, Gannat, France; ou A04, SAFE, Augy, France) et l'eau ont été fournies ad libitum. Les rates ont été pesées deux fois par semaine et, pour chaque solution administrée, les volumes ont été ajustés au dernier poids relevé.

Les souris étaient des souris mâles C57BL/6J adultes. Les souris sauvages (wild-type) provenait de chez Janvier (C57BL/6J Rj, Le Genest St Isle, France). Les souris transgéniques déficientes pour le récepteur nucléaire CAR (CAR^-/-) ou pour le récepteur nucléaire PXR (PXR^-/-) avec un fond génétique C57BL/6J ont été obtenues respectivement grâce à un don du Professeur David D. Moore (Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA) et du Professeur Steven A. Kliewer (Department of Pharmacology, University of Texas Southwestern Medical Centre, Dallas, TX, USA). Les animaux à l'origine des colonies ont été fournis par le Professeur Urs A.

Meyer (Division of Pharmacology/Neurobiology, Biozentrum of the University of Basel, Bâle, Suisse). Les souris étaient hébergées par 4 à 10 en cage. Elles étaient placées sur des portoirs et soumises à un cycle lumineux non inversé (lumières allumées de 7:00 à 19:00) dans l'animalerie de l'Institut National de la Recherche Agronomique de St Martin de Touch (INRA, France). Les souris ont été acclimatées aux conditions du laboratoire pendant au moins deux semaines avant le début des expérimentations. La nourriture (A04, SAFE, Augy, France) et l'eau ont été fournies ad libitum. Les souris ont été pesées une fois par semaine et, pour chaque solution administrée, les volumes ont été ajustés au dernier poids relevé.

CHAPITRE 1: MODELES D'ETUDE ET METHODES D'ANALYSE

2. Modèle de rat pseudo-euthyroïdien

Un modèle de rat pseudo-euthyroïdien a été développé et validé dans le laboratoire par Leghait et al. (2009). Brièvement, la production de T4 endogène a été supprimée dans ce modèle par une ablation chirurgicale de la thyroïde afin d'être en mesure de contrôler parfaitement le taux d'entrée de la T4 dans l'organisme. Contrairement aux méthodes utilisant de la thyroxine marquée (Soldin et al., 2010), ce modèle est le seul qui permet de déterminer conjointement in vivo les clairances de la T4 totale et de la T4 libre. Or, de précédentes études ont montré que la clairance de la T4 libre pourrait être un biomarqueur plus précoce et plus sensible d'une perturbation résultant d'un modification du métabolisme des hormones thyroïdiennes (Leghait et al., 2009; Leghait et al., 2010). A la suite de la thyroïdectomie, les animaux ont été supplémentés en T3, la forme bioactive des hormones thyroïdiennes, pour conserver un état pseudo-euthyroïdien compatible avec le maintien d'une activité des enzymes hépatiques normale, ces enzymes étant dépendantes de l'apport en hormones thyroïdiennes au niveau du foie (Liddle et al., 1998;

Masmoudi et al., 1997).

Les rates ayant reçu du fipronil avec trois doses successives de piperonyl butoxide (chapitre 2) ou ayant reçu un bolus intrapéritonéal (ip) de T4 ou d'antipyrine (chapitre 3) ont été thyroïdectomisées (THX) une semaine avant le début du traitement au fipronil sous anesthésie générale (kétamine/médétomidine ip: Chlorkétam 1000®, Vétoquinol, Lure, France: 37.5 mg/kg de kétamine / Domitor®, Pfizer, France: 0.5 mg/kg de médétomidine;

ou anesthésie gazeuse: AErrane®, Baxter SA, Maurepas, France, 2 à 2.5% d'isoflurane dans de l'O2). Elles ont été traitées en préopératoire avec un anti-infectieux à base de sulfadoxine/trimethoprime en sous-cutanée (sc) (Borgal®, Intervet SA, Angers, France:

6.25 mg/kg de sulfadoxine et 1.25 mg/kg de trimethoprime) et un anti-inflammatoire à base de flunixine méglumine sc (Finadyne®, Schering-Plough, Courbevoie, France: 5 mg/kg; ou Meflosyl®, Fort Dodge Santé Animale, Tours, France: 5 mg/kg). Juste après la chirurgie, les rates ont également reçu 0.5 mL sc de Téracalcium® (Vétoquinol, Lure, France) ou 5 mL sc de Lactate de Ringer (B Braun Medical, Boulogne, France) afin de prévenir une hypocalcémie due à une excision ou à une dévascularisation des parathyroïdes lors de la chirurgie. Le traitement antibiotique et l'administration de Téracalcium ou de Lactate de Ringer ont été renouvelés le lendemain de la thyroïdectomie. Dès le lendemain des thyroïdectomies et jusqu'à la fin des expérimentations, les rates ont été supplémentées quotidiennement par de la T3 (10 µg/kg/j, sc) à une dose calculée pour restaurer à l'état d'équilibre des concentrations plasmatiques en T3 proche des concentrations physiologiques (Leghait et al., 2009) et ainsi assurer le maintien d'un état pseudo-euthyroïdien.

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3. Prélèvements sanguins sériés

Des prélèvements sanguins sériés ont été réalisés chez les rates ayant reçu des administrations répétées de fipronil ou une administration unique de fipronil ou de fipronil sulfone (chapitre 2) et chez les rates ayant reçu un bolus ip de T4 ou d'antipyrine (chapitre 3). Un cathéter a été placé dans une des veines fémorales deux jours au moins avant le début d'une cinétique sous une anesthésie kétamine/médétomidine ou gazeuse. Tous les prélèvements de sang ont été collectés dans des tubes héparinés (10 µL d'héparine diluée au 1/10^e dans des tubes Eppendorf®, Heparine Choay®, 50 UI/mL, Sanofi-aventis, France).

Après chaque prélèvement de sang (150 µL à 200 µL afin de ne pas dépasser 10% du volume sanguin total prélevé à la fin de la cinétique), un volume de sérum physiologique stérile (B Braun Medical, Boulogne, France) équivalent au volume de sang collecté a été administré, suivi de 150 µL de sérum physiologique hépariné correspondant au volume mort du cathéter (héparine au 1/100^e).

4. Prélèvements terminaux

Le sang total a été collecté chez les rats après une anesthésie au CO2 ou à l'isoflurane par ponction de l'aorte abdominale, de la veine cave postérieure ou via le cathéter. Il a été collecté chez les souris après une anesthésie à l'isoflurane par ponction intracardiaque. Tous les prélèvements de sang ont été collectés dans des tubes héparinés, centrifugés à 4000 x g pendant 15 minutes à +4°C et le plasma a été stocké à -20°C jusqu'aux dosages.

Lors de l'étude de la toxicologie comparative du fipronil et du fipronil sulfone in vivo (chapitre 3), les foies ont été perfusés via le cathéter ou via la veine cave postérieure avec du sérum physiologique stérile (15 mL/min, 20 mL par foie), puis ils ont été rapidement congelés dans de l'azote liquide et stockés à -80°C jusqu'à la préparation de fractions subcellulaires. Lors de l'étude des mécanismes moléculaires de la perturbation thyroïdienne engendrée par un traitement au fipronil (chapitre 5), un bout du grand lobe de chaque foie a été partagé en cinq morceaux qui ont été rapidement congelés dans de l'azote liquide et stockés à -80°C jusqu'à l'extraction des ARNm.

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