a Voie canonique NF-kB
NF-kB est une protéine qui fait partie de la superfamille des facteurs de transcription. Elle est impliquée dans la réponse immunitaire, la réponse au stress, et c’est également un facteur anti-apoptotique.
NF-kB est une protéine cytoplasmique composée de deux sous-unités : p50 et p65 (RelA). Elle est maintenue inactive par la liaison à la protéine IkB.
Figure 28 : Voie de signalisation canonique NFkB. NF-kB est une protéine cytoplasmique
composée de deux sous-unités : p50 et p65 (aussi appelée RelA). Elle est maintenue inactive par la liaison à la protéine IkB. La kinase IKK va phosphoryler la protéine IkB en réponse à certains signaux extracellulaires. NFkB est libéré et transloque dans le noyaupour réguler ses gènes cibles (Gilmore 2006).
La kinase IKK phosphoryle IkB en réponse à des signaux extracellulaires ce qui permet la libération de NF-kB. Une fois libre NF-kB transloque dans le noyau ce qui permet la régulation de gènes cibles (Gilmore 2006) (figure 28). Cette voie peut être activée par de nombreux signaux et l’AMH en fait partie.
b Activation de la voie NF-kB par l’AMH
Le récepteur de l’AMH, AMHR-II, est exprimé dans la glande mammaire ainsi que dans les deux lignées cancéreuses ER-positive T47D et ER-negative MDA-MB-231 (Segev, Ha et al. 2000). L’AMH inhibe la croissance de ces deux lignées via l’activation de la voie NF-kB et la surexpression du gène cible de cette voie Iex1. Il a également été montré par la même équipe qu’une administration d’AMH chez la souris induisait l’activation de la voie NF-kB et l’expression du gène Iex1 dans la glande mammaire (Segev, Hoshiya et al. 2001). De plus, l’exposition à de l’AMH in vivo augmente l’apoptose des cellules épithéliales mammaires. L’ensemble des résultats de ces deux études montre l’importance de l’AMH dans la régulation de la voie NF-kB et dans la croissance des cellules du sein.
La même équipe s’est intéressée au rôle de l’AMH sur la voie NF-kB dans la prostate. Le récepteur de l’AMH est exprimé dans la prostate normale et dans des lignées cellulaires humaines de cancer de la prostate. De plus, l’administration d’AMH chez la souris mâle induit l’augmentation de l’expression du gène Iex1 dans la prostate. Ceci suggère que l’AMH pourrait être un régulateur hormonal endogène de la voie NF-kB dans la prostate in vivo et in vitro (Segev, Hoshiya et al. 2002).
Dans la lignée de cellules de Sertoli SMAT-1 transfectée avec un rapporteur de la voie NF-kB, la stimulation avec de l’AMH n’a pas d’effet sur l’expression de ce rapporteur (Belville, Jamin et al. 2005). Il semblerait que l’AMH n’ait pas d’effet sur la voie NF-kB dans les cellules de Sertoli. L’effet de l’AMH sur cette voie dans les cellules de la granulosa est traité dans la partie résultats de ce manuscrit (page 175).
En 2007, une étude a mis en évidence la collaboration entre les voies NF-kB et Smad1 pour activer un gène anti-prolifératif dans les cellules canéreuses du sein, le gène GRO-β (Gupta, Yeo et al. 2007).
XI Objectifs de ce travail
L’AMH a été décrite dans les années 50 et depuis, de nombreuses études se sont attachées à comprendre les rôles de cette hormone dans la fonction reproductrice. Du fait de son action sur la régression des canaux de Müller, l’AMH a éveillé l’intérêt des chercheurs qui ont dans un premier temps étudié les rôles de cette hormone chez le mâle. Dans les années 2000, l’étude poussée des souris KO pour l’Amh a permis de montrer que cette hormone présentait également une fonction importante sur la régulation de la folliculogenèse chez la femelle.
L’AMH s’exprime dans les cellules de la granulosa ovarienne et c’est actuellement un marqueur très utilisé pour évaluer la réserve folliculaire ou encore diagnostiquer des cancers. Malgré l’intérêt croissant pour cette hormone chez la femelle, son mécanisme d’action précis n’a pas été décrit.
La (ou les) voie(s) de signalisation de l’AMH reste(nt) encore inconnue(s) dans l’ovaire. Ceci constitue le premier volet de mon travail de recherche. Actuellement, on connait la voie canonique de l’AMH, à savoir qu’elle utilise un récepteur de type II qui lui est spécifique, AMHR-II, et un récepteur de type I qui peut être ActR-IA, BMPR-IA ou BMPR-IB. Une fois les récepteurs activés, les Smad1/5/8 intracellulaires sont phosphorylées pour permettre la transmission du signal. Or le récepteur de type I et la protéine Smad prioritairement recrutés par l’AMH dans les cellules de la granulosa sont actuellement inconnus. Pour déterminer les acteurs de la voie de signalisation de l’AMH dans l’ovaire, nous avons éteint l’expression de ces acteurs et analysé la réponse à l’AMH de cellules de la granulosa en culture primaire. L’utilisation de siRNA dirigés contre chacun des récepteurs de type I a permis de montrer que BMPR-IA semblait être le récepteur de type I recruté par l’AMH dans les cellules de la granulosa. J’ai pu confirmer ce résultat par l’analyse des cellules de la granulosa isolées à partir de souris cKO pour Acvr1 (codant pour ActR-IA) ou Bmpr1a. En effet, les cellules de la granulosa isolées à partir de souris cKO Bmpr1a ne sont plus capables de répondre à une exposition à l’AMH par la phosphorylation des Smads intracellulaires. J’ai également étudié l’importance du co-récepteur aux BMPs, RGMb, dans la voie de signalisation de l’AMH. L’invalidation transitoire de Rgmb par la transfection de siRNA, m’a permis de montrer que ce co-récepteur n’est pas nécessaire à la transduction du signal de l’AMH dans les cellules de
la granulosa. La technique de gènes rapporteurs Smad/gal4-UAS/luciférase m’a permis d’identifier les Smads nécessaires à la transduction du signal de l’AMH dans les cellules de la granulosa murines en culture primaire. Seules les Smad1 et 5 sont recrutées et phosphorylées en réponse à une exposition des cellules de la granulosa à l’AMH.
La recherche de nouveaux gènes cibles dans l’ovaire est une étape essentielle pour la compréhension du rôle physiologique de l’AMH dans l’ovaire. Cet aspect représente le second volet de mon travail de thèse. Nous avons choisi d’utiliser une approche globale basée sur les puces Affymetrix MoGene 2.0 ST. Nous avons comparé les transcriptomes d’ovaires entiers isolés à partir de souris WT ou KO pour l’Amh dans un premier temps. Ces résultats ont ensuite été complétés par ceux obtenus à partir de cellules de la granulosa exposées ou non avec de l’AMH pendant 6h ou 24h. Cette technique a permis d’identifier de potentiels nouveaux gènes cibles de cette hormone dans l’ovaire tels que Kcnj2 ou Ovgp1.
Le récepteur spécifique de l’AMH, AMHR-II, est exprimé par les cellules du myomètre utérin. Dans cet organe, les fonctions de l’AMH n’ont pas encore été explorées. Le dernier volet de mon travail vise à déterminer dans un premier temps l’expression de l’Amh dans l’utérus murin puis d’établir les rôles potentiels de cette hormone. J’ai pu mettre en évidence une expression du gène de l’Amh dans l’utérus et les analyses protéiques sont en cours. J’ai réalisé une expérience de macro-array (PCR-array) pour comparer l’expression de 84 gènes relatifs aux voies de signalisations des BMPs et du TGF-β entre des échantillons d’utéri WT et KO pour l’Amh. Cette expérience a permis d’identifier de nombreux gènes dérégulés dans l’utérus KO Amh laissant supposer que cette hormone joue un rôle dans la régulation de la fonction utérine.
A l’heure actuelle, la recherche sur l’AMH connait un essor en clinique mais ses rôles et son mécanisme d’action sont encore mal connus chez la femme. L’ensemble de ce projet avait pour principal but de mieux comprendre la fonction physiologique de l’AMH dans le tractus génital femelle. L’AMH joue un rôle important dans la régulation de la fonction reproductrice et il est essentiel d’approfondir les connaissances sur cette hormone pour permettre, à terme, d’apréhender les causes de certaines pathologies.
Figure 29 : génération des souris cKO Acvr1 et Bmpr1a. Nous disposons de 5 lignées de souris
génétiquement modifiées au laboratoire. La lignée Amhr2-cre, la lignée Acvr1+/-, la lignée Bmpr1a+/-, la lignée Acvr1fx/fx et la lignée Bmpr1afx/fx. Les lignées Acvr1fx/fx et Bmpr1afx/fx présentent une partie des gènes Acvr1 et Bmpr1a flanquée de séquences loxP qui sont les séquences cibles de la recombinase cre. En présence de cette recombinase, la partie du gène entourée par les séquences loxP va être excisée rendant la transcription impossible ou ne permettant qu’une traduction partielle. Les souris
Amhr2-cre présente le gène codant pour la recombinase cre placé sous le promoteur de l’Amhr2. Ces souris expriment donc la recombinase cre uniquement dans les cellules exprimant Amhr2. Des mâles
Amhr2-cre vont être croisés avec des femelles Acvr1+/- ou Bmpr1a+/- pour obtenir des mâles Amhr2-cre;Acvr1+/- ou Amhr2-cre;Bmpr1a+/- . Ces mâles vont dans un second temps être croisés avec des femelles Acvr1fx/fx ou Bmpr1afx/fx pour obtenir des souris femelles Amhr2-cre;Acvr1fx/- (Acvr1 cKO)ou
Amhr2-cre;Bmpr1afx/- (Bmpr1a cKO). Ces femelles ne présentent qu’une copie du gène cible et cette copie va être clivée par la recombinase cre dans les cellules exprimant Amhr2. Les cellules cibles de mon projet sont les cellules de la granulosa ovarienne qui expriment Amhr2. Chez les souris Acvr1 cKO et Bmpr1a cKO, les cellules de la granulosa ne sont plus capables de produirent les récepteurs ActR-IA (Acvr1) et BMPR-IA.
I Réactifs
L’hormone anti-Müllerienne (AMH) est produite à partir de milieu de culture de cellules CHO (Chinese hamster ovary) transfectées de façon stable avec un cDNA codant pour l’AMH humaine (di Clemente, Jamin et al. 2010). L’AMH est purifiée et clivée par la plasmine. Elle est utilisée sur les cellules de la granulosa à une concentration de 8 nM ou de 40 nM. La protéine BMP2, fournie par le Professeur Walter Sebald (Université de Würzburg, Allemagne) est utilisée à la concentration de 10 nM. La protéine TGF-β (R&D Systems, France) est utilisée à une concentration de 1 nM.
II Modèles
1 Souris
Pour la préparation des cellules primaires de la granulosa, des souris femelles immatures C57BL/6JRj de 3 semaines ont été achetées à l’élevage Janvier (Le Genest-St-Isle, France).
Les lignées de souris Amhr2-cre (Jamin, Arango et al. 2002), Acvr1+/- (Mishina, Crombie et al. 1999), Bmpr1a+/- (Mishina, Suzuki et al. 1995), Acvr1fx/fx (Dudas, Sridurongrit et al. 2004), Bmpr1afx/fx (Mishina, Hanks et al. 2002) sont maintenues sur un fond génétique mixte C57BL/6J; 129/SvEv. Les males Amhr2-cre; Acvr1+/- ou Amhr2-cre; Bmpr1a+/- sont croisés avec des femelles Acvr1fx/fx or Bmpr1afx/fx pour générer des femelles mutantes conditionnelles pour Acvr1 (Acvr1 cKO) ou Bmpr1a (Bmpr1a cKO) respectivement (figure 29). Les femelles Acvr1 cKO et Bmpr1a cKO sont utilisées pour la préparation de cultures primaires de cellules de la granulosa.
La lignée de souris invalidée pour le gène de l’Amh (Amh KO) est également maintenue sur un fond génétique mixte C57BL/6J; 129/SvEv. Cette lignée a été utilisée pour rechercher de nouveaux gènes cibles de l’AMH par macro-array ou par criblage haut débit sur puces à ADN.
Figure 30 : L’appareil reproducteur femelle. Après euthanasie, les souris sont ouvertes et les
ovaires ainsi que les utéri sont récupérés. L’utérus de souris est composé de deux cornes au bout desquelles on trouve les oviductes suivis des ovaires. Les ovaires ont été récupérés chez des souris sauvages ainsi que des souris cKO Acvr1 et cKO Bmpr1a pour réaliser des cultures primaires de cellules de la granulosa. Les ovaires et utéri de souris KO Amh ont été récupérés pour une analyse de transcriptome.