Virus SIR

1.1.1 Interaction hôte-virus

Mes travaux de thèse ont contribué à une meilleure caractérisation du cycle infectieux du virus SIRV2. Ils ont été effectués en collaboration avec l'équipe « Archaea Group » de l'université d'Uppsala en Suède, et avec la plate-forme de microscopie électronique de l'Institut Pasteur. J'ai été encadrée par Olivier Tenaillon (Ecologie et Evolution des Microorganismes, UMR Inserm – Paris 7) et David Prangishvili (BMGE, Institut Pasteur). Les travaux ont démontré que SIRV2 est un virus virulent, contrairement à ce qui avait été suggéré précédemment. En effet, SIRV2 était qualifié de virus chronique dans la littérature (état porteur, Prangishvili et al., 1999). La lyse des cellules survient 10 à 12 heures après l'infection. Les virions sont assemblés avant la phase de lyse, dans le cytoplasme, où ils forment des agrégats denses et structurés ressemblant à des fagots d'allumettes.

Lors de la lyse, les virions quittent la cellule par des ouvertures dans la paroi cellulaire. Ces ouvertures sont induites par l'infection car elles ne sont pas observées dans les cellules non- infectées. En outre, les ouvertures ont un contour net, consistant en un anneau polygonal. La section de l'anneau a une forme de C. L'anneau est parfois observé détaché de la cellule, et semble donc correspondre à une structure spécifique relativement rigide. Les ouvertures doivent être nombreuses puisqu'on en compte jusqu'à quatre par section de cellule. Hormis ces ouvertures, la paroi cellulaire est intacte et stable, même longtemps après la lyse. En revanche, le matériel intracellulaire est dégradé. Les cellules lysées s'apparentent donc à des coquilles vides. La paroi cellulaire seule provoque toujours de la diffusion lumineuse, si bien que la lyse ne peut pas être détectée par une simple mesure de densité optique des cultures.

Les ouvertures sont créées par un mécanisme qui repose sur la formation de structures spéciales au niveau de la membrane. Les structures sont saillantes et pointues, de forme pyramidale. Nous les avons baptisées « VIPs » (« Viral Induced Protrusions »). Elles sont visibles sur les cellules n'ayant pas encore lysé et n'ont pas été observées sur les cellules non-infectées. A priori, chaque VIP, en éclatant, donne lieu à une ouverture. La paroi cellulaire au niveau des VIPs est modifiée. En effet, il n'y a pas de S-layer. De plus, on observe un léger épaississement de la membrane, mais cette dernière observation requiert confirmation car la fixation et la coloration utilisées en microscopie électronique lors de ce projet ne sont pas adaptées aux études structurales détaillées.

Le virus étant lytique, le chromosome de l'hôte est dégradé. Avec la multiplicité d'infection élevée employée dans mon travail, l'apparition de cellules sans chromosome se produit dès 30 minutes après l'infection. La proportion de cellules sans chromosome augmente progressivement au cours du temps, si bien que pour au moins 40% d'entre elles, la dégradation a lieu avant la phase de lyse. Dans des phases assez précoces du cycle infectieux, la majorité des cellules présentent une

quantité accrue d'ADN total, ce qui doit refléter, au moins en partie, la réplication du génome viral. Ceci a été détecté par cytométrie en flux. C'est a priori la première fois que de l'ADN viral intracellulaire peut être détecté, et sa quantité estimée, par cette méthode.

1.1.2 Données sur la particule virale de SIRV2

J'ai également travaillé sur les propriétés physiques et biochimiques des virions de SIRV2. D'une part, j'ai évalué la stabilité des particules virales dans différentes conditions proches des caractéristiques de l'habitat (température de 80°C, pH ! 3,0). La stabilité a été estimée en titrant les particules infectieuses au cours du temps. Dans ces conditions, la demi-vie des virions est de l'ordre de 1 jours. Avec un pH neutre et toutes choses égales par ailleurs (température, solution), la demi-vie est de l'ordre de 3 jours. A température ambiante, dans le tampon habituel de stockage des virions, aucun déclin significatif n'a été observé après plus de 200 jours. Pour fixer les idées, le phage le moins robuste (R17, Leviviridae), dans l'étude de De Paepe and Taddei, 2006, a une demi- vie de 1,33 jours à 37°C ; le plus stable (PRD1, Tectiviridae) a une demi-vie de 18,73 jours ; et des valeurs usuelles sont de 2 à 10 jours. Les résultats obtenus ici indiquent donc que les particules virales sont plutôt bien adaptées à leur environnement très chaud. Elles sont en conséquence ultra- stables en conditions mésophiles.

D'autre part, j'ai évalué la stabilité des particules dans différents mélange d'eau et d'éthanol ou d'eau et de DMSO (Steinmetz et al., 2008). Ces conditions, artificielles, peuvent intervenir lors de l'utilisation de particules virales pour des applications en nanotechnologies (étapes de bioconjugaison, de minéralisation, etc.). La stabilité a été suivie sur une semaine, en combinant titration des particules infectieuses, détermination du spectre d'absorption dans la gamme 200- 300 nm, et observation de l'état des virions par microscopie électronique en transmission. A cette échelle de temps, aucune dégradation des particules n'a été observée. Par contre, dans l'éthanol 50%, les particules perdent progressivement leur caractère infectieux. Peut-être y a-t-il un léger effet fixateur, qui empêche les modifications conformationnelles souvent requises pour l'infection d'un l'hôte (fixation à un récepteur, etc.).

Enfin, nous avons identifié trois protéines structurales de SIRV2 (Vestergaard et al., 2008b), portant le total de protéines structurales connues à quatre. La particule est donc composée d'une protéine majoritaire, qui était déjà connue. Associée à l'ADN (nucléoprotéine), elle constitue le corps hélicoïdal du virion. Une seconde protéine, correspondant au plus long gène du génome de SIRV2, est minoritaire et a été localisée aux extrémités du virion, dans les fibres (Steinmetz et al., 2008). Les deux dernières protéines sont très minoritaires et leur rôle/position dans la structure de la particule n'est pas connu.