Validation de la qualité des échantillons

Afin de confirmer les résultats obtenus par l’approche transcriptomique

effectuée avec des ARN amplifiés, des expériences de RT-PCR en temps

réel sont réalisées sur de nouveaux échantillons biologiques indépendants

et dont les ARN extraits ne sont pas amplifiés. Comme pour les expériences

de puces à ADN, les quatre mêmes groupes de développement sont

analysés : EE (400 µm), IE (400-800 µm), LE (> 800 µm) et L1 (0-24 h).

Pour chacun des groupes, trois répétitions biologiques sont réalisées.

3.6.1.1 Extraction des ARN totaux

Comme pour les expériences de puces à ADN, les ARN totaux sont isolés à

l’aide du kit « RNeasy Mini» (Qiagen), en utilisant le protocole « Animal

tissues » (cf Matériel et Méthodes §3.3.1 p 101). Toutes les étapes de

purification sont communes, à l’exception d’une étape de traitement à la

DNase (RNase-Free DNase Set, Quiagen) qui est réalisée après l’étape de

purification avec le tampon RW1 (350 µl au lieu de 700 µl). Ainsi, 80 µl de

mix DNase (10 µl de DNase et 70 µl de tampon RDD fourni avec la

DNase) sont ajoutés directement sur la membrane de la colonne et une

incubation de 15 min à température ambiante est effectuée. Après une

nouvelle étape de purification avec le tampon RW1 (350 µl), l’extraction se

poursuit ensuite comme précédemment décrit (cf Matériel et Méthodes

§3.3.1 p 101). Cette étape supplémentaire permet ainsi d’éliminer tout

risque de contamination des échantillons par de l’ADN génomique (ADNg)

qui pourrait être amplifié lors de la PCR en temps réel. Ce traitement n’a

pas été réalisé pour les expériences de puces à ADN en raison de la

sélectivité de l’étape d’amplification qui permet de cibler de façon

spécifique les ARN messagers.

3.6.1.2 Préparation des ADNc

Dans le cadre des expériences de RT-PCR quantitative, une réaction de

transcription inverse est tout d'abord réalisée à partir de 1 µg d'ARN totaux

dans un volume final de 21 µl en suivant le protocole du kit

« SuperScript™ First-Strand Synthesis System for RT-PCR » (Invitrogen).

Pour cela, 1 µl d'amorces aléatoires et 1 µl de dNTP sont ajoutés à 1 µg

d'ARN, avant de compléter l'échantillon par de l'eau ultra pure stérile pour

obtenir un volume de 10 µl. L'échantillon est ensuite incubé 5 min à 65°C

(dénaturation des structures secondaires des ARN et début d'hybridation

des amorces) puis refroidi 1 min à 4°C. 9 µl de mélange réactionnel,

composé de 2 µl de tampon concentré 10x, 4 µl de MgCl

25 mM, 2 µl de

DTT 0,1 M et 1 µl d'enzyme RNase Out sont alors ajoutés à l'échantillon.

Le mélange ainsi obtenu est incubé 2 min à 25°C avant l'ajout de 1 µl

d'enzyme SuperScript™ III. Une série d'incubations est alors réalisée : 10

min à 25°C (hybridation des amorces), 50 min à 42°C (synthèse des

ADNc), 15 min à 70°C (fin de réaction de synthèse) et enfin, au moins 2

min à 4°C (conservation des produits de RT). L'ajout de 1 µl de RNase H

associé à une incubation de 20 min à 37°C permet finalement de dégrader

l'ARN présent initialement dans le mélange réactionnel.

3.6.1.3 Validation de la qualité des échantillons

Pour chacun des échantillons, six réactions de RT sont réalisées afin de

disposer de suffisamment de matériel pour l’ensemble des réactions de

qRT-PCR prévues. Un contrôle négatif de rétrotranscription (où l’enzyme

SuperScript

III n’a pas été ajoutée) est également réalisé pour chaque

échantillon. Ce contrôle permet de vérifier l’éventuelle présence de

contamination par de l’ADN génomique.

Pour contrôler la qualité de chaque produit de RT, des PCR

utilisant des amorces spécifiques de deux gènes de normalisation

(ACYPI000064 : actine et ACYPI000074 : rpl32) sont effectuées. La

qualité est ensuite vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose 1,5% dans

un tampon TAE (Tris-acétate 2M, EDTA 0,05 mM, pH = 8,3)

(Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France). Une bonne qualité des produits

obtenus se traduit par l’absence d’amplification dans les puits contenant les

produits de PCR issus des contrôles négatifs (absence d’ADNg

contaminant) et par la forte et spécifique amplification du fragment du gène

de normalisation ciblé.

Après validation de la qualité de chacun des échantillons, les 6

produits de RT sont rassemblés afin de travailler sur un seul et même

échantillon par répétition, et de limiter les biais expérimentaux (Figure 29).

Ces 12 pools d’ADNc sont utilisés pour doser les transcrits de chacun des

groupes de stade à partir des trois répétitions par stades. En prélevant 7 µl

de chacun de ces 12 pools d’ADNc et en les mélangeant, on réalise une

solution stock d’ADNc qui est représentatives de l’ensembles des

conditions expérimentales analysées et qui nous sert de matrice pour la

réalisation des gammes étalons de chacun des gènes à tester (cf. Matériel et

Méthodes §3.6.3.1 p 114).

Après homogénéisation au vortex, tous ces pools d’ADNc sont

partagés en plusieurs aliquotes afin que les échantillons ne subissent pas

plusieurs cycles de congélation/décongélation à chaque réalisation d’un

RT-PCR quantitative. Juste avant l’étape de réalisation de la PCR en temps

réel, le volume nécessaire de produits de RT pour 3 réplicats (cf. § 3.6.3

ci-après), est dilué au 1/5ème avec de l'eau ultra pure autoclavée.

Figure 29. Récapitulatif des produits de transcription inverse et des pools réalisés pour la réalisation des expériences de RT-PCR en temps réel.

A) Les échantillons sont constitués des 4 stades de développement étudiés (EE, IE, LE, L1), à raison de 3 répétitions biologiques par échantillon (ex : EE b, EE d, EE f). Les 3 échantillons ont été préalablement sélectionnés sur la qualité des ARNm, à partir de 6 répétitions biologiques labellisées par une lettre de a et f. Pour chaque échantillon retenu, 6 transcriptions inverses ont été réalisée s et sont labellisées par un chiffre allant de 1 à 6. Après vérification de la qualité des ADNc, les répétitions de chaque échantillon sont rassemblées.

B) Un pool global de tous les échantillons de tous les stades a été réalisé à partir de 7 µl de chaque pool décrit en A). Ce pool a été utilisé pour la réalisation des gammes étalon.