Utilisation d’un SCR pour le contrôle de l’expression de SaCas9 ou de

7.2.2.1. Test d’induction de la SpCas9-2A-GFP

Il a été rapporté que l’utilisation du SCR N79 peut servir au contrôle de l’expression d’un transgène tel que la luciférase [346, 347]. Dans le cadre de nos expériences, nous avons donc cherché à faire la preuve que le contrôle de l’expression des protéines de la SpCas9 ou de la SaCas9 peut permettre d’éditer efficacement un gène d’intérêt tout en permettant de limiter la fréquence des mutations hors-cibles.

Afin de tester la faisabilité de notre stratégie, nous avons d’abord cloné la séquence du SCR N79 dans le plasmide pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458), entre le promoteur CBh et le gène SpCas9-2A-GFP directement après la séquence Kozak GCCRCC qui correspond à la séquence signal pour le début de la traduction de l’ARNm en protéine (Figure 28A). En effet, à l’extrémité 5’ de l’ARNm, des protéines Cap protègent le transcrit et le stabilisent en empêchant sa dégradation. Ainsi, en plaçant la séquence du SCR N79 directement après ce signal de début du signal de traduction, son activité autocatalytique va couper l’ARNm en deux segments, l’un contenant la séquence Kozak, et l’autre qui contient le transcrit du transgène. Le segment contenant le transgène sera donc dépourvu d’une séquence Kozak et son extrémité 5’ ne sera plus protégée ce qui favorisera la dégradation du transcrit et empêchera la traduction de celui-ci. De cette façon, la production de la protéine SpCas9-2A-GFP ne devrait pas être possible. Dans cette construction, le 2A-GFP nous sert de gène rapporteur car son expression est liée à celle de la SpCas9.

Dans un premier temps, nous avons testé la capacité de la toyocamycine à induire l’expression de SpCas9-2A-GFP avec une concentration de 1 µM ayant démontré une induction de luciférase dans les travaux de Yen L. et al. [347]. Dans le contrôle sans toyocamycine, nous avons pu constater l’absence de signal GFP au miscroscope à fluorescence. 48 heures après l’ajout de 1 µM de toyocamycine, l’expression de GFP qui est reliée à celle de la SpCas9 était détectable (Figure 28B). Cependant il est à noter que l’intensité de GFP semblait légèrement plus faible que celle observée dans le contrôle positif avec le plasmide PX458 ne contenant pas de SCR.

Par la suite nous avons également testé l’induction de l’expression de SaCas9. Dans la construction du plasmide pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA- bGHpA;U6::BsaI-sgRNA, il n’y a pas de gène rapporteur comme celui du 2A-GFP, mais le gène de la SaCas9 est fusionné à un tag HA. Ainsi, l’induction de l’expression

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de SaCas9 a été évaluée par Western-Blot avec un anticorps anti-HA. Tel qu’observé avec la SpCas9, l’utilisation de 1 µM de toyocamycine a permis d’induire l’expression de la protéine SaCas9.

Afin de caractériser davantage ce système inductible, nous nous sommes basés sur notre approche de correction du gène Dmd par délétion induite avec CRISPR/Cas9 formant un exon hybride que ce soit avec la SpCas9 ou la SaCas9.

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Figure 28. Test d'inhibition de l'activité du ribozyme N79 pour le contrôle de l'expression de SpCas9-T2A-GFP

(A) Représentation schématique de la construction PX458-Rz, dans laquelle la séquence

correspondant au ribozyme N79 a été introduite entre le promoteur CBh et le transgène codant l’expression de SpCas9-T2A-GFP (1). En absence de toyocamycine, la SCR N79 exerce son activité autocatalytique, ce qui entraine un clivage du transcrit ce qui entraine sa dégradation et l’absence de traduction de la protéine (2). Lorsque la toyocamycine est ajouté, l’activité autocatalytique du ribozyme est inactivée ce qui préserve l’intégrité du transcrit ce qui pourra ainsi permettre la synthèse d’une nucléase (3). (B) En absence d’inhibiteur du ribozyme N79, l’expression de GFP n’est pas détectée. 48 heures après l’ajout de toyocamycine (1 µM) l’expression de GFP est observée.

B

A

(1)

(2)

128

7.2.2.2. L’utilisation de toyocamycine pour l’induction de l’édition génomique dans des cellules 293T.

Après avoir confirmé que l’expression de Cas9 pouvait être induite par l’inhibition de l’activité du SCR N79 par l’ajout de toyocamycine, nous avons cherché à savoir si une telle expression pouvait s’accompagner d’une édition génomique dans les cellules traitées. Ainsi, des cellules 293T ont été co-transfectées avec un plasmide qui code pour l’expression d’une Cas9 (SpCas9 ou SaCas9) et un autre plasmide codant pour l’expression d’une paire de sgRNAs capables de guider ces nucléases pour former un exon hybride. Ici, nous avons utilisés les paires de sgRNAs 3-47/16-58 et sgRNAs 1- 50/5-54 qui ont montré lors de précédentes expériences la formation des exons hybrides 47-58 et 50-54, respectivement avec la SaCas9 et la SpCas9 [288, 345]. La formation de ces exons hybrides ne permet pas seulement de rétablir le cadre de lecture du gène Dmd, mais permet aussi de conserver le bon phasage des répétitions de type spectrine qui forment le domaine central (rod domain) de la protéine dystrophine.

Dans ces expériences, différentes concentrations de toyocamycine (0.25 µM à 2 µM) ont été testées dans le but d’identifier la concentration la plus adaptée à l’induction de l’expression de Cas9 et la formation des exons hybrides (Figure 29).

Dans le cadre de la formation de l’exon 50-54 (Figure 29A), le contrôle positif où la SpCas9 s’exprime directement à partir de son promoteur CBh confirme la formation d’un exon hybride 50-54, tel qu’indiqué par la détection de cet amplicon. De façon intéressante, avec le plasmide PX458-Rz et en absence de toyocamycine, l’expression de la protéine SpCas9 ainsi que l’exon hybride 50-54 ne sont pas détectés. 48 heures après l’ajout de 0.25 µM ou 0.5 µM de toyocamycine, l’expression de SpCas9 était détectée par Western-Blot mais ces conditions n’ont pas permis d’induire la délétion menant à la formation d’un exon hybride 50-54. Toutefois, l’ajout des autres quantités de toyocamycine ont permis d’induire l’expression de SpCas9 et la formation d’un exon hybride 50-54, bien que le niveau d’expression la SpCas9 n’était pas aussi élevé que dans le contrôle positif. L’observation d’une quantité moins importante de SpCas9 dans les échantillons traités à la toyocamycine concorde avec l’intensité moindre du signal GFP observé lors du premier test d’induction.

Par ailleurs, dans le contrôle positif où la SaCas9 s’exprime, la formation de l’exon hybride 47-58 a été observée (Figure 29B). Contrairement à l’induction de l’expression de protéine SpCas9, toutes les concentrations de toyocamycine ont permis d’induire

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la formation de l’exon hybride 47-58 avec la SaCas9. De façon intéressante, à partir de 0.75 µM de toyocamycine le niveau d’expression de SaCas9 induite par l’inhibition du SCR a atteint un niveau comparable à celui observé dans le contrôle positif.

Ainsi dans la suite de nos expériences, nous avons utilisé notre système inductible avec la SaCas9 qui reproduisait au mieux les résultats observés avec un système sans contrôle SCR, tel qu’indiqué par le niveau d’expression de la protéine SaCas9 en présence de toyocamycine.

Figure 29. L'inhibition du ribozyme N79 permet le contrôle de l'expression de SpCas9 et de SaCas9 et de leur activité d'édition génomique

Plusieurs concentrations de toyocamycine variant de 0 µM à 2µM ont été testées pour induire l’expression et l’activité endonucléase de la SpCas9 (A) et de la SaCas9 (B) dans des cellules 293T. La toyocamycine était ajoutée au milieu de culture 24 h après la transfection. 48 heures après l’ajout de toyocamycine, l’expression de la SpCas9 et de la SaCas9 a été analysée par western-blot respectivement avec des anticorps I anti-FLAG et anti-HA. L’activité endonucléase a été déterminée par PCR afin de détecter la formation d’un exon hybride 47-58 dans le gène de la dystrophine humaine.

A

130

7.2.2.3. Utilisation de la toyocamycine pour le contrôle de l’édition du gène

Dmd dans le modèle de souris dystrophique humanisée del52hDMD/mdx

La protéine SaCas9 peut être exprimée de façon transitoire in vitro par la transfection ou la nucléofection du gène de la SaCas9, dans la plupart des lignées de cellules. Cependant, lors d’applications systémiques in vivo, le gène de la SaCas9 doit être livré par un AAV dans l’organisme et ceci va entrainer une expression soutenue de la protéine SaCas9. Cependant, dans le cadre du développement d’approches thérapeutiques par édition génomique, l’expression de l’endonucléase n’est nécessaire que pour une durée suffisante à l’édition génomique de la cible d’intérêt. Le maintien de l’expression de l’endonucléase après édition de la cible génomique d’intérêt ne fait qu’augmenter le risque de mutations hors-cible qui peuvent éventuellement être néfastes pour un patient. De plus, l’expression à long terme de Cas9 pourrait être à l’origine de la mise en place d’une réponse immunitaire cytotoxique dirigée contre les cellules traitées. Cela annihilerait ainsi le potentiel thérapeutique d’un traitement systémique par édition du génome. Il est donc important de travailler à la mise en place d’outils qui permettent de contrôler in vivo l’activité de la Cas9 et donc d’augmenter l’innocuité de ces traitements pour des applications cliniques.

Avant de tester l’induction de l’expression de la protéine SaCas9 in vivo, nous avons évalué la toxicité de la toyocamycine dans des souris C57BL/6J (Figure 30). Des concentrations de toyocamycine allant de 0.5 mg/kg à 2 mg/kg ont été administrées à ces souris par voie intraveineuse (i.v.) ou par voie intrapéritonéale (i.p.).

Etant donné que les injections répétées de toyocamycine ont démontré une toxicité chez les souris et chez des patients lors d’un essai clinique pour le traitement du myélome multiple, nous avons suivi le poids des souris après injection de cette molécule. Dans ces expériences, une perte de poids supérieure ou égale à 20% du poids initial était considérée comme un point critique.

Les souris injectées avec 2 mg/kg de toyocamycine par i.p. ont atteint le point critique en moins de 7 jours. Par ailleurs, l’administration de 0.5 mg/kg et 1 mg/kg ne démontrait pas de perte de poids au-delà de 20% de leur poids initial. Cependant nous avons pu observer que 2 injections de 1 mg/kg toyocamycine par i.p. était responsable d’une perte de poids de 10%. De façon intéressante, l’administration par i.v. de 0.5 mg/kg, 1 mg/kg ou 2 mg/kg de toyocamycine n’entrainait pas de perte de poids chez

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les souris. Ainsi, dans la suite des expériences, 2 mg/kg de toyocamycine ont été administrés par voie i.v. aux souris.

Figure 30. Évaluation de la toxicité de la toyocamycine in vivo

La toxicité de la toyocamycine a été étudiée dans le modèle de souris C57bl/6. Le poids des souris a été mesuré la veille des injections afin d’ajuster pour chaque souris la quantité de toyocamycine /kg à administrer par voie i.p. ou i.v. Les quantités testées sont les suivantes : 0.5 mg/kg, 1 mg/kg ou 2 mg/kg. La première injection était faite à J0 et la deuxième injection à J3. Les souris qui ne recevaient pas de toyocamycine ont été injectées avec une solution saline. Le poids des souris a été suivi en le normalisant par rapport à leur poids à J-1 établi à 100%.

Afin d’évaluer, la faisabilité de notre approche pour l’induction de l’expression de la

70 80 90 100 110 -1 1 3 5 7 9 P o u rce n tage d u po ids init ial (% ) Jours Injection de toyocamycine à 2 mg/kg 2mg x 2 IP 2mg x 2 IV 2mg IP 2mg IV Ct 70 80 90 100 110 -1 1 3 5 7 9 P o u rce n tage d u po ids init ial (% ) Jours Injection de toyocamycine à 1 mg/kg 1mgx2 IP 1mgx2 IV 1mg IP 1mg IV Ct 70 80 90 100 110 -1 1 3 5 7 9 P o u rce n tage d u po ids init ial (% ) Jours Injection de toyocamycine à 0,5 mg/kg 0,5mgx2 IP 0,5mgx2 IV 0,5mg IP 0,5mg IV Ct

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SaCas9 in vivo via l’inhibition de l’activité du SCR N79 par la toyocamycine, des expériences ont été réalisées dans le modèle de souris del52hDMD/mdx.

Des souris âgées de 6 semaines ont été co-injectées avec deux AAV9. Le premier AAVcodait l’expression de la paire de sgRNAs 3-47/16-58 pour permettre la formation de l’exon hybride 47-58. Le deuxième AAV9 contenait le gène de la SaCas9 directement sous le contrôle du promoteur CMV (AAV9-CMV-SaCas9) ou bien sous le contrôle du CMV et du SCR N79 (AAV-CMV-Rz-SaCas9).

Deux semaines après l’injection des virus recombinants, les souris ayant reçu un AAV- CMV-Rz-SaCas9 ont reçu par i.v. 2 mg/kg de toyocamycine ou une solution saline d’un volume équivalant. 72 heures après ces traitements, les souris ont été sacrifiées afin d’analyser au niveau protéique l’induction de la synthèse de SaCas9, et au niveau génomique la formation de l’exon hybride 47-58. Dans la souris contrôle injectée avec des AAVs codant pour l’expression de la SaCas9 et la paire d’ARNgs 3-47/16-58, nous avons pu observer l’expression de la SaCas9 par Western-Blot, ainsi que la formation de l’exon hybride 47-58 par PCR. Dans la souris ayant reçu le AAV-CMV-Rz-SaCas9 et un autre AAV pour l’expression de la paire d’ARNgs 3-47/16-58, l’expression de SaCas9 et la formation de l’exon hybride 47-58 n’ont pas été détectées. Dans cette même condition, l’injection de 2 mg/kg de toyocamycine par i.v. n’a pas permis d’induire l’expression de SaCas9 ni la formation de l’exon hybride.

7.3. Discussion

Tandis que la découverte du système CRISPR/Cas9 ouvre la voie vers de nouvelles perspectives thérapeutiques pour de nombreuses maladies génétiques, la possibilité de mutations hors-cible soulève des questions concernant l’innocuité de telles approches. Parmi l’éventail de thérapies envisageables par édition génomique, un grand nombre d’entre elles nécessitent la livraison systémique d’un AAV codant l’expression d’une endonucléase Cas9 dont l’expression soutenue peut représenter un risque d’augmentation de la fréquence des mutations off-targets à long terme.

L’un des autres obstacles à l’utilisation de la Cas9 pour des applications est une réponse immune préexistante contre la Cas9. Cela est d’autant plus problématique qu’une étude a récemment démontré l’existence d’anticorps IgG dirigés contre la SaCas9 dans 79% d’individus [338]. Plus inquiétant, des lymphocytes T cytotoxiques réactifs avec la SaCas9 ont été identifiés dans 46% des échantillons de sang

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périphériques des donneurs. Ainsi, lors d’applications systémiques, des cellules infectées par un AAV (ou autres vecteurs) et exprimant constitutivement la SaCas9 pourrait être détruites par cette réponse cytotoxique ce qui pourrait fortement limiter l’efficacité du traitement en plus de représenter un risque pour la sécurité du patient.

Plusieurs approches ont été envisagées pour contrôler l’activité du système CRISPR/Cas9 afin de réduire les mutations hors-cible [200]. Certaines d’entre elles reposent sur des Cas9 scindées dont le réassemblage est dépendant d’un modulateur [348-350]. D’autres ont mis au point un ARN guide inductible dont l’architecture normale est restaurée par la présence d’un inducteur et dont l’absence inhibe son interaction avec la Cas9 qui ne peut donc plus se lier à l’ADN pour y faire une coupure double brin [351, 352]. Plus classiquement, certaines approches ont eu recourt à des systèmes Tet-on/Tet-off qui permettent d’induire l’expression de Cas9 ou d’un ARNg en présence seulement de doxycycline [211, 212, 353]. Cette approche peut être limitée dans son application in vivo car elle nécessiterait la livraison d’un AAV supplémentaire codant pour un transgène possiblement immunogénique, en plus d’augmenter le coût du global du traitement [354].

D’autres stratégies introduisent des mutations dans le gène codant la Cas9 en utilisant, en plus des ARNgs qui ciblent la région génomique à éditer, un ARNg supplémentaire qui cible le gène de la Cas9 [209, 210]. Ainsi, parallèlement à l’édition ciblée du génome d’une cellule à traiter, la Cas9 va générer des coupures dans le gène qui la code ce qui entraine la formation d’un codon Stop prématuré et empêchera par la suite la synthèse de celle-ci.

Nous avons donc tenté de valider un système dans lequel il est possible de contrôler directement le niveau d’expression de protéines Cas9 sans utiliser de produit intermédiaire comme un répresseur Tet ou de protéine de fusion. La séquence du SCR N79 n’est que de 83 bp ce qui permet de l’incorporer facilement dans n’importe quelle construction sans affecter significativement la longueur de l’insert à encapsider dans une particule virale. Ainsi, nous avons donc construit un vecteur d’expression dans lequel la séquence correspondant au SCR N79 a été insérée entre le promoteur et le gène codant pour la SpCas9 ou la SaCas9 et dont l’expression ne serait possible qu’en présence de toyocamycine.

Nous avons pu faire la preuve que ce système inductible pharmacologiquement et de façon exogène est fonctionnel in vitro. Cependant nous n’avons pas été capable de

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reproduire des résultats semblables in vivo dans le modèle de souris del52hDMD/mdx en appliquant notre approche qui vise à corriger le gène Dmd, tel que suggéré par l’absence de production de la SaCas9 et l’absence de formation d’un exon hybride. L’obtention d’un tel résultat pourrait s’expliquer par une inactivation trop rapide de la toyocamycine lors de son administration systémique. En effet, la toyocamycine est un analogue de l’adénosine dont la demi-vie dans le sang serait de 10 secondes seulement [355]. Cela peut donc soutenir l’hypothèse que la toyocamycine ne peut atteindre efficacement les tissus dans lesquels nous avons cherché à modifier le génome. De plus, l’administration systémique d’adénosine s’accompagne d’effets secondaires qui limite son usage lors d’essai clinique. Cela est en accord avec la toxicité que nous avons observée lors de l’administration de toyocamycine par voie intrapéritonéale. Il serait donc pertinent d’envisager le recours à une méthode de livraison qui permettrait de limiter l’exposition de cette molécule dans la circulation sanguine tout en permettant une livraison efficace dans les tissus d’intérêt à traiter. A l’heure actuelle nous n’avons pas été capable d’obtenir des résultats concluants in

vivo, ce qui remet en question la pertinence d’un tel système dont l’intérêt principal

était de limiter la fréquence de mutations non-spécifiques dans une approche systémique.

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CONCLUSION

Discussion, défis à relever et perspectives

Avec près de 2800 essais cliniques en cours à travers le monde, la thérapie génique est en train de façonner un nouveau pan de la médecine de demain (http://www.abedia.com/wiley/phases.php). Les approches par éditions génomiques comptent parmi les plus grands espoirs de demain pour la mise au point de traitements curatifs pour de nombreuses maladies génétiques. De telles corrections permettraient ainsi de protéger les patients contre une progression de leur maladie voire même de rétablir un phénotype sain leur offrant une vie presque normale.

Parmi ces maladies, la dystrophie musculaire de Duchenne se caractérise par un phénotype particulièrement sévère et est aussi l’une des plus fréquentes avec 300 000 patients référencés dans le monde. Les premiers symptômes se manifestent dès l’âge de 4 ans par des pertes de motricité et le diagnostic de DMD tombe rapidement suite à des analyses de biopsies musculaire et des tests génétiques identifiant la mutation dans le gène Dmd. Le patient sera alors placé sous traitement avec des glucocorticoïdes comme le Deflazacort ou le Prednisolone afin de ralentir le développement de la maladie. Progressivement, le patient va perdre son autonomie et aura recourt à l’usage d’un fauteuil roulant pour l’assister dans ces déplacements dès le début de son adolescence. La répétition de cycles de dégénérescence/régénération au niveau des muscles va entrainer un remplacement des cellules musculaires par du tissus adipeux et du tissus fibreux qui entrainent l’incapacité des muscles à produire une force et des mouvements. Le patient est ainsi dépourvu de toute autonomie et sa prise en charge se fera exclusivement par des soins palliatifs. Les atteintes respiratoires vont requérir une assistance respiratoire et parallèlement des cardiomyopathies font leur apparition. Fatalement, le patient décèdera vers l’âge de 20 à 30 des suites de défaillance cardiorespiratoire.

Dans le chapitre 5, nous avons utilisé la SaCas9 pour corriger le gène Dmd, au lieu de la SpCas9 qui avait déjà été utilisée plus largement par la communauté scientifique.

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Généralement, les stratégies envisagées par les autres groupes de recherche ne