Modèles de souris dystrophiques

2.4.1.1. Modèles de souris dystrophiques mdx

Les modèles de souris mdx sont les plus largement utilisés pour l’étude de la DMD. Parmi ces modèles on retrouve les souris mdx, mdx2cv_{, mdx}3cv_{, mdx}4cv_{, mdx}5cv_{, mdx52} qui présentent chacun des mutations différentes dans leur gène codant pour la dystrophine [73] (http://www.dmd.nl/DMD_animal_mut.html) . Le premier modèle de souris dystrophique mdx fut découvert au début des années 1980 [74]. Celui-ci se caractérise par une mutation dans l’exon 23 du gène mdx qui est responsable la formation d’un codon STOP (mutation non-sens C→T) qui empêche la synthèse d’une protéine dystrophine complète et fonctionnelle et donc son absence de localisation sous la membrane du sarcolemme [43].

Les modèles créés en laboratoire mdx2cv _{(mutation du site d’épissage 3’ dans l’intron} 42), mdx3cv _{(mutation du site d’épissage 3’ dans l’intron 65), mdx}4cv _{(mutation non-sens} dans l’exon 53), mdx5cv _{(mutation formant un nouveau site d’épissage dans l’exon 10)} et mdx52 (délétion de l’exon 52) ne présentent pas de grandes différences de phénotype avec le modèle mdx. Néanmoins, les modèles mdx4cv _{et mdx}5cv _possèdent significativement moins de fibres musculaires révertantes que les autres modèles mdx [75]. Bien que moins utilisés, les modèles de souris mdx4cv _{et mdx52 demeurent} intéressants car les mutations dans leur gène mdx, sont localisées dans une région génomique qui est fréquemment muté chez les patients DMD, c’est-à-dire dans le hot- stop 45-55.

Bien que ces différents modèles permettent de valider les preuves de principe de diverses approches thérapeutiques, comme le saut d’exon ou encore la thérapie génique pour la livraison de mini- ou de micro-dystrophine, ces modèles ne portent pas un gène de dystrophine humain qu’il serait pertinent d’avoir pour l’étude d’approches par édition du génome.

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2.4.1.2. Modèles de souris humanisées hDMD

Les séquences en acides aminés de la dystrophine humaine et de souris sont similaires à 91%. Cette différence significative ne permet donc pas d’étudier in vivo dans les modèles murins mdx les approches thérapeutiques dépendantes des séquences du gène Dmd ou encore du transcrit qui lui correspond. Afin de combler le besoin d’un modèle humanisé, le modèle hDMD/mdx a été développé [76] [77]. Ce modèle est muté pour le gène de la dystrophine de souris (mutation non-sens dans l’exon 23) mais il possède aussi le gène complet (introns et exons) de la dystrophine humaine, inséré dans le chromosome 5 à partir d’un chromosome artificiel de levure contenant le gène Dmd, humain [78]. Ce modèle présente donc la particularité de ne produire que la protéine dystrophine humaine. Il est à noter que dans ce modèle, la protéine dystrophine humaine permet de compenser l’absence de la dystrophine de souris tel qu’indiqué par le profil histologique comparable à celui une souris de type sauvage [76].

Cependant, ce modèle hDMD/mdx ne permet pas d’étudier les approches thérapeutiques visant à corriger directement le gène Dmd ou étudier les effets du saut d’exons qui permettraient de restaurer l’expression d’une protéine dystrophine tronquée.

Mais plus récemment, le modèle de souris hDMD52/mdx a été mis au point et permet à présent d’avoir un modèle murin plus adapté au besoin de la recherche sur la DMD [79]. Ce nouveau modèle a été développé à partir du modèle hDMD/mdx dans lequel la délétion de l’exon 52 du gène Dmd a été induite à l’aide de TALENs, qui seront décrits dans une section de chapitre suivante. La délétion de l’exon 52, qui ne contient pas un multiple de 3 nucléotides, est alors responsable d’un décalage du cadre de lecture du gène Dmd qui entraine l’absence de la production de la protéine dystrophine humaine complète et qui est donc absente sous le sarcolemme.

2.4.1.3. Phénotype des souris mdx et del52hDMD/mdx

Au niveau moléculaire, sur des coupes histologiques de muscles squelettique de souris mdx, on relève l’absence de la localisation sous le sarcolemme des protéines dystroglycan, synthrophine, dystrobrevine ou encore nNOS. Ces modèles se caractérisent aussi par un niveau de créatine kinase (CK) élevé dans le sérum, l’infiltration de macrophages et neutrophiles dans le tissu musculaire, ou encore une

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localisation centrale des noyaux dans les fibres musculaires. Cependant les phénotypes dystrophiques plus sévères tels que la dégradation des fibres musculaires, les atteintes cardiaques et respiratoires ne surviennent qu’à un âge très avancé de la souris. D’autres part, leur espérance de vie n’est que faiblement affectée.

L’apparition tardive de ces phénotypes pourraient en partie s’expliquer par une surexpression de l’utrophine qui compense l’absence de dystrophine dans les modèles murins [80] [81]. Ainsi, afin d’éviter l’effet compensatoire de l’utrophine, des modèles double-ko utrophine/mdx ont été mis au point de sorte à reproduire davantage le phénotype observé chez les patients DMD. Ce type de modèle permet d’observer des pertes de mobilités, d’augmenter fortement les atteintes cardiaques ou encore de réduire l’espérance de vie des souris [82, 83]. Cependant, il est a noté qu’un tel génotype n’a pas été observé chez les patients DMD et le maintien de telles colonies de souris est particulièrement compliqué. D’autre part, le développement limité d’un phénotype dystrophique chez les souris mdx peut s’expliquer par une meilleure conservation de la longueur des télomères [84]. Cela favorise un maintien des capacités des cellules satellites à participer très activement à la régénération musculaire et de compenser les lésions dues à l’absence de la protéine dystrophine qui engendrent de nombreux cycles de lésion/régénération sous l’effet de contraintes mécaniques. Ainsi, le phénotype dystrophique des souris mdx n’apparait qu’après plusieurs générations au cours desquelles la longueur des télomères réduits progressivement.

Certains paramètres fonctionnels peuvent cependant être utilisés pour caractériser le phénotype des souris mdx. Par exemple, les muscles Tibialis anterior (TA) de souris mdx, soumis à des étirements ex vivo, démontrent un déficit de force 4 à 7 fois supérieur à celui d’une souris normale [85]. Il est aussi possible d’évaluer l’intégrité des fibres musculaires avec le colorant bleu d’Evans [86]. Ce marqueur, injecté par voie intraveineuse avant l’essai, peut diffuser dans les fibres musculaires endommagées où il émettra une fluorescence.