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Figura 17 - Corte histológico de epidídimo de macho de C. mydas adulto. A) Visão geral do

epidídimo (Barra 500 µm) B) Visão ampliada da região dos ductos eferentes (d) (Barra 100 µm) C) Visão ampliada dos ductos epididimários (D) (Barra 100 µm). M indicando as Fibras musculares, Z: espermatozoide. H.E. Barras 500 µm.

42 4.6. Tamanho da Primeira Maturação Gonadal

4.6.1. Fêmeas

Os dados de Comprimento curvilíneo da carapaça (CCC) foram relacionados com os estágios de maturação gonadal estabelecidos para ambos os sexos. Os resultados indicaram que a menor fêmea em estágio pré-pubescente foi da espécie Chelonia mydas e apresentou comprimento curvilíneo da carapaça mínimo de 29 centímetros, indicando o início da maturação gonadal. O tamanho médio de indivíduos que estão na fase inicial de maturação gonadal foi de 37,07 centímetros (±6,98).

Os indivíduos caracterizados como pubescentes apresentaram um comprimento médio de 77,04 centímetros (±11,74), e os maduros, já em reprodução, apresentaram o menor comprimento de 89,0, com média de 101,35 centímetros (±6,32) (Tabela 9).

Tabela 9- Estágios de maturação gonadal com suas características, CCC mínimo e médio para fêmeas

de Chelonia mydas, Eretmochelys imbricata e Caretta caretta registradas na Bacia Potiguar.

Estágio Características Frequência CCC mín. Média CCC

Pré-pubescente Folículos homogêneos 37 29 37,07 (±6,98)

Pubescente Folículos com presença

inicial de vesícula 14 61 77,04 (±11,74)

Madura Folículos vitelogênicos 7 89 101,35 (±6,32)

4.6.2. Machos

Os machos de tartarugas marinhas classificados como pré pubescentes apresentaram comprimento curvilíneo da carapaça mínimo de 27 centímetros com média de 38,68 centímetros (±10,01). Os indivíduos pubescentes, ou seja, juvenis, apresentaram comprimento curvilíneo da carapaça mínimo de 66 centímetros com média de 89,92 centímetros (±17,80). Para os machos maduros, o comprimento mínimo foi 105 centímetros (Tabela 10).

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Tabela 10 - Estágios de maturação gonadal com CCC mínimo e médio para machos de Chelonia

mydas e Eretmochelys imbricata registrados na Bacia Potiguar.

Estágio Frequência CCC mín Média CCC

Pré pubescente 20 27 38,68 (±10,01)

Pubescente 7 66 89,92 (±17,80)

44 5. DISCUSSÃO

Estudos que envolvam reprodução de tartarugas marinhas geralmente relacionam-se a informações sobre desovas e ninhos, principalmente pelos resultados das ações de conservação desenvolvidas há mais de 30 anos pelo TAMAR no Brasil.

Os trabalhos que enfoquem caracterização dos aspectos reprodutivos são de difícil realização, uma vez que o acesso aos indivíduos é limitado. A partir da última década, a exigência de execução de Projetos de Monitoramento de Praias como condicionantes ambientais, propiciou um incremento nas pesquisas sobre a biologia desses animais.

Entre os anos de 2011 e 2015, a análise dos dados referentes a proporção sexual de tartarugas marinhas encalhadas evidenciou maior proporção de fêmeas quando comparado aos machos (3,10:1). Estudos realizados sobre proporção sexual para indivíduos juvenis confirmam o padrão encontrado. Delgado et al. (2010), registraram proporção sexual de 2:1 (Fêmeas:Machos) para a espécie de Caretta caretta, na Ilha da Madeira, na costa portuguesa. Resultados semelhantes foram obtidos por Duarte et al. (2011), no Rio Grande do Sul, descrevendo para Chelonia mydas proporção sexual de 2,8:1 e para Caretta caretta de 2,5:1.

A análise da proporção sexual por anos de monitoramento, constatou que os valores indicaram a predominância para as fêmeas em todos os anos avaliados. Os menores valores da relação fêmeas: machos ocorreu para o ano de 2011, sendo de 2,72:1 e o maior em 2014 de 3,30:1. Em um estudo semelhante, McNeill (2016), relatou uma proporção de 3:1 (F:M) ao longo de um período de 10 anos (1998-2007), para uma população de tartarugas cabeçudas juvenis na Carolina do Norte, EUA.

Em relação as espécies estudadas, foi verificado o predomínio de fêmeas para C.

mydas, E. imbricata e C.caretta. Os registros de encalhes de tartarugas marinhas foram

predominantemente de tartarugas verdes (91,12%), representando a maior relação entre fêmeas e machos (3,46:1), com predomínio de fêmeas. Este padrão foi encontrado também para indivíduos de Caretta caretta (1,44:1). Para os representantes da espécie L.olivacea verificou-se relação de 0,94:1 para machos. Foram raros os registros para D. coriacea, sendo em igual número para machos e fêmeas (1:1).

Alguns trabalhos, relacionados a estimativas de proporções sexuais de filhotes em áreas de nidificação, indicam uma forte tendência de maiores taxas de nascimento de fêmeas em diversas regiões do mundo ao longo de diferentes anos (WIBBELS, 2003; KING et al., 2013; MARCOVALDI et al., 2014).

45 Hays et al. (2014) realizaram um levantamento sobre as publicações referentes a estudos sobre proporção sexual de filhotes de tartarugas marinhas. Tais autores constataram um valor superior a 50% de publicações sobre o tema com predomínio de fêmeas e proporção sexual maior que 3: 1. Uma proporção sexual maior para machos foi relatada em apenas quatro registros e apenas dois estudos indicavam uma proporção de sexo equilibrada.

Algumas hipóteses para explicar essa diferença nos valores de proporção sexual, com predomínio de fêmeas, estão relacionadas às mudanças climáticas. Por se tratarem de animais com determinação do sexo dependente da temperatura (TSD) são mais vulneráveis a tais mudanças. Hawkes et al. (2007) verificaram que o aumento pequeno da temperatura, cerca de 2ºC, em áreas de nidificação resultaria em ninhos totalmente feminizados e 3°C resultaria em temperaturas de incubação letal.

Resultados da pesquisa de Laloë et al. (2016) no Caribe, sugerem que nas últimas décadas houve menos de 15,5%, 36,0%, e 23,7% de machos nascidos a cada ano para C.

mydas, E.imbricata e C. caretta, respectivamente. Esses autores sugerem que o aquecimento

global exacerbará esta tendência de maior número de fêmeas, pois, as projeções indicam que apenas 2,4% dos filhotes de tartarugas verde serão machos até 2030, 1,0% até 2060 e 0,4% até 2090, de acordo com as temperaturas de incubação estimadas nas praias de nidificação avaliadas nesse estudo, sendo de 32,1 ° C até 2030; 33,0 ° C até 2060 e 34,2 ° C até 2090.

No entanto, devem ser consideradas as razões de mortalidade específica por sexo durante o desenvolvimento. Fatores como o gasto energético para produzir ovos e a exposição nas praias de nidificação, poderiam aumentar a mortalidade de fêmeas adultas em relação aos machos (WIBBELS, 2003).

Percebe-se que a maioria dos estudos de proporção sexual limita-se a filhotes, pois, em populações de adultos há limitações devido a fatores como a logística de amostragem desses animais, além de serem complicados de analisar devido a questões como a interferência dos impactos humanos e os padrões de migração que são bastante distintos entre machos e fêmeas (WIBBELS, 2003).

Neste estudo, a proporção sexual foi avaliada para todas as classes de comprimento e para todas as espécies, demonstrando pequenas variações. Os dados referentes a Chelonia

mydas indicaram o predomínio de fêmeas em todas as classes de comprimentos, entretanto

para Eretmochelys imbricata e Caretta caretta verificou-se que nas classes de comprimento abaixo de 40,0 cm ocorreu o predomínio de machos.

46 Resultados semelhantes foram encontrados por McNeill et al. (2016) em suas análises de proporção por classes de comprimento, para tartarugas cabeçudas. Os autores relataram maior quantidade de fêmeas em todas as classes subdivididas entre 40,0 e 75,9 centímetros.

Quanto aos registros de tartarugas marinhas por classe etária para C. mydas e

E.imbricata, verificou-se que o número de animais juvenis foi superior ao número de adultos

e filhotes, totalizando 85% do total, estando a maioria deles entre as classes de comprimento de 40,0 a 60,0 cm.

Na mesma área de estudo Gavilan-Leandro et al. (2016) evidenciaram maior percentual de registro de encalhes de indivíduos juvenis para os anos de 2010 a 2013. Emiliano (2014) também observou, nesta mesma área de estudo que Chelonia mydas e

Eretmochelys imbricata apresentaram maiores valores de frequência de encalhes na fase

juvenil.

Resultados semelhantes foram encontrados por Santos et al. (2015) para tartarugas de pente capturadas em Fernando de Noronha, onde 95% delas apresentavam CCC menor do que 64 cm, indicando que são juvenis. Berrêdo et al., (2013) encontraram que 97% de tartarugas verdes que encalham em Anchieta/ES são juvenis.

Esses resultados podem ser explicados pela alta disponibilidade de indivíduos jovens na zona mais próxima da costa. De acordo com Musick e Limpus (1997), após a eclosão os filhotes de tartarugas marinhas permanecem um período de alguns anos na zona pelágica e quando juvenis migram para a zona nerítica. As populações de tartarugas juvenis em ambientes tropicais tendem a apresentar movimentos mais localizados, enquanto que em zonas temperadas, fazem migrações para áreas de forrageio em latitudes maiores no verão e menores no inverno.

Assim, os espécimes que ocorrem na Bacia Potiguar buscam melhores condições para alimentação e desenvolvimento, aumentando a ocorrência de encalhes nessa área (FARIAS, 2014).

Chelonia mydas, bem como as demais espécies, possuem um alto índice de

mortalidade de indivíduos juvenis devido a captura incidental em pescas costeiras em todo o litoral brasileiro (ALMEIDA, 2011). Segundo Farias (2014) na região há interação antrópica das tartarugas marinhas com a pesca, predominando lesões com objetos cortantes, como também ingestão de resíduos sólidos, que foram encontrados em 69% dos tratos gastrointestinais dos animais necropsiados, nesta mesma área de estudo entre 2010 e 2012.

47 Vale ressaltar ainda que na área de estudo existem atividades relacionadas a Exploração de Sal, Petróleo e Gás, Carcinicultura e Eólicas. Essas atividades também causam impactos a esses animais, caso não sejam realizadas de forma sustentável (GAVILAN- LEANDRO et al., 2016).

Apesar do predomínio de juvenis, foram registrados também animais adultos neste estudo e raros registros de filhotes. Sabe-se que a área estudada é utilizada por E. imbricata e

L. olivacea para nidificação, sendo a maioria frequência dos registros nos trechos pertencentes

aos municípios de Macau/RN e Guamaré/RN (GAVILAN-LEANDRO et al., 2016). Esses registros reprodutivos, poderiam explicar a presença e encalhes de animais filhotes e adultos na área de estudo.

Para a espécies L. olivacea e C. caretta houve um predomínio de encalhes de animais adultos. A maioria dos espécimes de tartaruga oliva apresentavam CCC entre 60,0 e 80,0 centímetros, vale ressaltar que essa espécie é a menor das tartarugas marinhas. Já para C.

caretta houveram mais registros entre as classes de comprimento de 80,0 a 100,0 centímetros.

Para a espécie D. coriacea só houveram dois registros de encalhes na área, os tamanhos dos animais eram 52,0 cm e 149,0 cm.

Tendo em vista o padrão observado por Emiliano (2014), na mesma área de estudo entre os anos de 2010 e 2013, a tartaruga oliva manteve o mesmo padrão de predominância de encalhes de adultos.

As avaliações da fase de desenvolvimento, bem como o sexo, puderam ser melhores avaliados e confirmados a partir das análises macroscópica das gônadas e da histologia gonadal.

Os animais que vieram a óbito na Base de Reabilitação foram avaliados nos procedimentos de necropsia. Verificou-se que as características macroscópicas em geral, para as tartarugas de ambos os sexos, nas diferentes fases de desenvolvimento, estão de acordo com o que foi descrito por Miller e Limpus (2003). Este autor descreveu a respeito da

ontogenia das gônadas das tartarugas marinhas através de exames laparoscópicos.

Além disso, algumas características mais específicas foram similares também aos resultados de outros trabalhos, como a textura granulosa das gônadas de fêmeas (DELGADO, 2008; ROSA, 2009) e a forma fusiforme alongada das gônadas dos machos (DELGADO, 2008).

Em geral, a morfologia macroscópica foi útil para diferenciar machos e fêmeas nos estágios de maturação mais avançadas. De acordo com Miller e Limpus (2003), durante os

48 anos que antecedem a puberdade desses animais, as alterações na morfologia gonadal resultam do crescimento do ovário e do testículo tornando suas diferenças morfológicas cada vez mais visíveis.

No entanto, verificou-se que estes não são critérios seguros para diferenciação sexual nos indivíduos imaturos pré-pubescentes, pois, macroscopicamente as gônadas são semelhantes, sendo necessária a confirmação do sexo através da histologia.

Assim, a técnica histológica caracteriza-se como uma ferramenta eficaz para a confirmação e determinação do sexo dos indivíduos, corroborando com vários autores que consideram a análise da histologia gonadal como a mais eficiente e segura para a identificação de fêmeas e machos (WIBBELS, 2003; CERIANI, WYNEKEN, 2008).

Com base na presença e nas características das células germinativas, as análises microscópicas permitiram a identificação sexual e a classificação em fases de desenvolvimento. Os machos foram identificados pela presença de túbulos seminíferos, enquanto que as fêmeas exibiram folículos esféricos.

Buscou-se analisar quantidades equilibradas de amostras por sexo e por espécie, mas, como dependia-se de material de encalhes, o número total de animais disponíveis tanto por sexo quanto por espécie foi variável. Assim, a maioria das gônadas analisadas foram de

Chelonia mydas. No entanto, não houve diferenças significativas nas características

histológicas gerais entre as espécies.

As fêmeas imaturas pré-pubescentes apresentaram ovários com folículos pequenos, citoplasma homogêneo, sem estroma expandido e sem material de reserva. Apesar de existirem poucos trabalhos sobre a histologia de gônadas de tartarugas, os resultados estão em concordância com o que já foi descrito para essa fase de desenvolvimento para Chelonia

mydas por Rosa (2009) no Brasil, para tartarugas de pente e verde feitas por Pérez et al.

(2010) em Cuba, e, com a primeira descrição histológica da gônada de Caretta caretta juvenis, realizada por Delgado (2008) em Portugal e Cabo Verde.

Os ovários pubescentes foram caracterizados pela presença de folículos pré- vitelogênicos, com citoplasma aumentado contendo algumas vesículas, indicando a produção inicial de material de reserva. Pérez et al. (2010) encontraram resultados semelhantes para C.

mydas e E. imbricata nessa mesma fase de desenvolvimento.

Corroborando também com os resultados, a pesquisa feita por Pérez-Bermúdez et al. (2012), que descreveu pela primeira vez o desenvolvimento folicular ovariano de E.

49 pubescentes e adultos. Nessa fase, os folículos apresentaram pequenas gotas lipídicas em algumas regiões do citoplasma.

A presença de lipídeos no citoplasma do ovócito em estados pré-vitelogênicos já foi descrita para outros répteis (GURAYA, 1989) e também para tartarugas marinhas, indicando que nessa fase o ovócito crescerá rapidamente devido à atividade transcricional de cromossomos e ao forte metabolismo associado à síntese lipídica (PÉREZ-BERMÚDEZ et al., 2012).

Nos ovários maduros foram encontrados folículos com maior diâmetro do que nos estágios anteriores, contendo plaquetas de vitelo, folículos vitelogênicos e também folículos em diferentes fases de desenvolvimento. Resultados similares foram descritos por Pérez- Bermúdez et al. (2012), identificando que na vitelogênese as plaquetas de vitelo aumentam progressivamente de diâmetro e ocupam completamente o citoplasma.

Esses pesquisadores constataram também que várias classes de diâmetros de folículos vitelogênicos e pré-vitelogênicos coexistem na reprodução de adultos, e, sugeriram que podem ser equivalentes as diferentes ninhadas na mesma época de nidificação ou de grupos de folículos que iniciarão a vitelogênese antes da próxima época de reprodução.

Para os machos imaturos caracterizados como pré-pubescentes, apresentaram túbulos seminíferos com pequeno diâmetro, epitélio seminífero constituído predominantemente por espermatogônias e células de Sertoli. Nos testículos pubescentes identificou-se a expansão dos túbulos, em relação ao estágio anterior, a presença de espermatócitos primários e mais camadas de células no epitélio germinativo.

Na pesquisa de Otsuka et al. (2008) foram identificadas características semelhantes para os túbulos seminíferos de C. mydas juvenis. Entretanto, no trabalho de Pérez-Bermúdez et al. (2010) foi possível observar que em dois machos pubescentes os túbulos seminíferos apresentaram também espermatócitos secundários, espermátides e escassos espermatozoides.

Em virtude da maioria das pesquisas sobre biologia reprodutiva serem realizadas com fêmeas em áreas de nidificação, há dificuldades em obter dados para machos, principalmente juvenis. Dados sobre o processo histológico de desenvolvimento das gônadas juvenis são escassos (OTSUKA et al., 2008).

Nesta pesquisa apenas um macho de C. mydas foi classificado como maduro, pela presença de espermatozoides no lúmen dos túbulos seminíferos, epitélio germinativo com várias camadas e diferentes tipos celulares. Segundo WIBBELS et al. (1990) essas características indicam que esse animal já desenvolveu todo o ciclo espermatogênico.

50 Verificou-se a presença de ductos eferentes na região da cauda do epidídimo de um espécime adulto, com epitélio cuboide e rodeados de fibras musculares. Esses achados foram similares ao encontrado por Otsuka et al (2008) em Chelonia mydas, que verificaram a presença de dois tipos de ductos eferentes: ductos eferentes proximais os quais localizaram-se na região da cabeça do epidídimo, ou porção proximal e os ductos eferentes distais, que foram encontrados ao longo de todo epidídimo.

Para confirmar as alterações histológicas de animais pubescentes e maduros é necessária uma melhor investigação em mais espécimes com maiores comprimentos de carapaça, pois, nesta pesquisa prevaleceu machos com tamanhos pequenos.

Sugere-se ainda que sejam investigadas também as variações temporais que podem refletir em modificações nas gônadas, já que esses répteis possuem reprodução sazonal. De acordo com Wibbels (1990) machos adultos de C. caretta, exibem uma espermatogênese "pré-nupcial", coincidindo com o aumento das concentrações de testosterona nos meses relacionados aos acasalamentos.

Rosa (2009), analisando a reprodução de juvenis de C. mydas, encontrou que o desenvolvimento gonadal foi considerado concomitante com o crescimento da carapaça. Da mesma forma, Pérez-Bermúdez et al. (2012), analisando as fases foliculares de ovários de E.

imbricata, encontraram que o comprimento retilíneo da carapaça foi estatisticamente

dependente do estágio de maturação gonadal. Apesar disso, concluem ao final da pesquisa que o tamanho da fêmea é uma medida imprecisa na identificação da presença de estágios foliculares em fêmeas sub adultas.

Apesar dessa relação, evidenciamos em nossas análises, uma fêmea de C. mydas de 89 cm de CCC, categorizada como adulta, por apresentar folículos vitelogênicos e características histológicas de um animal maduro. Entretanto, outras três fêmeas, dessa mesma espécie, com mais de 90 cm foram consideradas pubescentes, após a análise histológica dos ovários, pois, só haviam folículos pré-vitelogênicos.

Embora estejamos lidando apenas com 4 animais, destaca-se a necessidade de considerarmos as variações gonadais de acordo com a sazonalidade. A fêmea de 89,0 centímetros descrita acima foi registrada no dia 02/01/2014, ou seja, no pico da estação reprodutiva na nossa região. Provavelmente esse animal estava em processo de subir para desovar. Os demais indivíduos com CCC superior a 90,0 centímetros foram registrados em 14/03/2011, 08/02/2013 e 10/06/2013.

51 Esses resultados confrontam com os dados reprodutivos em relação ao menor tamanho da fêmea da espécie, considerada madura, que foi encontrada desovando, com 90 cm (MOREIRA, 2003).

Com relação aos machos, houve também uma situação contrastante em que um espécime de C. mydas com 114 cm foi classificado com pubescente, pois, histologicamente não foram observados espermatozoides dentro dos túbulos seminíferos, enquanto que, o único macho categorizado como maduro era um C. mydas de 105 cm. Ressalta-se a importância da associação conjunta de características fenotípicas, como tamanho do animal, da cauda ou do pênis, associadas a resultados de histologia gonadal.

Pérez et al (2010) verificou que alguns machos de E. imbricata pubescentes sem o pênis totalmente desenvolvido, histologicamente apresentavam atividade espermatogênica, indicando uma assincronia entre desenvolvimento testicular e peniano. Enquanto um outro espécime que havia sido fenotipicamente considerado adulto, histologicamente não era maduro.

Os resultados da pesquisa realizada por Otsuka et al. (2008) com machos imaturos de

C. mydas também sugerem que a medida de comprimento de carapaça não é um indicador de

maturidade, enquanto as avaliações histológicas são úteis para identificação dos estágios de crescimento das tartarugas verdes.

Vale ressaltar que, apesar de alguns autores utilizarem medidas de comprimento da carapaça como um indicativo de idade da maturação sexual (SANCHES et al., 1999; MARCOVALDI et al., 1999), outros autores não consideram o tamanho como uma variável apropriada para classificar estado de maturidade nestas espécies (MILLER, 1997; PÉREZ et al., 2010).

Sabe-se que o tamanho dos indivíduos pode variar devido as condições climáticas e disponibilidade de alimento nas áreas de forrageamento (LIMPUS; NICHOLLS, 2000), além da questão genética, pois, populações com maior variabilidade genética são mais resistentes aos problemas ambientais que interferem bastante no desenvolvimento desses répteis (JOSEPH; SHAW, 2011). Por serem animais migratórios, as tartarugas marinhas imaturas e adultas podem habitar as mesmas áreas, mesmo sendo nativas de diferentes locais do globo, assim podem apresentar tamanhos similares de carapaça mesmo estando em diferentes estágios de maturação (MILLER, 1997).