Transport des vésicules de tPA 

Nous  avons  ensuite  montré  que  le  tPA  était  transporté  le  long  des  axones  et  des  dendrites des neurones corticaux en culture et que ce transport s’effectue de façon rétrograde  (de la périphérie vers le corps cellulaire) et antérograde (du corps cellulaire vers la périphérie).  Nous avons mis en évidence que les vésicules contenant du tPA sont davantage mobiles dans  les axones (environ 1,22 µm/s) que dans les dendrites (environ 0,9 µm/s). Ces vitesses sont en  accord avec celles retrouvées dans la littérature pour le trafic des vésicules à cœur dense 

(Kwinter et al., 2009; Lochner et al., 1998) (Article 1 ; Figure 3). 

Au niveau des dendrites, les vésicules sont plus stationnaires que dans les axones. Ceci  peut s’expliquer par le fait que les vésicules de tPA sont sûrement situées au niveau des épines  dendritiques et probablement arrimées à la membrane plasmique pour être exocytées suite  à une dépolarisation neuronale. De plus, nous avons retrouvé une exocytose plus élevée des vésicules contenant l’HaloTag®‐tPA‐SEP dans les dendrites par rapport aux axones (Article 1 ;  Figure 6) ; ce résultat confirme l’hypothèse énoncée précédemment. Il serait donc intéressant  de vérifier cette hypothèse en effectuant un traitement au KCl sur ces cultures afin de vérifier  que la dépolarisation neuronale, induite par le KCl, provoque une diminution de la quantité

  166  Discussion  de spot de tPA‐HaloTag® au niveau des dendrites ou alors une augmentation de l’exocytose  de ces vésicules immobiles contenant la protéine HaloTag®‐tPA‐SEP.  En revanche, les vésicules contenant le tPA sont plus dynamiques dans les axones que  dans les dendrites. L’explication la plus probable est que ces vésicules retournent vers le corps  cellulaire pour être dégradées par les lysosomes ou alors pour aller activer certains gènes au  niveau du noyau. Le transport rétrograde du tPA  axonal pourrait avoir un rôle protecteur  comme pour le BDNF (Philippidou et al., 2011) en contrôlant des gènes responsables de la  survie neuronale. Ce transport rétrograde du tPA serait en accord avec les mécanismes de  survie du tPA (Correa et al., 2011; Liot et al., 2006; Wu et al., 2013). 

 

2. _{Trafic vésiculaire neuronal du tPA} 

 

2.1.

Le tPA neuronal peut être exocyté 

Comme nous l’avons vu dans la partie « 3.1 L’exocytose » de l’introduction, l’exocytose  est un mécanisme important pour le fonctionnement des cellules et principalement pour les  neurones.  Cette  fonction  est  à  la  base  de  la  communication  entre  les  différentes  cellules  cérébrales (Wu et al., 2014). Louessard et collaborateurs ont montré, que le tPA était contenu  dans des vésicules glutamatergiques synaptobrévines 2 (VAMP2) positives (Louessard et al., 

2016). D’autres études ont également révélé que le tPA pouvait être libéré dans le milieu 

extracellulaire suite à une dépolarisation neuronale par l’intermédiaire du KCl (Fernández‐

Monreal et al., 2004; Gualandris et al., 1996; Lochner et al., 2006) ou du NDMA (Nicole et al., 

2001).  

Nos recherches nous ont permis d’une part, de confirmer que le tPA est bien présent  dans des vésicules VAMP2 positives (Article 1 ; Figure 5) et d’autre part, de visualiser son  exocytose grâce à un outil original : un plasmide codant pour le HaloTag®‐tPA‐SEP (Article 1 ;  Figure 6). La SEP est une protéine fluorescente spéciale : en effet, cette GFP n’est fluorescente  qu’à pH 7,4 (pH extracellulaire), lorsque la protéine HaloTag®‐tPA‐SEP est dans les vésicules  (pH 5,5) elle ne peut donc pas émettre  de fluorescence. Cette technique  nous permet de  suivre en direct l’exocytose du tPA : dans les vésicules le tPA est seulement détectable grâce 

    167  Discussion  à sa fluorescence rouge (TMR ligand fixé à l’HaloTag®), lors de l’exocytose le tPA est détectable  via le TMR Ligand (rouge) mais également grâce à la GFP qui devient fluorescente (verte). Dans  cette étude, nous avons montré que le tPA n’était pas seulement libéré de façon régulée (par  un stimulus : le KCl ou le NMDA) mais qu’il est également libéré de façon constitutive par le  neurone à la fois dans l’axone et les dendrites (Article 1 ; Figure 6). Pour confirmer ce résultat,  on pourrait traiter nos cultures de neurones exprimant la protéine HaloTag®‐tPA‐SEP, avec la  toxine tétanique qui est un inhibiteur de l’exocytose. De la même manière, il serait intéressant  de visualiser l’exocytose régulée du tPA à l’aide d’un traitement au KCl ou au NMDA ; ces deux  molécules  provoquent  une  entrée  de  calcium  dans  la  cellule  ce  qui  va  engendrer  une  dépolarisation  neuronale.  Comme  vu  précédemment,  nous  avons  seulement  regardé  l’exocytose constitutive, c’est‐à‐dire non provoquée par une dépolarisation neuronale. Dans  notre cas, il est possible de comparer l’exocytose spontanée du tPA au niveau axonal versus  dendritique. L’exocytose spontanée est un mécanisme nécessaire pour le renouvèlement de  la  membrane  et  des  composants  de  celle‐ci  (récepteurs,  canaux,  etc.),  elle  peut  donc  s’effectuer tout au long des prolongements. En revanche, lors d’une exocytose régulée (via le  calcium), la libération présynaptique de molécules ne peut s’effectuer seulement au niveau  de la terminaison axonale, contrairement à l’exocytose post‐synaptique qui peut s’effectuer  tout au long des dendrites au niveau des épines. Il serait peut‐être plus pertinent de comparer  l’exocytose régulée versus constitutive au niveau des axones et au niveau des dendrites. En  effet  une  des  hypothèses,  qui  devrait  être  vérifiée,  est  que  le  tPA  est  libéré  de  façon  constitutive  dans  l’élément  post‐synaptique  (dendrites)  et  de  façon  régulée  au  niveau  du  compartiment présynaptique (axones). 

Nous  avons également démontré  que  le  tPA peut  être  contenu dans des  vésicules  VAMP3 positives (Article 1 ; Figure 5). Physiologiquement, VAMP3 est seulement exprimé par  les astrocytes et il est impliqué dans les endosomes de recyclage (Barber et al., 2015). Lorsque  VAMP3  est  exprimé  dans  les  neurones,  il  possède  les  mêmes  fonctions  d’exocytose  que  VAMP2 à savoir qu’il peut également interagir avec les t‐SNARE , la syntaxine 1 et SNAP‐25 

(Chilcote  et  al.,  1995).  VAMP7  est une  protéine  impliquée  dans  des  voies  de  sécrétion  et 

d’endocytose,  ce  qui  lui  permet  de  jouer  un  rôle  dans  la  croissance  des  neurites  et  la  transmission synaptique mais également dans le remodelage de la membrane plasmique et la  sécrétion lysosomale (Chaineau et al., 2009). Il serait donc intéressant d’étudier l’interaction 

 

168  Discussion 

du  tPA  avec  VAMP7  au  niveau  neuronal  afin  de  voir  d’une  part,  si  le  tPA  peut  subir  une  exocytose lysosomale et, d’autre part, confirmer son éventuelle implication dans la croissance  des neurites.  

 

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