Transport d'actifs par l'endothélium

Plusieurs protéines membranaires potentiellement impliquées dans l'activité de transport ont été localisées sur les membranes basolatérale et apicale. Il s'agit de canaux ioniques, de transporteurs ou co-transporteurs ou d’enzymes régulatrices intermédiaires (Figure 18).

Figure 18. Transport transmembranaire de l'endothélium cornéen (2011 Bonanno, 2007 Mergler) AE2: anion exchange protein 2, AQP1: aquaporine 1, CA: carbonic anhydrase, CFTR: cystic fibrosis transmembrane conductance regulatro, CLCA: calcium-activated chloride channel, ENaC: epithelial Na+ channel, MCT: monocarboxylate transporter, NBCe1: Na+ bicarbonate cotransporter electrogenic 1, NKCC: Na+:K+:2Cl- cotransporteur, NHE1: Na+ H+ exchanger 1, TRP: transient receptor potentiel channel, VOCC: voltage dependent calcium channel (EA2521 BiiGC, Université Jean Monnet, Saint Etienne).

Canaux ioniques :

Les canaux ioniques sont des pores transmembranaires perméables aux ions en fonction des gradients électrochimiques. Ils sont stimulés par différents paramètres comme la tension, les neurotransmetteurs, le stress mécanique, etc. L'ouverture des pores est sélective de certains ions (Mergler & Pleyer 2007).

Les canaux chloriques ont été décrits. CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, gène codant CFTR) est situé dans la membrane apicale. Sa stimulation par l’AMPc augmente la perméabilité apicale des anions HCO3^- et Cl- dans les CE bovines (Sun & Bonanno 2002; Li et al. 2008; Bonanno 2012). CLCA1 (calcium-activated Cl- channel-1, gène codant CLCA1) est situé dans la membrane apicale des CE. Son activation par l'ion Ca2+ intracellulaire augmente la perméabilité apicale de HCO3^- (Zhang et al. 2006; Bonanno 2012).

Les canaux potassiques sont souvent impliqués dans le potentiel de repos. Détecté par patch-clamp sur la membrane apicale des CE de lapin, Kv3.3 a été suggéré comme responsable du potentiel membranaire de repos de -50 à -60 mV de l'endothélium (Mergler & Pleyer 2007).

Parmi les canaux de sodium, ENaC (epithelial Na+ channel) détecté dans la membrane apicale est impliqué dans le transport de Na+ par les CEs. La densité de ces canaux augmente sous l'activité du SGK1 (serum glucocorticoid kinase) qui favorise également l'activité des pompes Na+/K+ATPase. Un autre canal de sodium a été détecté chez les CE bovines comme voltage-dépendant sensible au tetrodotoxin (TTX-VOCC) dont le rôle n'est pas encore bien clarifié (Mergler & Pleyer 2007).

Parmi les canaux calciques, les canaux VOCC type L (voltage operated calcium channel) ont été détectés comme voltage-dépendants par patch-clamp pour le transport de Ca2+. Ils sont partiellement activés au potentiel membranaire de repos, et sont sensibles aux facteurs de croissance EGF & endothelin-1 (ET-1). Il semble exister par ailleurs d'autres canaux calciques non voltage-dépendants.

D'autre part, la modulation des paramètres physiologiques de l'endothélium cornéen due aux changements de température est réduite par différents mécanismes de régulation des canaux et des transporteurs échangeurs permettant le maintien du niveau physiologique de Ca²⁺ intracellulaire. Les canaux TRP1-4 (transient receptor potentiel channel) activés par la variation de la température peuvent participer à la régularisation de l'homéostasie des cellules via le transport des ions Ca²⁺ et Mg²⁺ (Mergler et al. 2011).

Canal hydrique : la diffusion d'eau à travers la membrane est facilitée par des protéines transmembranaires de la famille des aquaporines. Seule l’AQP1 a été détectée

à la membrane apicale et basolatérale de CE bovine (Wen et al. 2001). AQP1 n'étant pas impliquée dans la sécrétion active d'eau, son rôle reste très controversé.

Transporteurs membranaires :

Les transporteurs sont des protéines transmembranaires possédant des sites de fixation de substrat. Le couplage avec son substrat spécifique induit le changement de sa conformation et le déplace dans le sens de son gradient. Les transporteurs peuvent être uniport, antiport (échangeur) ou symport (cotransporteur). L'expression de plusieurs transporteurs a été décrits dans les CEs.

NKCC1 & NKCC2 (Na⁺:K⁺:2Cl^- cotransporteur, gènes codant SLC12A2,

SLC12A1) (Diecke et al. 2005) sont situés sur la membrane basolatérale des CEs. Ils

contribuent à l'afflux de Na+, K+ et Cl-. Ils sont responsables de l'afflux de Cl- jusqu'à 40 mM dans les CE bovines et sont impliqués dans la régulation du volume cellulaire.

NBCe1 (Na+ bicarbonate cotransporter electrogenic, gène codant SLC4A4) (Bonanno et al. 1999; Li et al. 2005) existe sous deux variants, pNBCe1 et kNBCe1, mais seul pNBCe1 a été détecté sur la membrane basolatérale des CEs. Il est responsable de l'afflux de Na+ et de la perméabilité basolatérale de HCO3^-.

AE2 (anion exchanger, gène codant SLC4A2) est exprimé sur la membrane basolatérale desCEet est responsable de l'afflux de Cl- et de l'efflux de HCO3^- (Bonanno 2003).

NHE1 (Na+ H+ exchanger, gène codant SLC9A1) (Jentsch et al. 1985) est exprimé sur la membrane basolatérale desCEet est responsable de l'afflux de Na+ et de l'efflux de H+.

Les transporteurs MCTs (monocarboxylate transporter) (Nguyen & Bonanno 2011) sont responsables du flux de Lactate- et d’H+ du stroma cornéen vers la chambre antérieure. MCT1 (gène codant SLC16A1) exprimé sur la membrane basolatérale est responsable de l'afflux et MCT4 (gène codant SLC16A4) sur la membrane apicale est responsable de l'efflux de Lactate^- et H⁺

Pompe ionique : Il s'agit des complexes protéiques transmembranaires qui nécessitent l'énergie de l'hydrolyse de l'ATP pour le transport d’ions contre le gradient électrochimique. Dans les CEs, Na+/K+ATPase (Sodium-Potassium Adenosine

Triphosphatase, gènes codant ATP1A, ATP1B) (Geroski & Edelhauser 1984; Geroski et

al. 1985) est localisée sur la membrane basolatérale. Elle est responsable de l’afflux de

2 ions K+ pour l'export de 3 ions Na+.

Diffusion passive : Les gaz et les molécules hydrophobes ont une perméabilité élevée à travers la membrane bilipidique. Impliqués dans la conversion de HCO3^- + H+

<=> CO2, les enzymes catalyseurs anhydrase carbonique (CA) ont été identifiés dans les CEs. CAII facilite la formation de CO2 intracellulaire et CAIV joue un rôle tampon à la membrane apicale du côté chambre antérieure.

A partir de ces protéines transmembranaires, plusieurs modèles de couplages d'activité ont été suggérés pour la régulation du transport membranaire. Cette liste incomplète de canaux, de pompes et de transporteurs contribue à la compréhension du maintien de la transparence de la cornée.

Pour mettre en évidence la fonctionalité de ces protéines membranaires ainsi que la déturgescence de l'endothélium sur les greffons cornéens, certains outils d'évaluation ont été conçus comme la chambre de perfusion, la chambre d'Ussing ou récemment le bioréacteur breveté par le laboratoire BiiGC. La chambre de perfusion est constituée de deux compartiments séparés par l'épaisseur de cornée, ce qui permet d'observer l'activité de transport à travers la cornée et aussi le changement de la morphologie de la cornée (épaisseur, viabilité, etc.) durant cet activité (Maurice 1972). Basant sur le même principe, la chambre d'Ussing permet d'analyser l'activité de transport des monocouches de cellules en culture in vitro. L'isolation du pôle apical du pôle basal permet la formation d'une différence en voltage entre les 2 compartiments suite aux transports d'ions. Cette différence est détectable et quantifiable grâce à un système d'électrodes reliant les 2 compartiments (http://www.ussingchamber.com/). Le bioréacteur conçu au laboratoire BiiGC permet non seulement de polariser les cellules endothéliales par deux compartiments, mais aussi de maintenir la pression physiologique du côté endothélial, ce qui peut avoir un grand impact sur la fonctionalité de CE et d'autres tissus de la cornée.