Sélection du matériel cellulaire de départ

Le but est de sélectionner les populations cellulaires présentant de fortes capacités prolifératives résidelles afin d’optimiser le rendement et de limiter les variations possibles. Il a été régulièrement rapporté que les capacités prolifératives de l'endothélium cornéen étaient plus importantes à la périphérie plus qu'au centre et chez les donneurs jeunes plus que chez les donneurs âgés.

1.2.1. Âge de donneur

La plupart des études sont réalisées à partir des donneurs jeunes de moins de 30 ans (Wilson et al. 1995; Peh et al. 2011; Liu et al. 2012; Schmedt et al. 2012; Yokoi

et al. 2012; Peh et al. 2013). Les CEs provenant des donneurs âgés ont une

morphologie plus élargie que celles de donneurs jeunes, lorsqu’elles sont en culture in vitro dans un milieu contenant 10% de SVF (Liu et al. 2012) (Figure 70).

Figure 70. Culture in vitro de cellules endothéliales des donneurs de 15 jours, 55 ans et 70 ans en milieu DMEM 10% SVF (Liu et al. 2012)

Actuellement, selon les rapports annuels des banques de cornée (European Eye Bank Association, Eye Banks Association of America) , la moyenne d'âge des donneurs de cornée est de 61 ans (en 2011) en Europe et 59 ans (en 2012) aux Etats Unis. Aux Etats Unis, 83% des greffons proviennent des donneurs de 41-80 ans en 2012. Avec le

vieillissement de la population mondiale, le développement de la thérapie cellulaire à partir des cornées de donneurs âgés (> 50 ans) semble plus proche de la réalité. L'adaptation de la méthode de mise en culture de CEs à partir des donneurs âgés est détaillée dans l'article I de la Partie expérimentale.

1.2.2. Localisation centrale versus périphérique des cellules endothéliales de départ

La plus grande capacité proliférative des CEs périphériques par rapport aux CEs centrales, est un avantage pour la culture à long terme mais cette culture nécessite des conditions particulières. Nous avons en effet démontré récemment (Partie expérimentale - Article I) que, en milieu OptiMEM-I, les CEs périphériques sont moins différenciées et sont plus facilement soumises à la transition mésenchymateuse par rapport aux CEs du centre. En culture sans sérum, les CEs périphériques maintiennent une morphologie endothéliale typique et le taux de sénescence est moins important que les CE centrales (Figure 71).

Figure 71. Culture de cellules endothéliales (CE) centrales et périphériques en milieu contenant 8% de sérum de veau fœtal (SVF) et 0% de SVF. Les CE périphériques deviennent fibroblastiques après 14 jours de culture en milieu OptiMEM-I contenant 8% SVF (cornée entière provenant de donneur de 50 ans). En milieu sans sérum, les CE centrales et périphériques maintiennent leur morphologie endothéliale et leur expression protéique de Na+/K+ATPase (immunomarquage, cornées entières provenant de donneurs de 70 et 75 ans). Les CE périphériques expriment moins de marqueur de sénescence, SA-β-Gal, que les CE centrales. Barre d’échelle de 100µm (EA2521 BiiGC, Université Jean Monnet, Saint Etienne).

Cette étude suggère que les CEs périphériques provenant des cornées entières ou des collerettes résiduelles après trépanation chirurgicale peuvent être utilisée pour la thérapie cellulaire. L'utilisation de ces CEs nécessite de limiter le pourcentage de SVF

dans le milieu de culture pour ne pas induire les signaux de dédifférenciation. D'autre part, la conservation en OC dans du milieu commercial CorneaMax contient 2% de SVF pourrait être à l'origine de l'altération des CEs périphériques. Par conséquence, une courte durée d'OC pourrait mieux préserver les CEs périphériques. La durée maximale d’OC reste à évaluer.

Récemment, la ressemblance entre les CEs cornéennes et les cellules endothéliales trabéculaires a été analysé (Yu et al. 2011). L'existence des phénotypes de CS dans la zone de transition et dans le trabéculum suppose l'existence d'une source potentielle de renouvellement de l'endothélium cornéen. Ainsi, l'isolement des précurseurs est leur différenciation ou transdifférenciation en CE cornéennes est une voie potentielle.

1.2.3. Culture en sphère (sphere-forming assay)

A côté la sélection par l'âge du donneur et par la localisation, la culture en sphère est un autre moyen pour isoler les cellules "jeunes" via leurs capacités à générer des sphères de cellules en milieu de culture semi-solide. Cette méthode a été découverte par la formation de neursphère des cellules de la zone sous ventriculaire. Dans les années 1960, cette zone a été identifiée comme source de la neurogénèse en continue, dans laquelle se trouvent des cellules capables de se renouveler et de se différencier en 3 types cellulaires (neurone, astrocyte, oligodendrocyte) durant une longue période. En même temps, une autre équipe a découvert le comportement particulier de ces cellules in vitro. En effet, après leur mise en culture en milieu sans sérum contenant le facteur EGF, certaines cellules se divisent, adhèrent au support, puis se détachent pour former des sphères de cellules proliférantes. Une fois mises en culture induite à l'adhésion, ces cellules en sphères sont capables de se différencier en cellules neuronales et cellules gliales (Pastrana et al. 2011).

Par ce moyen, certaines études récentes ont tenté d'isoler les CE de la cornée en culture en sphère qui sont censées être des progéniteurs endothéliaux (Yokoo et al. 2005; Mimura et al. 2010; Bi et al. 2013) (Figure 72). Le milieu proposé est le DMEM/F12 contenant 20 ng/ml d'EGF et 40 ng/ml de bFGF. Ce milieu peut être supplémenté des cocktail comme B-27 ou N2. Il est rendu semi-solide par 1,5% de matrice de méthylcellulose pour favoriser la formation de sphère en suspension.

L'adhésion des cellules est limitée par le coating des surfaces de culture par la poly-2-hydroxyethyl methacrylate (poly-HEMA).

Formée à partir des cellules isolées seules, les sphères de CEs sont capables de reformer des monocouches en culture adhérente (Mimura et al. 2010). D'autre part, le traitement des sphères par 30µM de Rock-inhibitor Y-27632 pendant 1h avant la recolonisation en culture adhérente augmente l'expression d'ARNm des pompes Na⁺/K⁺ATPase des CE (Bi et al. 2013).

Figure 72. Formation de sphère de cellules endothéliale et recolonisation en culture adhérente (Mimura et al. 2010). (A) Formation de sphère à partir du 6ème passage d'une culture de CEs, donneur âgé de 43 ans, et recolonisation sur culture adhérente (progenies). (B) Culture d'un 5ème passage de culture en sphère sur membrane amniotique, donneur âgé de 39 ans. Immunomarquage de ZO-1 (rouge) et contre-coloration du noyau par Hoechst (bleu).

Par rapport à la culture adhérente, la culture en sphère permet de sélectioner les CEs directement par leur capacité proliférative. L'inconvénient de cette méthode est que la formation des sphères ne facilite pas l'évaluation morphologique des cellules

(fibroblastique ou en monocouche), et augmente ainsi le risque de contamination par d'autres types cellulaires.