Chapitre 4 : DISCUSSION
1.3.3 Transmission verticale
Encore appelée « transmission de la mère à l’enfant », elle a lieu essentiellement durant le dernier trimestre de la grossesse et surtout pendant l’accouchement et par voie d’allaitement maternel.
1.4- EVOLUTION CLINIQUE DE L’INFECTION À VIH [3 , 10]
Le début de l’infection est le plus souvent asymptomatique. Dans 10% des cas un syndrome mononucléosique survient 2 à 6 semaines après. Les principales manifestations cliniques qui témoignent d’une aggravation du déficit immunitaire sont : un amaigrissement très prononcé (supérieur à 10% du poids corporel), une asthénie sévère et prolongée, une diarrhée chronique et une fièvre au long cours, auxquelles peuvent s’ajouter entre autres des infections opportunistes ou des cancers.
1.5-DIAGNOSTIC DE L’INFECTION A VIH [4, 5, 10]
Chez les personnes infectées, l’antigénémie p24 peut précéder de plusieurs jours voire semaines l’apparition des anticorps. La séroconversion apparait en moins de 3 mois. Deux groupes d’examens servent à faire le diagnostic biologique de l’infection. Ce sont les examens indirects et les examens directs.
1.5.1- Examens indirects
Ces examens permettent de rechercher les anticorps anti VIH dans les prélèvements. Ils sont les plus couramment pratiqués, étant les plus faciles à réaliser. Après les tests de première génération dont les antigènes étaient des lysats de virus et qui occasionnaient ainsi plusieurs faux positifs, la qualité des tests s’est nettement améliorée jusqu’aux nouvelles générations qui utilisent comme antigènes des protéines recombinantes ou peptides synthétiques et dont les procédés sont mixtes pour la plupart, permettant ainsi de détecter à la fois la présence d’antigènes (p24 essentiellement) et d’anticorps dans les prélèvements. La fenêtre sérologique se trouve ainsi considérablement réduite, ce qui constitue un avantage pour la sécurité transfusionnelle.
1.5.1.1- Tests rapides
Les tests rapides sont basés sur la migration du sérum testé sur une bande de nitrocellulose sur laquelle ont été préalablement fixés des antigènes du virus. Ladite migration entraine des réactions spécifiques manifestées par des bandes colorées qui traduisent une réaction positive. Une réaction témoin est toujours prévue pour la validation ou non du test.
Les tests rapides ont connu des améliorations de principe avec l’apparition d’un test rapide capable de détecter à la fois les antigènes P24 présents éventuellement dans le sérum et les anticorps anti-VIH.
1.5.1.2- Méthodes Immunoenzymatiques ou “ELISA”
Leur principe consiste à faire réagir les anticorps spécifiques du sérum contaminé avec les antigènes du VIH fixés au fond des cupules par le fabricant. Une enzyme présente dans le milieu réactionnel révèle la réaction antigène-anticorps par l’apparition d’une coloration.
1.5.1.3- Méthodes d’immuno-blotting”
Ce sont également des réactions Ag-Ac réalisées à partir d’antigènes viraux purifiés, séparés par électrophorèse et fixés sur des supports de nitrocellulose qui servent de phase solide à la réaction.
Les bandelettes sont ensuite incubées avec des échantillons de sérum ou de plasma. Les anticorps anti-VIH éventuellement présents dans l’échantillon vont se fixer aux antigènes viraux. Les réactions antigènes-anticorps donnent alors lieu à des réactions spécifiques traduites par des bandes transversales colorées, aux différents niveaux de fixation des particules antigéniques sur la bande réactionnelle (protéines ou glycoprotéines du VIH).
Compte tenu de leur spécificité, les méthodes d’immuno-blotting sont considérées comme des méthodes de référence.
1.5.2- Examens directs
1.5.2.1- La recherche du virus
La mise en évidence du virus peut se faire par microscopie électronique. La culture est également possible sur des cellules en lignée continue. Cette recherche peut se faire à partir du sang, des ganglions, etc... Elle nécessite un laboratoire très performant, bien équipé, avec toutes les précautions d’usage prises tant vis-à-vis du personnel qui travaille sur ce matériel potentiellement dangereux, que vis-à-vis des cultures cellulaires elles-mêmes dont on connaît la grande fragilité et la sensibilité aux contaminations bactériennes ou mycosiques.
1.5.2.2- La recherche de l’ADN pro-viral ou technique de plymerase-chaine-reaction « P.C.R.)
Le test PCR est une méthode de biologie moléculaire d’amplification ciblée in vitro. Les fabricants de réactifs conçoivent de petites séquences d’acides nucléiques viraux « primers » qui servent d’amorces pour l’amplification du matériel génétique viral présent dans les prélèvements contaminés.
La PCR se fait en trois étapes qui sont successivement l’extraction de l’ADN pro-viral, l’amplification des fragments cibles de l’ADN pro-viral et la révélation de la réaction par migration sur gel d’agarose.
1.5.3- Algorithme de diagnostic
Le diagnostic biologique de l’infection à VIH se fait par l’utilisation de 2 tests au moins de principes différents, le second n’étant réalisé que si le premier est positif. Le premier test doit être le plus sensible, le second le plus spécifique et discriminant entre les 2 virus VIH1 et VIH 2.
Le premier test ou « test de dépistage » ne peut se réaliser qu’après un conseil pré-test qui vise à obtenir un consentement éclairé du candidat au test d’une part, et partager avec lui les informations essentielles sur la maladie et les possibilités de prise en charge d’autre part. Le sujet testé ne peut être déclaré positif que si les deux tests sont positifs. En cas de discordance entre les deux résultats, il est conseillé de refaire le test après une période de 4 semaines au moins, le temps de faire évoluer la concentration d’anticorps au cas où l’individu serait en séroconversion.
Dans le cas particulier de la transfusion sanguine, seul le premier test est réalisé, celui le plus sensible [15, 16, 35]. La poche de sang est éliminée dès que ce premier test est positif. La confirmation avec un second test est inutile, l’objectif étant d’écarter le maximum de poches de sang susceptibles d’être porteuses des marqueurs du VIH, même s’il s’agit de faux positifs.
La suite de la procédure en cas de test positif chez un donneur de sang prévoit que le donneur soit invité à faire une sérologie classique de diagnostic en vue de tirer une conclusion quant à sa sérologie VIH. Le conseil pré-test est donc omis au moment de la sélection médicale des donneurs de sang, étant donné que tout donneur de sang donne son accord tacite au centre de transfusion pour tous les tests susceptibles d’écarter son sang en cas de positivité à un marqueur.
Chapitre 2 : CADRE, MATERIEL ET METHODES
2.1- Cadre d’étude
L’ANTS est située provisoirement dans un immeuble situé près du carrefour de l’Etoile Rouge à Cotonou. La qualification biologique des poches de sang est réalisée dans les laboratoires du Centre Départemental de Transfusion Sanguine de l’Atlantique/Littoral (CDTS AL) situé dans l’enceinte du CNHU à Cotonou. Le CDTS AL comporte plusieurs unités de fonctionnement à savoir :
Un poste fixe de prélèvement du sang avec des structures d’accueil et de collation ;
Un laboratoire de sérologie, notre site d’étude ;
Un service de distribution du sang et ses dérivés.
Un service administratif
En dehors des prélèvements effectués au poste fixe, le CDTS AL dispose d’une équipe mobile chargée de prélever les donneurs de sang dans les unités de productions, les établissements scolaires etc.…
2.2- Matériel
Dans le cadre de cette étude nous avons utilisé notamment le matériel ci-après désigné :
2.2.1- Matériel de collecte de données
Afin d’atteindre le premier objectif de notre étude basé sur les réactifs utilisés dans les 3 PTS inclus nous avons élaboré une fiche de collecte de données présentée (annexe1).
Elle a permis de recueillir les informations sur les réactifs utilisés durant toute l’année 2013 (donc depuis 1 an environ) ainsi que les noms des laboratoires fabricants et l’information sur l’enregistrement ou non desdits réactifs au ministère de la santé.
Cette dernière information a été utilisée pour savoir dans quelle mesure le PTS utilise les réactifs enregistrés au ministère de la santé, ainsi que l’exige la réglementation autorisant l’utilisation des réactifs dans les centres de transfusion sanguine.
2.2.2- Equipement de laboratoire
Les équipements essentiels et les principaux consommables que nous avons utilisés sont listés ci-après
- Centrifugeuse de table
- Chaine ELISA (lecteur + imprimante, laveur, incubateur) - Automate ARCHITECT
- Distillateur d’eau
- Tubes secs à usage unique
- Microtubes plastiques type « Eppendorf » - Gants à usage unique
- Micropipettes et cônes jetables
2.2.3- Réactifs de laboratoire
GENSCREEN ULTRA HIV Ag-Ab
ELISA HIV Ag/Ab Combo 2.3- Méthode
2.3.1- Type d’étude
Cette étude est prospective et transversale. Elle a porté sur la qualification biologique des poches de sang prélevées chez les donneurs des PTS de Comé, Gohomey et Klouekamey.
2.3.2- Population d’étude 2.3.2.1- Critères d’inclusion
Ont été inclus dans l’étude tous les donneurs reçus aux PTS de Comé, Gohomey et Klouekamey pendant la période d’étude.
2.3.2.2 - Taille de l’échantillon
Nous nous sommes limité à un échantillon de 180 donneurs, correspondant à la quantité de réactif que nous avons pu acquérir.
Les sérums des donneurs ont été inclus au fur et à mesure de leur récolte jusqu’à l’obtention des 180 prélèvements.
2.3.2.3- Variables recueillies
Les variables que nous avons recueillies sont :
- Les résultats de la sérologie VIH effectuée à l’aide des tests rapides par les personnels des 3 PTS ;
- Les résultats des tests ELISA VIH effectués sur les mêmes échantillons par nous-mêmes;
- L’âge et le sexe de chacun des donneurs inclus.
2.3.3- Organisation de la collecte des données
Elle s’est déroulée au cours de notre séjour dans les sites retenus et a connu les phases ci-après :
2.3.3.1- Phase de pré-collecte
Elle a permis d’obtenir les autorisations administratives requises, d’acquérir le matériel, les réactifs et de finaliser le protocole et ses annexes.
2.3.3.2- Phase de collecte
Cette phase correspond à la période au cours de laquelle nous avons recueilli les échantillons dans les PTS au fur et à mesure des prélèvements des donneurs de sang. Nous avons ainsi recueilli un total de 180 échantillons de sang correspondant à la quantité de réactif ELISA que nous avons pu acheter.
2.3.4- Procédures biologiques 2.3.4.1. Prélèvements sanguins
Pendant la période de collecte, le sang a été recueilli dans 2 tubes portant les mêmes identifications, un pour le PTS et l’autre pour l’étude. Les tubes ont été ensuite centrifugés à 3000 tours par minute pendant 5 minutes. Les sérums destinés à l’étude ont été mis en aliquots de 1,5 à 2 mL dans des tubes Eppendorf.
2.3.4.2. Conservation et transport des spécimens
Les aliquots ont été congelés dans les congélateurs des PTS entre -20 et -30°C jusqu’à leur acheminement vers le laboratoire de l’ANTS. Leur transport s’est effectué dans des glacières avec des accumulateurs de froid surgelés.
2.3.4.3. Manipulation des spécimens au laboratoire
Les spécimens ont été décongelés puis ramenés à la température ambiante avant d’être analysés. Les résultats du test rapide DETERMINE utilisé par les 3 PTS ont été contrôlés à l’aide du réactif GENSCREEN ULTRA HIV Ag-Ab, un test ELISA destiné au dépistage simultané de l’Ag p24 et des anticorps anti 1 et VIH-2.
Les échantillons discordants par rapport aux résultats des PTS ont été ensuite analysés avec le réactif ELISA HIV Ag/Ab Combo, un autre test ELISA utilisé quant à lui à l’aide de l’automate ARCHITECT mis au point par le laboratoire ABBOTT. Ainsi, notre méthode de référence était constituée par un ou 2 tests ELISA selon le cas, dont l’un par une méthode automatisée.
2.3.5- Principes des tests
Le réactif DETERMINE est un test immuno-chromatographique destiné à la détection qualitative des anticorps anti 1 et VIH-2. L’échantillon migre vers le conjugué qui est fait de sélénium-Ag et se mélange à ce dernier. Le mélange continue la migration et s’ajoute aux antigènes recombinants et peptides synthétiques fixés en un autre point de la phase solide. La présence d’anticorps anti-VIH dans le sérum engendre alors une réaction avec les antigènes, d’où la formation d’une ligne rouge dans la fenêtre de lecture. Une barre de contrôle est prévue dans une autre fenêtre de lecture pour témoigner de la validité du test.
Notre réactif de contrôle GENSREEN ULTRA HIV Ag-Ab est un test immuno-enzymatique, mixte, de type sandwich, capable de détecter à la fois l’Ag p24 du VIH-1 et les anticorps anti VIH-1 et VIH-2. L’Ag p24 d’un échantillon positif est pris en sandwich entre les anticorps de la phase solide (microplaque en polystyrène) et ceux du conjugué1, tandis que les anticorps anti VIH-1 et/ou anti VIH-2 sont pris également en sandwich entre les Ag de la phase solide et ceux du conjugué 2.
Le réactif ELISA HIV Ag/Ab Combo a été utilisé à l’aide de l’automate ARCHITECT. Des anticorps anti p24 et des antigènes de VIH1 et de VIH2 sont adsorbés sur des plaques de microtitration en polystyrène servant de phase solide pour ce réactif. Il permet de détecter la présence de l’antigène p24 et celle des anticorps anti VIH1 et/ou VIH2 dans les prélèvements analysés.
2.3.6- Traitement et analyses des données
Les données ont été saisies dans un logiciel Excel puis transférées sur Epi Info. Nous avons ensuite procédé à l’évaluation des performances du test rapide DETERMINE utilisé par les 3 PTS en utilisant essentiellement les tableaux des contingences.
Tableau I : Tableau des contingences utilisé pour calculer les Valeur prédictive négative = VN/(FN+VN)
2.3.7- Considérations éthiques et réglementaires
Aucun contact n’a été établi avec les donneurs de sang. Nous avons utilisé les échantillons selon les normes réglementaires en matière de qualification biologique des poches de sang. Par ailleurs, nos résultats ont servi uniquement à rédiger notre mémoire de fin de formation. Ils n’ont pas été communiqués aux donneurs de sang. Ce rôle incombe en effet aux PTS.
Nous déclarons enfin que nous n’avons aucun conflit d’intérêt dans le cadre de la présente étude.
2.3.8- Difficultés rencontrées
Dans le cadre de ce travail, les difficultés rencontrées sont de deux ordres à savoir :
2.3.8.1. Difficultés liées à la collecte
Etant donné que 3 PTS ont servi de sites pour la réalisation de l’étude, nous nous sommes déplacés d’un PTS à l’autre durant la période d’étude, ce qui rendait impossible la collecte par nous-mêmes de tous les échantillons inclus. Ainsi, pendant notre présence dans un PTS, les personnels des 2 autres PTS nous aidaient à récolter les prélèvements des donneurs reçus.
2.3.8.2. Difficultés liées à l’acquisition des réactifs
Nous avons passé plusieurs semaines à réunir les fonds nécessaires à l’achat des réactifs que nous avons utilisés pour le contrôle de qualité des résultats des 3 PTS inclus dans notre étude. C’est ainsi qu’un délai de 4 mois s’est écoulé entre la fin de la collecte des échantillons et la période des analyses. Ces contraintes financières ont ainsi limité grandement la taille de notre série.
Chapitre 3: RESULTATS
Nous avons enregistré 2 résultats discordants par rapport aux tests ELISA utilisés comme gold standard. Ces résultats étant inexploitables, nous les avons éliminés de la série des 180 donneurs prélevés. Le nombre de résultats pris en compte est donc de 178 au total. Ces 178 résultats étant tous négatifs au test rapide DETERMINE dont nous avons évalué les performances, une mesure d’association ne peut pas être faite avec les résultats des tests ELISA. Il n’est donc pas possible d’infirmer ni de confirmer notre hypothèse. Nous nous sommes alors limité à calculer les performances du test DETERMINE utilisé par les 3 PTS inclus.
3.1- Caractéristiques de la population étudiée
Les caractéristiques de la population totale étudiée au niveau des 3 PTS se présentent comme suit
3.1.1- Répartition des donneurs par PTS
Tableau II :Répartition des donneurs testés par PTS
PTS Nbre de donneurs Fréquence (%)
Comé 51 28.66
Gohomey 65 36.51
Klouekamey 62 34.83
Total 178 100.00
Le PTS de Gohomey a reçu le plus grand nombre de donneurs de sang pendant la période de notre étude, suivi respectivement par les PTS de Klouekamey et de Comé.
3.1.2- Répartition selon le sexe
Tableau III :Répartition des donneurs testés en fonction du sexe Sexe Effectif Fréquence (%)
F 25 14.04
M 153 85.96
Total 178 100.00
Notre échantillon comportait 25 femmes contre 153 hommes, soit un sex ratio de 6,1 en faveur des hommes.
3.1.3- Répartition selon l’âge
Tableau IV :Répartition des donneurs testés en fonction de l’âge
La moyenne d’âge est de 22 ans, avec des limites extrêmes de 14 ans et 56 ans. La médiane est de 40 ans et le mode est de 19 ans.
Age (ans) Effectif Fréquence (%)
14-18 38 21
19-23 103 58
24-28 12 07
29-33 14 08
34-38 7 04
39-43 2 01
44-48 1 01
49-53 0 00
54-58 1 01
Total 178 100
3.2- Résultats de la sérologie
3.2.1- Numéros de lots et dates de péremption des coffrets de réactifs utilisés
Les coffrets de DETERMINE utilisés par les PTS portaient les indications ci-après :
Tableau V : Numéros de lots et dates de péremption des coffrets de Determine utilisés par les PTS.
PTS Numéros
de lots
Dates de péremption
Comé 44335k100 02-11-2013
Gohomey 44335k100 02-11-2013
Klouekamey 44335k100 02-11-2013
Les coffrets du réactif GENSCREEN ULTRA HIV ½ et ceux du réactif ELISA HIV Ag/Ab Combo que nous avons utilisés portaient les indications ci-après :
Tableau VI : Numéros de lots et dates de péremption des coffrets ELISA.
Reactif Numéros de lots Dates de
péremption GENSCREEN ULTRA HIV ½ 3E0083 30-10-2014 ELISA HIV Ag/Ab Combo 24433L100 12-12-2013
3.2.2- Performances des tests par rapport à l’ensemble des résultats
Les tableaux VII, VIII et IX présentent l’ensemble des résultats obtenus dans les 3 PTS.
Tableau VII : Résultats du réactif DETERMINE
Réactifs RESULTATS PTS Les 3 PTS
DETERMINE
Gohomey Klouekamey Comé
POSITIFS 0 0 0 0
Négatifs 65 62 51 178
TOTAL 65 62 51 178
Tableau VIII : Résultats du réactif GENSCREEN ULTRA HIV 1/2
Réactifs RESULTATS PTS Les 3 PTS
GENSCREEN
Gohomey Klouekamey Comé
POSITIFS 0 1 0 0
Négatifs 65 61 51 178
TOTAL 65 62 51 178
Tableau IX: Tableau des contingences des résultats du test rapide et de la méthode de référence
Gold Standard (Genscreen ± ARCHITECT) Positifs Négatifs Total
Test Rapide (Determine)
Positifs 0 0 0
Négatifs 1 177 178
Total 1 177 178
Les résultats globaux de notre étude se présentent comme suit : - Taux de séropositivité pour l’ensemble des PTS : 1/178= 0,6%
- Spécificité du réactif DETERMINE: 177/177 = 100%
- Valeur prédictive négative : 177/1+177=99,4%
Les autres paramètres de performance ne peuvent être calculés eu égard aux résultats négatifs pour les 178 sérums analysés.
3.2.3- Résultats du réactif DETERMINE par rapport à chaque PTS
3.3.3.1- PTS de Comé
Un résultat positif a été obtenu au GENSCREEN et non confirmé par la méthode automatisée. Ce résultat discordant ne peut donc être pris en compte et aucun paramètre de performance du DETERMINE ne peut être calculé pour ce PTS, tous les résultats étant négatifs aussi bien pour le test rapide que pour les tests de référence.
3.3.3.2- PTS de Gohomey
Un résultat positif a été obtenu au GENSCREEN et non confirmé par la méthode automatisée. Ce résultat discordant ne peut donc être pris en compte et aucun paramètre de performance du DETERMINE ne peut être calculé pour ce PTS, tous les résultats étant négatifs aussi bien pour le test rapide que pour les tests de référence.
3.3.3.3- PTS de Klouekamey
Un résultat positif a été obtenu à la fois avec les deux réactifs ELISA. Le résultat de cet échantillon était par contre négatif au DETERMINE. Il s’agissait donc d’un faux négatif ; d’où les paramètres de performance du réactif DETERMINE au niveau du PTS de Klouekamey sont :
- Spécificité = 61/61= 100%
- VPN = 61/62 = 98,4%
Chapitre 4 : DISCUSSION
Le plus jeune des donneurs inclus est âgé de 14 ans. La limite inférieure pour le don du sang au Bénin est de 18 ans avec une possibilité de don sur autorisation parentale lorsque l’âge est inférieur à 18 ans. Néanmoins l’âge de 14 ans nous parait être de loin inférieur à la limite acceptable, étant donné qu’il s’agit encore d’un adolescent. Il convient de prendre en compte cette information importante afin d’éviter une répétition de cette pratique inédite dans la sélection des donneurs par rapport à l’âge.
Précisons néanmoins qu’il nous est revenu que dans la région du donneur en question, plusieurs cas de « dispenses d’âge », c’est-à-dire des réductions d’âge, seraient pratiquées par les parents en vue de faire accepter leurs enfants à l’occasion de la première inscription dans une école. Serait-ce le cas ?
Notre série compte 14% de femmes, ce qui témoigne d’un niveau
Notre série compte 14% de femmes, ce qui témoigne d’un niveau