2.1- Cadre d’étude
L’ANTS est située provisoirement dans un immeuble situé près du carrefour de l’Etoile Rouge à Cotonou. La qualification biologique des poches de sang est réalisée dans les laboratoires du Centre Départemental de Transfusion Sanguine de l’Atlantique/Littoral (CDTS AL) situé dans l’enceinte du CNHU à Cotonou. Le CDTS AL comporte plusieurs unités de fonctionnement à savoir :
Un poste fixe de prélèvement du sang avec des structures d’accueil et de collation ;
Un laboratoire de sérologie, notre site d’étude ;
Un service de distribution du sang et ses dérivés.
Un service administratif
En dehors des prélèvements effectués au poste fixe, le CDTS AL dispose d’une équipe mobile chargée de prélever les donneurs de sang dans les unités de productions, les établissements scolaires etc.…
2.2- Matériel
Dans le cadre de cette étude nous avons utilisé notamment le matériel ci-après désigné :
2.2.1- Matériel de collecte de données
Afin d’atteindre le premier objectif de notre étude basé sur les réactifs utilisés dans les 3 PTS inclus nous avons élaboré une fiche de collecte de données présentée (annexe1).
Elle a permis de recueillir les informations sur les réactifs utilisés durant toute l’année 2013 (donc depuis 1 an environ) ainsi que les noms des laboratoires fabricants et l’information sur l’enregistrement ou non desdits réactifs au ministère de la santé.
Cette dernière information a été utilisée pour savoir dans quelle mesure le PTS utilise les réactifs enregistrés au ministère de la santé, ainsi que l’exige la réglementation autorisant l’utilisation des réactifs dans les centres de transfusion sanguine.
2.2.2- Equipement de laboratoire
Les équipements essentiels et les principaux consommables que nous avons utilisés sont listés ci-après
- Centrifugeuse de table
- Chaine ELISA (lecteur + imprimante, laveur, incubateur) - Automate ARCHITECT
- Distillateur d’eau
- Tubes secs à usage unique
- Microtubes plastiques type « Eppendorf » - Gants à usage unique
- Micropipettes et cônes jetables
2.2.3- Réactifs de laboratoire
GENSCREEN ULTRA HIV Ag-Ab
ELISA HIV Ag/Ab Combo 2.3- Méthode
2.3.1- Type d’étude
Cette étude est prospective et transversale. Elle a porté sur la qualification biologique des poches de sang prélevées chez les donneurs des PTS de Comé, Gohomey et Klouekamey.
2.3.2- Population d’étude 2.3.2.1- Critères d’inclusion
Ont été inclus dans l’étude tous les donneurs reçus aux PTS de Comé, Gohomey et Klouekamey pendant la période d’étude.
2.3.2.2 - Taille de l’échantillon
Nous nous sommes limité à un échantillon de 180 donneurs, correspondant à la quantité de réactif que nous avons pu acquérir.
Les sérums des donneurs ont été inclus au fur et à mesure de leur récolte jusqu’à l’obtention des 180 prélèvements.
2.3.2.3- Variables recueillies
Les variables que nous avons recueillies sont :
- Les résultats de la sérologie VIH effectuée à l’aide des tests rapides par les personnels des 3 PTS ;
- Les résultats des tests ELISA VIH effectués sur les mêmes échantillons par nous-mêmes;
- L’âge et le sexe de chacun des donneurs inclus.
2.3.3- Organisation de la collecte des données
Elle s’est déroulée au cours de notre séjour dans les sites retenus et a connu les phases ci-après :
2.3.3.1- Phase de pré-collecte
Elle a permis d’obtenir les autorisations administratives requises, d’acquérir le matériel, les réactifs et de finaliser le protocole et ses annexes.
2.3.3.2- Phase de collecte
Cette phase correspond à la période au cours de laquelle nous avons recueilli les échantillons dans les PTS au fur et à mesure des prélèvements des donneurs de sang. Nous avons ainsi recueilli un total de 180 échantillons de sang correspondant à la quantité de réactif ELISA que nous avons pu acheter.
2.3.4- Procédures biologiques 2.3.4.1. Prélèvements sanguins
Pendant la période de collecte, le sang a été recueilli dans 2 tubes portant les mêmes identifications, un pour le PTS et l’autre pour l’étude. Les tubes ont été ensuite centrifugés à 3000 tours par minute pendant 5 minutes. Les sérums destinés à l’étude ont été mis en aliquots de 1,5 à 2 mL dans des tubes Eppendorf.
2.3.4.2. Conservation et transport des spécimens
Les aliquots ont été congelés dans les congélateurs des PTS entre -20 et -30°C jusqu’à leur acheminement vers le laboratoire de l’ANTS. Leur transport s’est effectué dans des glacières avec des accumulateurs de froid surgelés.
2.3.4.3. Manipulation des spécimens au laboratoire
Les spécimens ont été décongelés puis ramenés à la température ambiante avant d’être analysés. Les résultats du test rapide DETERMINE utilisé par les 3 PTS ont été contrôlés à l’aide du réactif GENSCREEN ULTRA HIV Ag-Ab, un test ELISA destiné au dépistage simultané de l’Ag p24 et des anticorps anti 1 et VIH-2.
Les échantillons discordants par rapport aux résultats des PTS ont été ensuite analysés avec le réactif ELISA HIV Ag/Ab Combo, un autre test ELISA utilisé quant à lui à l’aide de l’automate ARCHITECT mis au point par le laboratoire ABBOTT. Ainsi, notre méthode de référence était constituée par un ou 2 tests ELISA selon le cas, dont l’un par une méthode automatisée.
2.3.5- Principes des tests
Le réactif DETERMINE est un test immuno-chromatographique destiné à la détection qualitative des anticorps anti 1 et VIH-2. L’échantillon migre vers le conjugué qui est fait de sélénium-Ag et se mélange à ce dernier. Le mélange continue la migration et s’ajoute aux antigènes recombinants et peptides synthétiques fixés en un autre point de la phase solide. La présence d’anticorps anti-VIH dans le sérum engendre alors une réaction avec les antigènes, d’où la formation d’une ligne rouge dans la fenêtre de lecture. Une barre de contrôle est prévue dans une autre fenêtre de lecture pour témoigner de la validité du test.
Notre réactif de contrôle GENSREEN ULTRA HIV Ag-Ab est un test immuno-enzymatique, mixte, de type sandwich, capable de détecter à la fois l’Ag p24 du VIH-1 et les anticorps anti VIH-1 et VIH-2. L’Ag p24 d’un échantillon positif est pris en sandwich entre les anticorps de la phase solide (microplaque en polystyrène) et ceux du conjugué1, tandis que les anticorps anti VIH-1 et/ou anti VIH-2 sont pris également en sandwich entre les Ag de la phase solide et ceux du conjugué 2.
Le réactif ELISA HIV Ag/Ab Combo a été utilisé à l’aide de l’automate ARCHITECT. Des anticorps anti p24 et des antigènes de VIH1 et de VIH2 sont adsorbés sur des plaques de microtitration en polystyrène servant de phase solide pour ce réactif. Il permet de détecter la présence de l’antigène p24 et celle des anticorps anti VIH1 et/ou VIH2 dans les prélèvements analysés.
2.3.6- Traitement et analyses des données
Les données ont été saisies dans un logiciel Excel puis transférées sur Epi Info. Nous avons ensuite procédé à l’évaluation des performances du test rapide DETERMINE utilisé par les 3 PTS en utilisant essentiellement les tableaux des contingences.
Tableau I : Tableau des contingences utilisé pour calculer les Valeur prédictive négative = VN/(FN+VN)
2.3.7- Considérations éthiques et réglementaires
Aucun contact n’a été établi avec les donneurs de sang. Nous avons utilisé les échantillons selon les normes réglementaires en matière de qualification biologique des poches de sang. Par ailleurs, nos résultats ont servi uniquement à rédiger notre mémoire de fin de formation. Ils n’ont pas été communiqués aux donneurs de sang. Ce rôle incombe en effet aux PTS.
Nous déclarons enfin que nous n’avons aucun conflit d’intérêt dans le cadre de la présente étude.
2.3.8- Difficultés rencontrées
Dans le cadre de ce travail, les difficultés rencontrées sont de deux ordres à savoir :
2.3.8.1. Difficultés liées à la collecte
Etant donné que 3 PTS ont servi de sites pour la réalisation de l’étude, nous nous sommes déplacés d’un PTS à l’autre durant la période d’étude, ce qui rendait impossible la collecte par nous-mêmes de tous les échantillons inclus. Ainsi, pendant notre présence dans un PTS, les personnels des 2 autres PTS nous aidaient à récolter les prélèvements des donneurs reçus.
2.3.8.2. Difficultés liées à l’acquisition des réactifs
Nous avons passé plusieurs semaines à réunir les fonds nécessaires à l’achat des réactifs que nous avons utilisés pour le contrôle de qualité des résultats des 3 PTS inclus dans notre étude. C’est ainsi qu’un délai de 4 mois s’est écoulé entre la fin de la collecte des échantillons et la période des analyses. Ces contraintes financières ont ainsi limité grandement la taille de notre série.