Na última década existiu um interesse crescente em utilizar as micro-ITIES, também pela sua velocidade de transferência iónica, que se verificou ser bastante rápida80, para a monitorização de reacções enzimáticas e, consequentemente, para a construção de biossensores amperométricos70.
Aproveitando as vantagens das micro-ITIES gelificadas suportadas em microorifícios, juntamente com as características de selectividade e especificidade atribuídas pela utilização da GOx, torna-se possível determinar a concentração de glucose em solução. A utilização das ITIES na determinação da glucose pode parecer numa primeira análise uma tarefa impossível, dado que a molécula de glucose é uma espécie neutra e um sistema de detecção baseado nas ITIES baseia-se na transferência de espécies carregadas através da interfaces líquido-líquido. Todavia a utilização da GOx permite uma decomposição enzimática da glucose gerando, além de outros, ácido glucónico como produto da reacção. Torna-se então possível acompanhar a formação deste pela transferência assistida do protão através da interface gelificada água|o-NPOE, utilizando como ligando na fase orgânica o PDT, ocorrendo como resultado um sinal amperométrico, proporcional à quantidade de glucose, possível de ser acompanhado por voltametria cíclica. A figura 1.24 esquematiza o processo descrito, evidenciando a zona preferencial de adsorção da GOx.
Figura 1.24. Representação esquemática do princípio de funcionamento do biossensor.
1.4.1. Detecção da D(+)glucose
A utilização das ITIES como eléctrodo selectivo de iões (ESI) amperométrico71 temse vulgarizado pelas características já evidenciadas em pontos anteriores. Este processo, baseado na transferência de espécies iónicas, não permite a monitorização de espécies neutras, como a glucose, através da interface. Como referido anteriormente, na constituição de um biossensor, existente dois aspectos fundamentais para o seu funcionamento: o biocatalisador e o transductor. A presença da GOx tornase imprescindível para o funcionamento do biossensor. Também para se estabelecer a utilização das microITIES como um transdutor da glucose a presença do PDT, como agente complexante, representa uma outra variável a dimensionar. Convém referir que a ausência de um destes factores, impede o funcionamento do biossensor. Trabalho realizado neste grupo de investigação72, relativamente a estes aspectos, demonstrou que, quando estão presentes a GOx e o PDT se verifica um aumento da intensidade de corrente, com um aumento da concentração da glucose, a potenciais mais positivos. Este aumento da intensidade de corrente corresponde à transferência assistida do H+ pelo PDT da fase aquosa para a fase orgânica através da microinterface.
■ ausência de pDglucose 2.0x10"" • pDglucose 4 mM . V 1.5x10"° • ■ 1 . " . 1.0x10"" • ■ • 5.0x10"" 0.0 . * ■ . 5.0x10"4 ^ ■ ■% ■■■■ • • • • ■ ■ •s * . . . . . " 1.0x10* t m <«* 800 700 600 500 400 300 200 100 0 E/mV
Figura 1.25. Voltamograma cíclico da determinação da glucose, descrito pela célula electroquímica I apresentada na figura 1.21.
Verificase que o pico formado a potenciais mais positivos, correspondente à transferência do protão da fase aquosa para o gel orgânico, confirmando a possibilidade
de utilização da voltametria cíclica no acompanhamento da reacção catalítica. Verificase também que a transferência iónica ocorre num intervalo de potencial entre 0.3 e 0.1 V, o que se torna uma grande vantagem, pois assim eliminamse algumas interferências devidas à oxidação de espécies electroactivas a potenciais próximos de +0.7 V vs. Ag/AgCI73, que ocorre em outros biossensores para a determinação da glucose que se
baseiam na detecção amperométrica de um outro produto da reacção enzimática, o peróxido de hidrogénio. Esta temática das interferências encontrase desenvolvida de uma forma mais extensiva no capítulo seguinte.
Subtraindo os valores da intensidade de corrente da linha de base aos valores de intensidade de corrente obtidos pela adição de D(+)glucose voltamogramas, obtémse os valores de intensidade de corrente correspondentes à adição de D(+)glucose. Na figura 1.26, encontramse representados os voltamogramas cíclicos, com correcção da linha de base, para diferentes concentrações de D(+)glucose. Também é apresentada no canto inferior direito da figura a curva amperométrica que descreve a resposta amperométrica da célula electroquímica perante a transferência assistida do catião hidrogénio resultante da adição de pglucose. O comportamento que a curva apresenta é característico das respostas amperométricas limitadas pela cinética de reacções enzimáticas.
1,6x10* 1,2x10"" 8,0x10"" 4,0x10""- < ^ 0,0- 4,0x10"° 8,0x10""" 1,2x10* -1,6x10""- -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 E / V
Figura 1.26. Voltamogramas cíclicos determinados na presença de 1.5 inM ( ), 2.4 mM ( ) e 3.8mJM ( ) de D(+)glucose, com correcção da linha de base. No canto inferior direito encontrase representada a respectiva curva de calibração.
.1,5x108- . •• • ' • • . 1,2x10 e- • 9,0x10 a- 6,0x10"" ■' 3,0x10'9- t 0,0 ■ 10 |D(+)Glucose| / mM 3 3
Considerando que os processos de convecçâo e migração se encontram controlados, quer peia ausência de agitação nas medições quer pela existência de electrólito de suporte, sendo portanto o transporte de massa controlado por difusão, é possível concluir que o valor de intensidade de corrente obtido na determinação amperométrica se deve essencialmente ao transporte de H+ através da microinterface.
A figura 1.27 apresenta a curva de calibração formada pela média de quatro determinações experimentais, com o respectivo desvio de padrão.
2.0X10"8 1.5x10""- ^1.0x10"*- 5.0x10' 0.0. Ò 2 4 6 8 10 |D(+)-glucose| / mM
Figura 1.27. Curva de calibração para a determinação da glucose e desvio de padrão associado, obtida a partir de quatro determinações experimentais a um potencial de -0.010 V.
Analisando a curva facilmente se distinguem duas regiões: a de aumento linear com a concentração de glucose e a de comportamento aproximadamente constante. Este comportamento é característico dos eléctrodos enzimáticos, cujo modelo matemático simplificado se pode representar esquematicamente como na figura 1.28:
i ï
ï Ï
I
Camada Camada
enzimática difusão Solução ; c C3oluç*o
C=0 __^/\ c = c1
Figura 1.28. Modelo esquemático do comportamento de eléctrodos enzimáticos.
Este simples modelo permite explicar o comportamento da intensidade de corrente de eléctrodos enzimáticos com uma camada enzimática imobilizada na superfície. Este é válido para uma camada uniformemente distribuída pela superfície e para um excesso de substrato74:
A partir da utilização das transformadas de Laplace e posterior derivação para as condições fronteira da segunda Lei de Fick da difusão, dada na pela equação 1.14: