Transfert de la méthode HPLC

4.1.1.1. Méthode de référence

La méthode d’analyse HPLC utilisée pour la mise en évidence du carnosol est une méthode transférée depuis la publication : « Antiproliferation effect of Rosemary (Rosmarinus officinalis) on human ovarian cancer cells in vitro » (11). Cette méthode a été développée sur un appareil Agilent 1100 monté d’une colonne Zorbax SB-C18 4,6 x 150 mm avec un diamètre de particules de 3,5 μm. Les phases mobiles utilisées sont une phase A composée d’eau acidifiée par 0,1% d’acide formique et une phase B composée d’acétonitrile auquel ont également été ajoutés 0,1% d’acide formique. Le gradient utilisé est visible Tableau 2.

Tableau 2 : Méthode d’analyse HPLC des constituants du Romarin (11) à transférer dans nos laboratoires. Temps (min) ^{% Acétonitrile}

(B) 0 10 2 10 26 24 66 100 72 100

Le chromatogramme obtenu à l’aide de cette méthode de référence lors de la séparation des constituants d’un extrait éthanolique à 70% est visible en Figure 14.

Chapitre 2 : Purification du carnosol par CPC : développement de la méthode à petite échelle | 36

Figure 14 : Chromatogramme HPLC d’un extrait éthanolique à 70% de Romarin à 210 nm (11). Gradient décrit Tableau 2. HPLC Agilent 1100, colonne Zorbax SB-C18 4,6 x 150 mm, dp = 3,5 μm. tR carnosol = 35,6 minutes. En prenant en compte le temps de délai, le temps mort et l’évolution de la composition de la phase mobile en fonction du temps (Tableau 2), il est possible de calculer la composition à l’élution des trois composés identifiés sur le chromatogramme : l’acide rosmarinique sort à une composition de 20,3 % d’acétonitrile, le carnosol à 36,5 % et l’acide carnosique à 39,6 %.

La méthode de référence comporte 4 zones : un palier isocratique initial, deux pentes de gradient, et un palier isocratique final permettant de rincer la colonne. Comme défini par les règles de transfert, il est nécessaire de calculer les constantes ^{௧೛ೌ೗೔೐ೝ}

௧_ಾ ou ^௧ಾ

௧_ಸ



Tableau 3 : Valeurs à garder constantes dans les différentes zones de la méthode initiale à transférer dans nos laboratoires.

N°

zone ^{Durée Type zone}

Rapport à garder constant

Valeur du

rapport ^Remarque

Zone 1 2 min ^Palier

isocratique

ݐ_{௣௔௟௟௜௘௥}

ݐ_ெ ^1,61

Prendre en compte le temps de délai

Zone 2 24 min Gradient ^ݐெ

ݐ_ீ ^8,04.10-2

Zone 3 40 min Gradient ^ݐெ

ݐ_ீ ^4,83.10-2

Zone 4 6 min ^Palier

isocratique ^{- -}

Rinçage de la colonne =

3 VM

Chapitre 2 : Purification du carnosol par CPC : développement de la méthode à petite échelle | 37

4.1.1.2. Transfert de la méthode de séparation du romarin sur notre appareillage

La colonne SB-Aq utilisée pour le transfert de la méthode d’analyse dans nos laboratoires possède une chimie de surface légèrement différente de la colonne SB-C18 utilisée pour la méthode initiale. Cette différence de composition peut avoir une influence sur la sélectivité des composés et donc engendrer une différence de composition de phase mobile à la sortie des composés.

Les phases mobiles utilisées sont les mêmes que celles utilisées sur la méthode initiale à la différence que l’acide formique (pKa = 3,75 à 25°C) sera remplacé par de l’acide acétique (pKa = 4,76 à 25°C) pour cause de disponibilité au moment du transfert de la méthode.

D’après la valeur des constantes calculées sur la méthode de départ (Tableau 3), les durées de chaque étape du nouveau gradient sont calculés. Le nouveau gradient est composé d’un premier palier de 0,5 minutes à 10% d’acétonitrile puis d’un premier gradient de 10 à 24% d’acétonitrile en 23 minutes, un second gradient de 24 à 100% d’acétonitrile en 38 minutes puis d’un dernier palier de 6 minutes à 100% acétonitrile (Tableau 4).

Tableau 4 : Nouveau gradient à utiliser dans nos laboratoires sur HPLC Alliance Waters, colonne Agilent technologies Zorbax SB-Aq 3x150 mm, dp = 5μm, débit = 0,4 mL/min.

Temps (min) ^{% Acétonitrile} (B) 0 10 0,5 10 23,5 24 61,5 100 67,5 100

4.1.1.3. Injection des standards

Afin de déterminer les temps de rétention et le spectre UV des composés, les standards d’acide rosmarinique, de carnosol et d’acide carnosique sont injectés en HPLC (Figure 15). Le temps de rétention de l’acide rosmarinique est de 22,8 min, 41,6 min pour le carnosol et 43,5 min pour l’acide carnosique. La composition de la phase mobile à l’élution est de 20,9 % pour l’acide rosmarinique, 51,5 % pour le carnosol et 55,3 % pour l’acide carnosique. Ces compositions à l’élution sont très différentes de celles constatées dans le cas de la méthode initiale. Ceci peut être dû à la différence de composition entre les phases stationnaires ou la possible différence de pH entre la méthode initiale et la méthode transférée à l’ISA.

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Figure 15 : Superposition des injections HPLC d’un mélange acide rosmarinique à 250 μg/mL + carnosol à 250 μg/mL (en bleu) et du standard d’acide carnosique à 170 μg/mL (en violet). F = 0,4 mL/min, Vinj = 20 μL, gradient phase mobile A = eau + 0,1% acide acétique à B = acétonitrile + 0,1%

acide acétique, détection UV à 214 nm. Spectres UV des composés réalisés de 210 à 400 nm.

4.1.1.4. Diminution de la durée de la méthode

L’observation des chromatogrammes Figure 15 montre que le dernier composé d’intérêt, l’acide carnosique sort à 43,5 minutes alors que la méthode dure plus de 67 minutes. Il y a donc possibilité d’optimiser la méthode afin de raccourcir le temps d’analyse. Pour cela, les deux premières pentes de gradient sont gardées telles quelles, à la différence que la pente entre 23,5 et 61,5 min est raccourcie pour passer rapidement à 100 % acétonitrile au moment de la sortie du dernier pic d’intérêt, l’acide carnosique dont le temps de rétention est de 43,5 min (Tableau 5). La pente de 2 %/min est donc gardée entre 23,5 min et 43,5 min avec une évolution de la proportion en acétonitrile de 24 % à 64 %. Le taux d’acétonitrile passe ensuite à 100% en 0,5 min avant la réalisation du palier de rinçage de 6 minutes. L’injection des trois standards acide rosmarinique, carnosol et acide carnosique est réalisée de la même manière que dans le § 4.1.1.3, afin de vérifier qu’il n’y a aucune modification des temps de rétention. Ces derniers étant identiques à la méthode précédente (Tableau 4) la méthode optimisée est validée. Le Tableau 6 permet de comparer les colonnes et les paramètres utilisés lors de la méthode initiale et des deux méthodes transférées à l’ISA.

Carnosol 41,6 min Acide carnosique 43,5 min Acide rosmarinique 22,8 min AU 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 nm 220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 320.00 340.00 360.00 380.00 218.6 328.7 AU 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 nm 220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 320.00 340.00 360.00 380.00 213.9 284.7 Acide rosmarinique Acide carnosique AU 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 nm 220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 320.00 340.00 360.00 380.00 212.7 284.7 378.6 Carnosol Produits de dégradation

Chapitre 2 : Purification du carnosol par CPC : développement de la méthode à petite échelle | 39

Tableau 5 : Méthode améliorée à utiliser dans nos laboratoires sur HPLC Alliance Waters, colonne Agilent technologies Zorbax SB-Aq 3x150 mm, dp = 5μm, débit = 0,4 mL/min.

Temps (min) ^{% Acétonitrile} (B) 0 10 0,5 10 23,5 24 43,5 64 44 100 50 100

Tableau 6 : Tableau de transfert : comparaison des colonnes et des paramètres utilisés. Méthode initiale (11) Méthode transférée au laboratoire ISA Méthode améliorée Colonne

Type colonne Zorbax-SB C18 Zorbax SB-Aq

Longueur colonne 150 mm 150 mm Diamètre colonne 4,6 mm 3 mm Diamètre des particules ^{3,5 μm 5 μm} Paramètres Volume mort 1,74 mL 0,74 mL

Débit 0,9 mL/min 0,4 mL/min

Temps mort 1,93 min 1,85 min

Temps de délai 1,11 min 2,5 min

Durée

tpalier1 2 min 0,5 min 0,5 min

tgradient1 24 min 23 min 23 min

tgradient2 40 min 38 min 20 min

tgradient3 - - 0,5 min

tpalier rinçage 6 min 6 min 6 min

Temps de rétention tR des

standards

Acide rosmarinique 22,7 min 22,8 min

Carnosol 35,6 min 41,6 min

Acide carnosique 37,2 min 43,5 min

Composition à l’élution (% acétonitrile) Acide rosmarinique 20,3 % 20,9 % Carnosol 36,5 % 51,5 % Acide carnosique 39,6 % 55,3 %

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Le Tableau 6 montre que le temps d’analyse a été raccourci de 4,5 minutes entre la méthode initiale et la méthode transférée au laboratoire ISA puis encore de 17,5 minutes entre les deux méthodes ISA. Les standards d’acide rosmarinique, carnosol et acide carnosique gardent les mêmes temps de rétention et composition à l’élution entre les deux méthodes ISA. On remarque une différence de composition à l’élution des 3 standards entre la méthode issue de la littérature et les deux méthodes ISA. L’explication la plus plausible semble être une différence de phase stationnaire entre les deux colonnes ou une éventuelle différence de pH entre la méthode initiale et la méthode transférée à l’ISA.

Les temps de rétention des différents standards étant connus, les extraits de romarin peuvent être injectés afin d’analyser leur composition en solutés d’intérêt.